穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細(xì)胞株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬生物技術(shù)、微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，涉及骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細(xì)胞株，具體涉及一種穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細(xì)胞株及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndeome，MDS)是一組克隆性細(xì)胞異常增生的疾病，以無(wú)效造血、病態(tài)造血及高風(fēng)險(xiǎn)向急性髓系白血病(AML)轉(zhuǎn)化為特點(diǎn)，其中，約20%-30%的MDS患者向AML進(jìn)展。據(jù)報(bào)道，在美國(guó)，MDS是最常見(jiàn)的髓系來(lái)源的腫瘤，男性發(fā)病率高于女性，平均每15個(gè)美國(guó)人中有3-4人患有MDS;隨著年齡的增加，MDS的發(fā)病率逐漸增加;在年齡大于60歲的患者中，發(fā)病率高達(dá)7-35/10萬(wàn)，有研究顯示先前行化療及放療治療的患者是MDS發(fā)病的高危人群。有統(tǒng)計(jì)顯示，我國(guó)MDS的發(fā)病率為1.45/10萬(wàn)，略低于歐美國(guó)家，隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程逐漸加劇，MDS的發(fā)病率也呈持續(xù)上升狀態(tài)?；谛螒B(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和免疫表型，世界衛(wèi)生組織(WHO)將MDS分為:難治性血細(xì)胞減少癥伴單系病態(tài)造血(RCUD)、難治性血細(xì)胞減少伴多系病態(tài)造血(RCMD)、環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞性難治性貧血(RARS)、難治性貧血伴原始細(xì)胞增多I型(RAEB-1)、難治性貧血伴原始細(xì)胞增多2型(RAEB-2)、5q-綜合征、不能分類(lèi)的MDS(MDS-U)。
[0003]研究顯示，在MDS的早期階段，造血細(xì)胞過(guò)度凋亡導(dǎo)致一系或者多系細(xì)胞減少。在MDS中細(xì)胞遺傳學(xué)的進(jìn)一步改變導(dǎo)致造血細(xì)胞增殖加速、分化受阻，最終進(jìn)展為AML。與初發(fā)AML(de novo AML)相比，MDS轉(zhuǎn)化的AML(sAML)患者年齡偏大，治療難度大，常常不能應(yīng)用異基因造血干細(xì)胞移植(Al 1-HSCT)和強(qiáng)烈化療進(jìn)行治療，其預(yù)后不佳;研究還顯示，隨著地西他濱及阿扎胞苷等去甲基化藥物的研發(fā)，治療MDS的手段取得了突破性進(jìn)展，但該些藥物對(duì)高危MDS和sAML的治療作用有限。由于臨床實(shí)踐缺乏有效的治療手段，體內(nèi)的白血病細(xì)胞難以清除，最終威脅患者的生命;然而，目前國(guó)內(nèi)外缺乏有效可靠的體內(nèi)外研究平臺(tái)，嚴(yán)重制約了MDS的基礎(chǔ)及臨床前研究。
[0004]隨著基因標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞示蹤在腫瘤的研究中得到了越來(lái)越多的應(yīng)用；綠色焚光蛋白(green fluorescent protein,GFP)可以在相應(yīng)波長(zhǎng)的紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，與傳統(tǒng)的新霉素耐藥基因(NeoR)和編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶的Lac-Z基因標(biāo)記技術(shù)相比，GFP標(biāo)記腫瘤細(xì)胞具有動(dòng)態(tài)直觀、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)方便、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可以靈敏地顯示腫瘤細(xì)胞的位置，并進(jìn)行定量研究，可應(yīng)用于微小殘留病等的研究，而且隨著動(dòng)物活體成像技術(shù)的發(fā)展，GFP也適合體內(nèi)細(xì)胞的觀察；同時(shí)，由于其分子量小，GFP可以與其他目的基因表達(dá)產(chǎn)物形成融合蛋白，不影響目的蛋白的空間構(gòu)象和功能，用于目的蛋白的位置標(biāo)記、功能和定量研究;基于以上幾點(diǎn)，以GFP進(jìn)行細(xì)胞示蹤為相關(guān)的腫瘤的研究提供了新的平臺(tái)。
[0005]微量殘留白血病(minimal residual leukemia,MRL)是指白血病經(jīng)誘導(dǎo)治療獲得完全緩解后體內(nèi)殘留少量白細(xì)胞的狀態(tài)，其是白血病復(fù)發(fā)的根源；由于微小殘留白血病分布隱蔽，通常臨床不易檢測(cè)，成為MRL研究的瓶頸。
[0006]基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供使GFP高效和穩(wěn)定地在細(xì)胞中表達(dá)的技術(shù)方案，具體涉及提供一種穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細(xì)胞株及其制備方法，進(jìn)一步用于建立小鼠動(dòng)物模型，利用熒光在成像上的優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期觀察，明確白血病細(xì)胞分布模式;為微小殘留病的研究提供平臺(tái)。
[0007]與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有:
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0022]本發(fā)明的目的是基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，提供一種穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細(xì)胞株及其制備方法，進(jìn)一步用于建立小鼠動(dòng)物模型，利用熒光在成像上的優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期觀察，明確白血病細(xì)胞分布模式;為微小殘留病的研究提供平臺(tái)。
[0023]本發(fā)明中，將綠色熒光蛋白(GFP)導(dǎo)入細(xì)胞，使GFP高效和穩(wěn)定地在細(xì)胞中表達(dá)，建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細(xì)胞株。
[0024]本發(fā)明中，以人骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細(xì)胞系SKM-1為母系細(xì)胞，通過(guò)攜帶GFP基因的慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以有限稀釋法獲得GFP陽(yáng)性的單細(xì)胞克隆，將擴(kuò)大培養(yǎng)后的細(xì)胞通過(guò)皮下注射的方式在小鼠體內(nèi)篩選，致瘤后將瘤塊分離，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細(xì)胞株SKM-1/GFP，該細(xì)胞系能穩(wěn)定表達(dá)GFP。所述的細(xì)胞株已于2015年12月28日保藏，保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101，保藏編號(hào):CGMCC N0.11798,分類(lèi)命名:人穩(wěn)定表達(dá)綠色熒