[0037] 圖16是突變型耐高溫SOD對斑馬魚炎癥的抗炎作用表型圖（注:框定區(qū)域?yàn)檠装Y部 位中性粒細(xì)胞）；
[0038]圖17是突變型耐高溫S0D對斑馬魚炎癥的抗炎作用（中性粒細(xì)胞個數(shù)）比較圖（與 模型對照組相比，噸〈0.05，*噸〈0.01，**噸〈0.001);
[0039]圖18是突變型耐高溫S0D對斑馬魚炎癥的炎癥消退率的比較圖（與模型對照組相 Κ，*ρ〈0·05，**ρ〈0·01，***ρ〈0·001);
[0040]圖19是突變型耐高溫SOD對斑馬魚炎癥的抗炎作用表型圖（注:框定區(qū)域?yàn)檠装Y部 位中性粒細(xì)胞）；
[0041 ]圖20是突變型耐高溫S0D對斑馬魚炎癥的抗炎作用（中性粒細(xì)胞個數(shù)）比較圖（與 模型對照組相比，**ρ〈〇·〇1，***ρ〈〇·〇〇1);
[0042] 圖21是突變型耐高溫S 0 D對斑馬魚炎癥的炎癥消退率比較圖（與模型對照組相 比，**ρ〈0·01，***ρ〈0·001);
[0043] 圖22是施用本發(fā)明突變型耐高溫SOD對治療皮炎性濕疹效果對比圖；
[0044] 圖23是施用本發(fā)明突變型耐高溫S0D對治療足癬的效果對比圖；
[0045]圖24是施用本發(fā)明突變型耐高溫S0D對治療過敏性皮炎的效果對比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0046]實(shí)施例1本發(fā)明突變型耐高溫超氧化物歧化酶的制備 [0047] 1.高產(chǎn)突變型耐高溫S0D菌株的獲得
[0048]以嗜熱菌HB27 (購自美國ATCC細(xì)胞庫）中編碼S0D的基因?yàn)槟０?，以如下引物序?進(jìn)行擴(kuò)增得到目的基因：正向引物：5'-AAGAATTCATGCCGTACCCGTTCAAGCT-3'（SEQIDN0.1) 反向引物：5 ' -CTGTCGACTCAGGCTTTGTTGAAGAAC-3 '（ SEQ ID N0.2);用回收試劑盒（購自生工 生物工程上海(股份)有限公司）回收擴(kuò)增產(chǎn)物，用酶(EcoRI和Sal I)雙酶切，并連接到用同 樣酶雙酶切的質(zhì)粒載體pET28a( + )(購自生工生物工程上海(股份)有限公司）中，將重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)(購自生工生物工程上海(股份)有限公司），經(jīng)篩選，并 測序鑒定，獲得高產(chǎn)突變型耐高溫SOD(以下簡稱Μ型-SOD)的菌株，Μ型-SOD編碼基因的具體 核苷酸測序序列為：
[0049] 1ATGCCGTACCCGTTCAAGCTTCCTGACCTAGGCTACCCCTACGAGGCCCTCGAGCCCCAC
[0050] 61ATTGACGCCAAGACCATGGAGATCCACCACCAGAAGCACCACGGGGCCTACGTGACGAAC
[0051 ] 121CTCAACGCCGCCCTGGAGAAGTACCCCTACCTCCACGGGGTGGAGGTGGAGGTCCTCCTG
[0052] 181AGGCACCTCGCCGCCCTTCCCCAGGACATCCAGACCGCCGTGCGCAACAACGGGGGCGGG
[0053] 241CACCTGAACCACAGCCTCTTCTGGAGGCTCCTCACCCCCGGGGGGGCCAAGGAGCCCGTG
[0054] 301GGGGAGCTGAAGAAGGCCATTGACGAGCAGTTCGGGGGCTTCCAGGCCCTCAAGGAGAAG
[0055] 361CTCACCCAGGCGGCCATGGGCCGGTTCGGCTCGGGCTGGGCCTGGCTCGTGAAGGACCCC
[0056] 421TTCGGCAAGCTCCACGTCCTCTCCACCCCCAACCAAGACAACCCCGTGATGGAGGGCTTC
[0057] 481ACCCCCATCGTGGGCATTGACGTCTGGGAGCACGCCTACTACCTCAAGTACCAGAACCGC
[0058] 541CGGGCCGATTACCTCCAGGCCATCTGGAACGTCCTCAACTGGGACGTGGCCGAGGAGTTC
[0059] 601TTCAATAAAGCCTGA(SEQ ID N0.3)〇
[0060] 2 ·Μ型-SOD蛋白的表達(dá)和純化
[0061] 發(fā)酵過程經(jīng)過一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)、上罐發(fā)酵、誘導(dǎo)表達(dá)四個步驟，最終 獲得發(fā)酵產(chǎn)物Μ型-S0D。具體過程如下：
[0062] 發(fā)酵罐基本LB培養(yǎng)基成份配置，補(bǔ)料成份按下表所示：
[0063]
[0064]
[0065] (2)一級種子培養(yǎng):20ml LB液體培養(yǎng)；
[0066] (3)培養(yǎng)基中接種甘油菌5μ1，卡那霉素終濃度50mg/L，37°C，220rpm，培養(yǎng)10h;
[0067] (3)二級種子培養(yǎng):將上一步培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移至200ml LB液體培養(yǎng)基，卡那霉素 終濃度50mg/L，37 °C，220rpm，培養(yǎng)4h;
[0068] (4)上罐發(fā)酵：將上一步培養(yǎng)的200ml二級種子菌液接種到容積為6.6L的發(fā)酵罐 中。發(fā)酵條件為：溶氧30%、溫度30°C、pH7.0、轉(zhuǎn)速在200rpm到800rpm之間根據(jù)溶氧自動調(diào) T ；
[0069] (5)發(fā)酵進(jìn)行5-6小時，0D600約為28時加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為ImM。發(fā)酵進(jìn) 行24h后停止發(fā)酵，離心收集菌體。
[0070] (6)將離心后的菌體，溶于Buffer A( 10mMTris-HCl，pH8 · 0)后，菌體在300W超聲波 下超聲破碎，超聲總時間45min;
[0071] (7)9(TC 加熱lh;
[0072] (8)待冷卻至室溫后12000g，4°C，離心30min;
[0073] (9)收集上清，加50 %硫酸銨使酶沉淀；
[0074] (1〇)4Γ 靜置 120min 后，12000g，4°C，離心 30min;
[0075] (11)溶解沉淀后透析過夜；
[0076] (12)透析之后的產(chǎn)物分裝干燥、制成成品。
[0077]純化后的Μ型-S0D(純度可達(dá)98%)，其氨基酸序列為：
[0078] 1MPYPFKLPDLGYPYEALEPHIDAKTMEIHHQKHHGAYVTNLNAALEKYPYLHGVEVEVLL
[0079] 61RHLAALPQDIQTAVRNNGGGHLNHSLFWRLLTPGGAKEPVGELKKAIDEQFGGFQALKEK
[0080] 121LTQAAMGRFGSGWAWLVKDPFGKLHVLSTPNQDNPVMEGFTPIVGIDVWEHAYYLKYQNR
[0081] 181RADYLQAIWNVLNWDVAEEFFNKA(SEQ ID NO.4)
[0082] Μ型-SOD與GenBank中公開的耐高溫S0D(GenBank:BAA25701 · 1，野生型耐高溫SOD， 以下簡稱W型-SOD)的氨基酸序列的區(qū)別在于本發(fā)明提供的Μ型-SOD的第202位氨基酸由W 型-S0D對應(yīng)位置的賴氨酸(Lys或K)突變?yōu)樘於０?Asn或N)。
[0083]實(shí)施例2本發(fā)明突變型耐高溫超氧化物歧化酶的理化性質(zhì)分析
[0084] 1.耐熱性比較
[0085] 我們比較了W型-S0D( Jianguo Liu等，Extremophiles，2011:15:221226，下同）、本 發(fā)明提供的Μ型-S0D以及普通S0D(Sigma，MFCD00132404)的熱穩(wěn)定性(按照J(rèn)ianguoLiu等， Extremophiles ,2011:15:221226中所述的完全相同條件，在不同溫度下處理1小時，測其剩 余酶活），結(jié)果如圖1所示。從中可以看出，本發(fā)明提供的Μ型-S0D在更加廣泛的溫度范圍內(nèi) 維持極高的穩(wěn)定性。
[0086] 2. pH耐受性比較：
[0087] 我們將W型-S0D、M型-S0D以及普通S0D(Sigma，MFCD00132404)在不同pH值下的穩(wěn) 定性進(jìn)行對比（按照J(rèn)ianguo Liu等，Extremophiles,2011:15:221226中所述的完全相同條 件），結(jié)果如圖2所示。從中可以看出，Μ型-S0D在pH為12時仍有97 %的活力，而W型-S0D在pH 為11時僅存不足40 %的活力，可見Μ型-SOD有極為突出的酸堿耐受性。
[0088] 3.胃蛋白酶耐受實(shí)驗(yàn)：
[0089]模擬人工胃液的配置：按照2010版藥典的標(biāo)準(zhǔn)，即：取稀鹽酸（稀鹽酸：取鹽酸 234ml，加水稀釋至1000ml，即得。本液含HC1應(yīng)為9.5 %~10.5 %。）16.4ml，加水約800ml與 胃蛋白酶（國藥，20141209)10g，搖勻后，加水稱釋成1000ml即得。
[0090] S0D也是一種蛋白質(zhì)，易被消化道中的蛋白酶降解而失去活性，我們將Μ型-S0D和 普通S0D兩種酶在上述模擬人工胃液中處理兩個小時發(fā)現(xiàn)，Μ型-S0D對胃蛋白酶的抗降解能 力明顯優(yōu)于普通S0D，具體見圖3。
[0091] 4.胰蛋白酶耐受實(shí)驗(yàn)：
[0092] 將Μ型-S0D和普通S0D在10U/ml~300U/ml的胰蛋白酶溶液(上海瑞永生物科技公 司，RM1021-100g)中，37°C溫育3小時后發(fā)現(xiàn)活力無損失，而普通S0D活力損失近60%，這說 明Μ型-S0D還具有極強(qiáng)的抗胰蛋白酶降解的能力，具體見圖4。
[0093]上述S0D酶活力的測定方法采用鄰苯三酚自氧化法。
[0094] 綜上所述，該突變型S0D(M型-S0D)在耐受高溫、酸堿變化和消化道蛋白酶降解方 面有突出的表現(xiàn)，因而有望應(yīng)用于口服及外用藥品、食品與化妝品，而取得良好的治療、美 容和保健效果。
[0095]實(shí)施例3本發(fā)明突變型耐高溫超氧化物歧化酶(Μ型-SOD)的抗粘膜炎癥研究 [0096] 實(shí)驗(yàn)動物
[0097]斑馬魚模型因具備以下主要條件廣泛用于疾病研究和藥物篩選：（1)可以提供大 量的樣本供高通量藥物篩選；（2)在免疫學(xué)基因組學(xué)等方面與人類存在高度的保守性；（3) 具有良好的示蹤性；（4)能夠明確清楚地表達(dá)炎癥的最重要的共性病理特征。斑馬魚模型是 國際公認(rèn)的最重要的藥物篩選的模式動物之一。斑馬魚身體透明，具有很強(qiáng)的成像特點(diǎn)使 研究人員在基因操作時更加容易，從而使得這種動物成為研究針對各種炎癥反應(yīng)的理想模 型。斑馬魚的消化系統(tǒng)與哺乳動物極為相似，同樣包含了一個肝臟、胰腺、膽囊以及一個具 有吸收和分泌功能的線性分段的腸道。腸上皮在腸道的全程中都發(fā)揮著作用且它還包含了 許多同樣也能在哺乳動物身上找到的上皮細(xì)胞，包括:吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞等。 因此，近年來斑馬魚已成為各種炎癥研究，包括粘膜炎癥特別是消化道粘膜炎癥的典型動 物模型，其中最具代表性的是炎癥性腸病(IBD)的斑馬魚動物模型。
[0098]實(shí)驗(yàn)動物選擇野生型AB系斑馬魚(杭州環(huán)特生物科技有限公司提供），以自然成對 交配繁殖方式進(jìn)行。共630尾，每實(shí)驗(yàn)組為30尾，年齡為受精后3天，用于Μ型-S0D對結(jié)腸炎的 治療作用評價(jià)和腸道組織病理學(xué)分析;轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚(杭州環(huán)特生物科技 有限公司提供），以自然成對交配繁殖方式進(jìn)行，共210尾，每實(shí)驗(yàn)組為30尾，年齡為受精后3 天，用于Μ型-S0D對結(jié)腸炎炎癥消退的影響評價(jià)。飼養(yǎng)于28°C的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì):每1L反滲 透水中加入200mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480~510yS/cm;pH為6.9~7.2 ;硬度為53.7~