l比重為 1.077 ±0 .OOlg/ml的FicoU-Hypaque淋己細(xì)胞分離液上，ISOOr/min離屯、15分鐘，分離獲取 外周血單個核細(xì)胞，用含10 %胎牛血清、lOOU/mL青霉素、lOOU/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基 (購自Gibco公司）懸浮細(xì)胞濃度為4Xl〇Vml，移至六孔板中，2ml/孔，將六孔板放于37°C、 5 % C〇2培養(yǎng)箱中解育2小時，去掉培養(yǎng)基及懸浮的細(xì)胞，在每孔中放入新鮮的RPMI 1640培養(yǎng) 基，輕輕吹打，吹起壁上細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，即樹突狀細(xì)胞前體單個核細(xì)胞。
[0035] S2a、將樹突狀細(xì)胞前體單個核細(xì)胞誘導(dǎo)分化成未成熟樹突狀細(xì)胞；
[0036] 將步驟Sla中獲得的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離屯、管中，離屯、洗涂，計(jì)數(shù)細(xì)胞，使細(xì)胞 濃度達(dá)到2Xl06/ml，然后用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清RPMI1640)培養(yǎng)，并于培養(yǎng)當(dāng)天加 入第一誘導(dǎo)劑，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天，每隔3天更換新的培養(yǎng)基，并補(bǔ)充第一誘導(dǎo)劑，即可 收獲未成熟樹突狀細(xì)胞；
[0037] 其中，第一誘導(dǎo)劑中包括：1000U/ml的riiGM-CSF、10ng/血的GM-CSF、10ng/mL的比- 4，1000U/ml 的rha-4 和 lOng/mL的比-13。
[0038] S3a、誘導(dǎo)未成熟樹突狀細(xì)胞成熟；
[0039] 在樹突狀細(xì)胞前體單個核細(xì)胞培養(yǎng)的第6天，加入第二誘導(dǎo)劑培養(yǎng)3天至樹突狀細(xì) 胞成熟；
[0040] 其中，第二誘導(dǎo)劑中包括：lOOOU/ml的rhTNF-a、1化g/ml的沒食子酸的濃度為，或 20μg/ml的核桃青皮提取物。
[0041 ] 實(shí)施例2
[0042] 與實(shí)施例1的不同之處在于，在本實(shí)施例中，
[0043] 所采用的第一誘導(dǎo)劑中，
[0044] rhGM-CSF 的濃度為800U/ml、
[0045] GM-CSF 的濃度為 5ng/mL、
[0046] 比-4 的濃度 5ng/mL、
[0047] rha-4 的濃度為800U/ml、
[004引和比-13的濃度為5ng/mL [0049]第二誘導(dǎo)劑中，
[0化0] rhTNF-a 的濃度為800U/ml、
[0051 ]沒食子酸的濃度為化g/ml，
[0052]或核桃青皮提取物的濃度為10μg/ml。
[0化3]實(shí)施例3
[0054] 與實(shí)施例1的不同之處在于，在本實(shí)施例中，
[0055] 所采用的第一誘導(dǎo)劑中，
[0化6] rhGM-CSF 的濃度為 1200U/ml、
[0057] GM-CSF 的濃度為 15ng/mL、
[0化引 比-4的濃度15ng/mL、
[0化9] rha-4 的濃度為 1200U/ml、
[0060] 和比-13的濃度為15ng/mL
[0061] 第二誘導(dǎo)劑中，
[0062] rhTNF-a 的濃度為 1200U/ml、
[0063] 沒食子酸的濃度為15μg/ml，
[0064] 或核桃青皮提取物的濃度為30μg/ml。
[0065] 為進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑及其所獲得的樹突狀細(xì)胞具有顯著的有益 效果，設(shè)置W下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
[0066] 檢測組1~3-分別對應(yīng)本發(fā)明實(shí)施例1~3所提供的成熟的樹突狀細(xì)胞；
[0067] 對照組一為采用現(xiàn)有方法獲得的樹突狀細(xì)胞。
[006引1.細(xì)胞表型的FACS分析
[0069] 分別收集檢測組和對照組4組樹突狀細(xì)胞，加入PBS溶液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度 至為IXloVml，取10化1加 入離屯、管，然后分別加入巧光標(biāo)記抗體(抗〔086、〔01化、〔011(3及 I-Ab單抗)調(diào)整終濃度為扣g/ml，置4°C冰箱中，避光反應(yīng)15min，添加 PBS溶液洗涂2遍，W巧 光標(biāo)記的同型Ig作為對照，上機(jī)(FACS calibur)檢測細(xì)胞巧光強(qiáng)度，CelIquest軟件分析。
[0070] 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組樹突狀細(xì)胞免疫分子表型巧光強(qiáng)度的比較(x±s)，檢測 結(jié)果如下表1:
[0071] 表1
[0072]
[0073] 檢測結(jié)果:CD86含量高于CDllc和la說明樹突狀細(xì)胞表面共刺激分子活化T細(xì)胞的 第二信號CD86高表達(dá)，由表1數(shù)據(jù)可知，經(jīng)本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑所誘導(dǎo)獲得的成熟的樹突 狀細(xì)胞表面免疫分子活化τ細(xì)胞的能力較強(qiáng)。
[0074] 2. ELISA法測定細(xì)胞因子（比-10和比-1化70)的含量
[0075] 分別收集檢測組1~3和對照組促成熟后的樹突狀細(xì)胞的上清液驚醒化ISA檢測， 檢測上清中IL-10與IL-1化70的分泌情況，檢測數(shù)據(jù)見下表2，IL-10與IL-1化70的分泌水平 (X + S)，（單位:pg/ml)
[0076] 表 2
[0077]
[0079] 檢測結(jié)果：由表2數(shù)據(jù)可知，檢測組1-3中，樹突狀細(xì)胞分泌的IL-1化70的水平遠(yuǎn)大 于IL-10,而IL-1化70能夠直接作用CD8巧細(xì)胞使其增殖，增強(qiáng)細(xì)胞免疫效應(yīng)W及形成長久 記性T淋己細(xì)胞，能夠分泌高水平的IL12是樹突狀細(xì)胞生物活性高的標(biāo)志之一；由此可知， 通過本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)所獲得的樹突狀細(xì)胞生物活性優(yōu)于對照組通過現(xiàn)有技術(shù) 所獲的樹突狀細(xì)胞的生物活性。
[0080] 3. CCK-騎去抗原膚特異性T細(xì)胞的增殖反應(yīng)
[0081] 分別對檢測組1~3和對照組細(xì)胞執(zhí)行W下操作：
[0082] 將抗原膚負(fù)載并促成熟后的樹突狀細(xì)胞與T細(xì)胞W細(xì)胞數(shù)1:10的比率共培養(yǎng)5天 后，用CCK法檢測T細(xì)胞的增殖情況。
[0083] 表3為檢測組和對照組影響T細(xì)胞增殖反應(yīng)的比較（％，x±s)
[0084]
[0085] ~檢測結(jié)果:樹突狀細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞的一個重要的功能是刺激T細(xì)胞增殖，因~ 此，樹突狀細(xì)胞能否激活細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞是檢驗(yàn)樹突狀細(xì)胞功能的關(guān)鍵問題。由表3中 數(shù)據(jù)可知，通過本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)所獲得的樹突狀細(xì)胞能夠促進(jìn)并提高T細(xì)胞的 增值率，增強(qiáng)免疫反應(yīng)能力。
[0086] W上對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實(shí)施方 式，上述的【具體實(shí)施方式】僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā) 明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可做出很多形式，運(yùn) 些均屬于本發(fā)明的保護(hù)之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種 DC 誘導(dǎo)劑，其特征在于，包括:rhGM-CSF、GM-CSF、IL-4、rhIL-^PIL-13。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DC誘導(dǎo)劑，其特征在于，所述rhGM-CSF的終濃度為800~ 1200U/ml、GM-CSF的終濃度為5~15ng/mL、IL-4的終濃度為5~15ng/mL、rhIL-4的終濃度為 800 ~1200U/ml 和 IL-13 的終濃度為 5 ~15ng/mL。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的DC誘導(dǎo)劑，其特征在于，所述rhGM-CSF的濃度為1000U/ml、GM-CSF的濃度為10ng/mL、IL-4的濃度為10ng/mL、rhIL-4的濃度為1000U/ml和IL-13的濃度為 10ng/mL 〇4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的DC誘導(dǎo)劑，其特征在于，所述rhGM-CSF的濃度為800U/ml、GM-CSF的濃度為5ng/mL、IL_4的濃度為5ng/mL、rhIL_4的濃度為800U/ml和IL-13的濃度為5ng/ mL〇5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的DC誘導(dǎo)劑，其特征在于，所述rhGM-CSF的濃度為1200U/ml、GM-CSF的濃度為15ng/mL、IL-4的濃度為15ng/mL、rhIL-4的濃度為1200U/ml和IL-13的濃度為 5ng/mL〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的DC誘導(dǎo)劑在誘導(dǎo)DC成熟過程中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種DC誘導(dǎo)劑，包括：rhGM-CSF、GM-CSF、IL-4、rhIL-4和IL-13。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由上述DC誘導(dǎo)劑在誘導(dǎo)DC成熟過程中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的DC誘導(dǎo)劑能夠提高樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞活性，提高樹突狀細(xì)胞細(xì)胞的增值率及成熟率，進(jìn)而提高樹突狀細(xì)胞的抗原提呈性。
【IPC分類】C12N5/0784
【公開號】CN105670994
【申請?zhí)枴緾N201610113526
【發(fā)明人】曾憲卓, 魯菲
【申請人】深圳愛生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年2月28日