一種評(píng)價(jià)昆蟲(chóng)中腸消化酶對(duì)Bt蛋白活化作用的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種評(píng)價(jià)昆蟲(chóng)中腸消化酶對(duì)Bt蛋白活化作用的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)屬革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，能產(chǎn)生多種類型的伴孢晶體蛋白，即δ-內(nèi)毒素或稱為殺蟲(chóng)晶體蛋白(insecticidal crystal protein,ICP s)，對(duì)鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲(chóng)，以及線蟲(chóng)、螨類和原生動(dòng)物等具有特異性的殺蟲(chóng)活性。
[0003]經(jīng)典的Bt原毒素的作用機(jī)制如下:晶體蛋白在昆蟲(chóng)中腸內(nèi)溶解，在中腸蛋白酶的作用下前毒素水解為有活性的毒素，有活性的毒素與中腸的特異性受體結(jié)合后、亞基寡聚化、形成孔洞結(jié)構(gòu)，并插入到中腸頂膜上，這些孔洞允許離子和水分自由出入細(xì)胞，造成離子通道或孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹和裂解，最終昆蟲(chóng)死亡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種評(píng)價(jià)昆蟲(chóng)中腸消化酶對(duì)Bt蛋白活化作用的方法。
[0005]Bt毒素的活化在Bt作用模型中是非常關(guān)鍵的一步，該步驟不僅關(guān)系到Bt對(duì)昆蟲(chóng)的毒殺效果，同時(shí)也可能參與抗性的形成。以往的研究?jī)H僅是通過(guò)比較昆蟲(chóng)取食前后或產(chǎn)生抗性前后中腸酶活力的變化來(lái)分析蛋白酶的作用，目前為止尚未建立一套直觀的評(píng)價(jià)各種蛋白酶對(duì)Bt蛋白活化作用的方法，有鑒于此，本發(fā)明提供一種評(píng)價(jià)昆蟲(chóng)中腸消化酶對(duì)Bt蛋白活化作用的方法，其是將特異性消化酶抑制劑與昆蟲(chóng)中腸消化酶液按比例混合，在體外對(duì)Bt蛋白原毒素進(jìn)行活化，然后通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)活化效果進(jìn)行分析，用軟件ImageJ 1.46對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最后通過(guò)方差分析來(lái)評(píng)價(jià)中腸消化酶參與的Bt蛋白活化作用。
[0006]本發(fā)明所述昆蟲(chóng)包括鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目昆蟲(chóng)，以及線蟲(chóng)、螨類和原生動(dòng)物等。優(yōu)選地，所述昆蟲(chóng)為棉鈴蟲(chóng)。
[0007]本發(fā)明所述特異性消化酶抑制劑對(duì)應(yīng)于昆蟲(chóng)中腸消化酶中一種特定的蛋白酶，例如所述特異性消化酶抑制劑包括類胰蛋白酶的抑制劑N - t ο s y 1- L -lysinechloromethylketone(TLCK)等。
[0008]具體地，本發(fā)明的一種評(píng)價(jià)昆蟲(chóng)中腸消化酶對(duì)Bt蛋白活化作用的方法，包括以下步驟:
[0009]I)配制一定濃度的昆蟲(chóng)中腸消化酶液；
[0010]2)將一定濃度的特異性消化酶抑制劑溶液與步驟I)的昆蟲(chóng)中腸消化酶液按不同比例混合，再與一定濃度的Bt蛋白原毒素溶液混合孵育一段時(shí)間，用蛋白上樣緩沖液終止反應(yīng)，在沸水中煮5-10min后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色；
[0011 ] 3)根據(jù)染色結(jié)果，用軟件ImageJ 1.46對(duì)Bt蛋白原毒素的活化效果進(jìn)行定量分析，最后用軟件SPSS 18.0進(jìn)行方差分析來(lái)評(píng)價(jià)中腸消化酶參與的Bt蛋白活化作用。
[00?2] 其中，步驟I)中配制的昆蟲(chóng)中腸消化酶液，用Bradf ord法定量到蛋白濃度lmg/mL。
[0013]步驟2)中將lmg/mL的特異性消化酶抑制劑溶液與步驟I)的昆蟲(chóng)中腸消化酶液分別按10:1和1:1的體積比混合，所得混合液與lmg/mL的Bt蛋白原毒素溶液按1:100的體積比混合，37 0C孵育5min-2h;然后用5 X蛋白上樣緩沖液終止反應(yīng)，在沸水中煮6min。
[0014]優(yōu)選地，步驟2)中用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。
[0015]步驟2)中同時(shí)設(shè)立不含有所述特異性消化酶抑制劑的昆蟲(chóng)中腸消化酶液為空白對(duì)照，即將不含有所述特異性消化酶抑制劑的昆蟲(chóng)與Bt蛋白原毒素混合孵育。
[0016]本發(fā)明方法可操作性強(qiáng)，準(zhǔn)確高效，可用于評(píng)價(jià)哪些不同的消化酶參與了不同類Bt蛋白的活化，同時(shí)還可以分析不同消化酶在活化Bt蛋白中的主次作用，對(duì)于選擇合理的Bt組合殺蟲(chóng)劑或轉(zhuǎn)疊加基因作物具有借鑒作用。此外，該方法可應(yīng)用于對(duì)Bt生化水平抗性的評(píng)價(jià)工作。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中類胰蛋白酶活化CrylAc原毒素及對(duì)應(yīng)的活化效率;A:泳道I，蛋白marker ；泳道2，CryIAc原毒素;泳道3，類胰蛋白酶活化CryIAc毒素;泳道4，10:1的類胰蛋白酶和TLCK混合液活化CrylAc毒素；泳道5，1:1的類胰蛋白酶和TLCK混合液活化CrylAc毒素;泳道3?泳道5 ,CrylAc毒素被活化了 30分鐘;泳道6，類胰蛋白酶活化Cry IAc毒素(空白對(duì)照)，泳道7,10:1的類胰蛋白酶和TLCK混合液活化Cry I Ac毒素;泳道8,1:1的類胰蛋白酶和TLCK混合液活化Cry IAc毒素;泳道6?泳道8 ,Cry IAc毒素被活化了 2小時(shí)。B:橫坐標(biāo)3?8分別對(duì)應(yīng)A中泳道3?泳道8各泳道的活化效率。每個(gè)時(shí)間段不同消化處理的消化效率分別與空白對(duì)照組原毒素進(jìn)行顯著性分析。*: P〈0.05，Independent t-tests , SPSSvers1n 18.0software for Windows0
[0018]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中棉鈴蟲(chóng)中腸消化酶液活化CrylAc原毒素及對(duì)應(yīng)的活化效率;A:泳道I，蛋白marker ；泳道2，CryIAc原毒素;泳道3，中腸消化酶液活化Cry IAc毒素;泳道4，10:1的中腸消化酶和TLCK混合液活化Cry IAc毒素;泳道5，1:1的中腸消化酶和TLCK混合液活化CryIAc毒素;泳道3?泳道5，CryIAc毒素被活化了30分鐘;泳道6，中腸消化酶液活化CrylAc毒素(空白對(duì)照)，泳道7,10:1的中腸消化酶和TLCK混合液活化CrylAc毒素;泳道8,1:1的中腸消化酶和TLCK混合液活化CrylAc毒素;泳道6?泳道8，CrylAc毒素被活化了2小時(shí)。B:橫坐標(biāo)3?8分別對(duì)應(yīng)A中泳道3?泳道8各泳道的活化效率。每個(gè)時(shí)間段不同消化處理的消化效率分別與空白對(duì)照組原毒素進(jìn)行顯著性分析。*:P〈0.05 ,Independent t-tests,SPSS vers1n 18.0software for Windows0
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[°02°]實(shí)施例1評(píng)價(jià)棉鈴蟲(chóng)中腸消化酶對(duì)Bt蛋白(CrylAc)活化作用的方法
[0021]1、準(zhǔn)備10頭5齡棉鈴蟲(chóng)(3次生物學(xué)重復(fù))，剖開(kāi)表皮，取中腸，加入適量的0.15M
NaCl溶液，用玻璃研磨器充分勻漿，然后4°C，1000g離心15min，取上清獲得棉鈴蟲(chóng)中腸消化酶液(含有類胰蛋白酶)，利用Bradf ord法定量到蛋白濃度lmg/mL。
[0022 ] 2、準(zhǔn)備類胰蛋白酶的抑制劑TLCK以及對(duì)照商品化的類胰蛋白酶，用DMSO將抑制劑TLCK配制成lmg/mL溶液，將抑制劑溶液和中腸消化酶液分別按10:1和1:1的體積比混合，作為實(shí)驗(yàn)組