Dc誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及組織工程領(lǐng)域，特別設(shè)及一種DC誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的全新的抗腫瘤治療方法，彌補(bǔ)了傳 統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療的弊端，已經(jīng)被公認(rèn)為二十一世紀(jì)腫瘤綜合治療模式中最活躍、最有 發(fā)展前途的一種治療手段，也是世界目前唯一有希望完全消滅腫瘤細(xì)胞的治療手段。
[0003] 細(xì)胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細(xì)胞，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)，使其數(shù)量成千倍增 多，祀向性殺傷功能增強(qiáng)，然后再回輸?shù)饺梭w來(lái)殺滅血液及組織中的病原體、癌細(xì)胞、突變 的細(xì)胞，打破免疫耐受，激活和增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效。目前在 臨床中使用最多的細(xì)胞免疫治療療法主要是DC治療、CIK治療和DC-CIK聯(lián)合免疫治療。 [0004] DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)。 近年來(lái)，W樹(shù)突狀細(xì)胞(demlritic cell, DC)為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療及DC疫苗已取得較大 進(jìn)展，體外制備的DC疫苗顯示出明顯誘發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力，具有良好的臨床應(yīng)用前 景。目前，從外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)經(jīng)GM-CSF、比-4體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DC的方法已基本得到公 認(rèn)，但DC體外促成熟的方案尚沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)主要采用TNF-a因子，但該方法活化的 DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12,致使培養(yǎng)得到的DC功能缺陷，很大程度上限制了 DC疫苗的臨床應(yīng)用工作的開(kāi)展。因此，有必要對(duì)現(xiàn)有DC細(xì)胞培養(yǎng)方案進(jìn)行進(jìn)一步完善，W有 效提高DC疫苗在誘導(dǎo)抗炎或抗腫瘤免疫應(yīng)答中的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)出的樹(shù)突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟 率低，細(xì)胞增殖率低，且抗原提呈性能差等缺陷，提供一種能夠提高樹(shù)突狀細(xì)胞成熟率及抗 原提呈性能的DC誘導(dǎo)劑及其在誘導(dǎo)DC成熟過(guò)程中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：提供一種DC誘導(dǎo)劑，包括:rhGM- CSF、GM-CSF、比-4、rh 比-4和比-13。
[0007] 在本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑中，所述riiGM-CSF的終濃度為800~1200U/ml、GM-CSF的 終濃度為5~15ng/mL、化-4的終濃度為5~15ng/mL、rhIk4的終濃度為800~1200U/m巧口 比-13的終濃度為5~15ng/mL。
[000引在本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑中，所述riiGM-CSF的濃度為1000U/ml、GM-CSF的濃度為 lOng/mL、比-4的濃度為10ng/mL、rha-4的濃度為lOOOU/m巧日比-13的濃度為lOng/mL。 [0009] 在本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑中，所述rhGM-CSF的濃度為800U/ml、GM-CSF的濃度為 5ng/mL、比-4的濃度為5ng/mL、rhIk4的濃度為800U/ml和比-13的濃度為5ng/mL。
[0010] 在本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑中，所述rhGM-CSF的濃度為1200U/ml、GM-CSF的濃度為 15ng/mL、比-4的濃度為15ng/mL、rhIk4的濃度為1200U/m巧日比-13的濃度為5ng/mL。
[0011]本發(fā)明進(jìn)一步提供上述的DC誘導(dǎo)劑在誘導(dǎo)DC成熟過(guò)程中的應(yīng)用。
[0012] 實(shí)施本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑，可W達(dá)到W下有益效果：與現(xiàn)有樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)劑 相比，本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑，能夠促進(jìn)提高樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞活性，提高樹(shù)突狀細(xì)胞的增 值率及成熟率，進(jìn)而提高樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原提呈性。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明提供的 DC 誘導(dǎo)劑，包括：1'1161-〔5。（1?6。〇11113；[]1日]11:11111]1日]1旨扣]1111〇。八6- macrophage colony-stimulating factor，重組人粒-巨細(xì)胞集落刺激因子）、GM-CSF (Granuloc}fte-mac;rophage colony-stimulating factor，粒-巨細(xì)胞集落刺激因子）、IL-4 (Interleukin 4,白細(xì)胞介素4)、rhIL-4(Recombinant human interleukin 4,重組人白細(xì) 胞介素4)和IL-13(Interleukin 13,白細(xì)胞介素13)。
[0014] 其中，rhGM-CSF的終濃度為800~1200U/ml、GM-CSF的終濃度為5~15ng/mL、化-4 的終濃度為5~15ng/mL、rhIk4的終濃度為800~1200U/ml和化-13的終濃度為5~15ng/ rnL ο
[0015] 優(yōu)選地，rhGM-CSF的濃度為1000U/ml、GM-CSF的濃度為lOng/mL、化-4的濃度為 10ng/mL、rha-4的濃度為lOOOU/m巧日比-13的濃度為lOng/mL。
[0016] 本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑能夠誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為未成熟的樹(shù) 突狀細(xì)胞，增大細(xì)胞體積，并促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和分化，促進(jìn)細(xì)胞形成集落;同時(shí)，對(duì)已分 化的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行預(yù)刺激，促使未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞能夠快速成熟。
[0017] 本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑，應(yīng)用于誘導(dǎo)DC成熟的方法，包括W下步驟：
[0018] S1、獲取樹(shù)突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞；
[0019] S2、采用第一誘導(dǎo)劑將樹(shù)突狀前體細(xì)胞當(dāng)個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化成未成熟樹(shù)突狀細(xì) 胞;其中，第一誘導(dǎo)劑為本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑；
[0020] S3、采用第二誘導(dǎo)劑將未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)分化成成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。
[0021 ]具體地，步驟S1中，優(yōu)選地，樹(shù)突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源于新鮮外周血，相比 經(jīng)過(guò)冷庫(kù)儲(chǔ)存或者培養(yǎng)傳代之后的樹(shù)突狀細(xì)胞，從新鮮血液中制備的樹(shù)突狀細(xì)胞前體單個(gè) 核細(xì)胞離體時(shí)間較短，其細(xì)胞活性和狀態(tài)的減弱或者形態(tài)改變程度都較少，更加利于保持 其免疫性能。在本發(fā)明中，樹(shù)突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞的具體獲取過(guò)程為：
[0022] 抽取外周靜脈血，稀釋，添加淋己細(xì)胞分離液離屯、10~20分鐘后，分離獲取外周血 單個(gè)核細(xì)胞；
[0023] 用含有10%~15%的胎牛血清、50~150U/ml青霉素和50~150U/ml鏈霉素的完全 培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞濃度至(2~6) X106個(gè)/ml,解育1~3小時(shí)，更換新的完全培養(yǎng)基，收集細(xì)胞 懸液，即為樹(shù)突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞懸液。
[0024] 步驟S2的具體過(guò)程為：
[0025] 取步驟S1獲得的樹(shù)突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞懸液，離屯、洗涂后計(jì)數(shù)，使細(xì)胞濃度 達(dá)到（1~3) X106個(gè)/ml,用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，并與培養(yǎng)當(dāng)天添加第一誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)4~7天， 每隔2~3天更換培養(yǎng)基。
[0026] 其中，第一誘導(dǎo)劑包括riiGM-CSF、GM-CSF、比-4、rhlk4和IL-13;其中，riiGM-CSF的 終濃度為800~1200U/ml、GM-CSF的終濃度為5~15ng/mL、化-4的終濃度為5~15ng/mL、 rha-4的終濃度為800~1200U/ml和比-13的終濃度為比-13的濃度為5~15ng/mL。
[0027] 步驟S3的具體過(guò)程為：
[002引向步驟S2a獲得的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞中添加第二誘導(dǎo)劑培養(yǎng)2~4天至未成熟的樹(shù) 突狀細(xì)胞全部成熟；其中，第二誘導(dǎo)劑包括rhTNF-a(Recombinant human tumor necrosis factor-α，重組人腫瘤壞死因子α)、沒(méi)食子酸或核桃青皮提取物;且rhTNF-α的終濃度為800 ~1200U/ml、沒(méi)食子酸的終濃度為5~15μg/ml或核桃青皮提取物的終濃度為核桃青皮提取 物的濃度為10~30μg/ml。
[0029] 其中，rhTNF-a能夠刺激樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，W提高樹(shù)突狀細(xì)胞抗原提呈能力。而核 桃青皮提取物的主要成份包括沒(méi)食子酸、甲醇、石油酸、氯仿、正下醇等，對(duì)金黃色葡萄球菌 等細(xì)菌具有強(qiáng)抗菌作用，并且對(duì)真菌也有明顯抑制作用；另外，還能夠清除自由基，具有較 強(qiáng)的抗氧化活性，W提高樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞活性，促進(jìn)其成熟和正常的生長(zhǎng)增殖。
[0030] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限 定本發(fā)明。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] 本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑在誘導(dǎo)DC成熟的方法中的應(yīng)用，包括W下步驟：
[0033] Sla、獲取樹(shù)突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞；
[0034] 抽取外周靜脈血3-5ml，生理鹽水1:1稀釋，然后沿管壁緩緩加入到3~5m