，并設(shè)立不含有TLCK的棉鈴蟲中腸消化酶液為空白對照。同時以商品化的類胰蛋白酶為對照組，即配制濃度為lmg/mL的類胰蛋白酶溶液，將抑制劑溶液和類胰蛋白酶溶液分別按10:1和1:1的體積比混合，相應(yīng)地，設(shè)立不含有TLCK的lmg/mL的類胰蛋白酶溶液為空白對照。
[0023]3、用ρΗΙΟ.0的Na⑶3緩沖液將Cry IAc配制成lmg/mL的溶液，實驗組是將準(zhǔn)備好的抑制劑和中腸消化酶液的混合液與CrylAc原毒素溶液按1:100的體積比混合，37°C分別孵育30分鐘和2小時;然后用5 X蛋白上樣緩沖液終止反應(yīng)，在沸水中煮6min。空白對照做相同處理。
[0024]對照組是將準(zhǔn)備好的抑制劑和類胰蛋白酶溶液的混合液與CryIAc原毒素溶液按I: 100的體積比混合，37°C分別孵育30分鐘和2小時;然后用5 X蛋白上樣緩沖液終止反應(yīng)，在沸水中煮6min?？瞻讓φ兆鱿嗤幚怼?br>[0025]4、將步驟3中準(zhǔn)備好的實驗組及對照組樣品分別加至8%的聚丙烯酰胺凝膠上進行SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)進行染色。
[0026]5、染色后，對膠圖進行拍照，根據(jù)對應(yīng)條帶的大小深淺，利用Image J software(ΝΙΗ,νΙ.46)對CrylAc的活化效果進行定量，用消化后的CrylAc原毒素的量(實驗組)除以同一塊膠上對照組CrylAc原毒素的量，即為活化效率。
[0027]6、最后通過方差分析(SPSS vers1n 18.0software for Windows)來評價中腸消化酶(特別是類胰蛋白酶)參與的Cry I Ac活化作用。
[0028]對照組中類胰蛋白酶活化CrylAc原毒素及對應(yīng)的活化效率見圖1，圖1結(jié)果顯示，30分鐘和2小時后CrylAc原毒素都能被商品化的類胰蛋白酶完全消化(泳道3和泳道6)。10:1的類胰蛋白酶和TLCK混合液在30分鐘(P〈0.0001)和2小時(P〈0.0001)時都顯著地抑制了類胰蛋白酶對CrylAc原毒素的消化。其活化的效率分別是12.06%和13.04% (泳道4和泳道7)。1:1的類胰蛋白酶和TLCK混合液在30分鐘(P〈0.0001)和2小時(P〈0.0001)時都顯著的抑制了類胰蛋白酶對CrylAc原毒素的活化。其活化的效率分別是7.92%和11.40% (泳道5和泳道8) ^LCK能夠有效的抑制類胰蛋白酶對CrylAc原毒素的活化，并有效的說明了該酶參與CrylAc原毒素活化的過程。
[0029]實驗組棉鈴蟲中腸消化酶液活化CrylAc原毒素及對應(yīng)的活化效率見圖2。圖2結(jié)果顯示，在30分鐘時CrylAc原毒素被棉鈴蟲中腸消化酶液消化了87.34%，2小時CrylAc原毒素能被中腸消化酶液完全消化(泳道3和泳道6)。3 O分鐘時，1:1 (P = 0.0 3 7)和1:1 (P =
0.02)的中腸消化酶和TLCK混合液能顯著的抑制中腸消化酶對CrylAc原毒素的活化。其活化的效率分別是67.87%和57.36% (泳道4和泳道5)。在2小時時，10:1和1:1的中腸消化酶和TLCK混合液對CryIAc原毒素活化的效率分別是92.66 %和86.67 %。結(jié)果表明TLCK能夠有效的抑制棉鈴蟲中腸消化酶液對CrylAc原毒素的活化，說明了該中腸消化酶液中的類胰蛋白酶參與CrylAc原毒素活化的過程。但2小時以后，10:1和1:1的中腸消化酶和TLCK混合液對CrylAc原毒素的活化能力與中腸消化酶液沒有顯著差異(P = 0.082和P = 0.097)，該結(jié)果表明在中腸消化酶液中除了類胰蛋白酶參與活化過程外，同時還有其他消化酶參與了Cry I Ac活化作用。
[0030]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1.一種評價昆蟲中腸消化酶對Bt蛋白活化作用的方法，其特征在于，將特異性消化酶抑制劑與昆蟲中腸消化酶液按比例混合，在體外對Bt蛋白原毒素進行活化，然后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對活化效果進行分析，用軟件ImageJ 1.46對結(jié)果進行統(tǒng)計，最后通過方差分析來評價中腸消化酶參與的Bt蛋白活化作用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述昆蟲包括鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目昆蟲，以及線蟲、螨類。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述昆蟲為棉鈴蟲。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述特異性消化酶抑制劑對應(yīng)于昆蟲中腸消化酶中一種特定的蛋白酶。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述特異性消化酶抑制劑包括TLCK。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)配制一定濃度的昆蟲中腸消化酶液； 2)將一定濃度的特異性消化酶抑制劑溶液與步驟I)的昆蟲中腸消化酶液按不同比例混合，再與一定濃度的Bt蛋白原毒素溶液混合孵育一段時間，用蛋白上樣緩沖液終止反應(yīng)，在沸水中煮5-10min后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色； 3)根據(jù)染色結(jié)果，用軟件ImageJ1.46對Bt蛋白原毒素的活化效果進行定量分析，最后用軟件SPSS 18.0進行方差分析來評價中腸消化酶參與的Bt蛋白活化作用。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟I)中配制的昆蟲中腸消化酶液，用Bradf ord法定量到蛋白濃度lmg/ mL。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中將lmg/mL的特異性消化酶抑制劑溶液與步驟I)的昆蟲中腸消化酶液分別按10:1和1:1的體積比混合，所得混合液與lmg/mL的Bt蛋白原毒素溶液按1:100的體積比混合，37°C孵育5min-2h;然后用5X蛋白上樣緩沖液終止反應(yīng)，在沸水中煮6min。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中同時設(shè)立不含有所述特異性消化酶抑制劑的昆蟲中腸消化酶液為空白對照，即將不含有所述特異性消化酶抑制劑的昆蟲中腸消化酶液與Bt蛋白原毒素混合孵育。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種評價昆蟲中腸消化酶對Bt蛋白活化作用的方法，其是將特異性消化酶抑制劑與昆蟲中腸消化酶液按比例混合，在體外對Bt蛋白原毒素進行活化，然后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對活化效果進行分析，用軟件ImageJ？1.46對結(jié)果進行統(tǒng)計，最后通過方差分析來評價中腸消化酶參與的Bt蛋白活化作用。本方法可操作性強，準(zhǔn)確高效，可用于評價哪些不同的消化酶參與了不同類Bt蛋白的活化，同時還可以分析不同消化酶在活化Bt蛋白中的主次作用，對于選擇合理的Bt組合殺蟲劑或轉(zhuǎn)疊加基因作物具有借鑒作用。此外，該方法可應(yīng)用于對Bt生化水平抗性的評價工作。
【IPC分類】C12Q1/37
【公開號】CN105624267
【申請?zhí)枴緾N201610089908
【發(fā)明人】魏紀(jì)珍, 梁革梅, 王冰潔, 陳琳, 張萬娜
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年2月17日