光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞SKM-1/GFPο
[0025]本發(fā)明采用下述方法建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株SKM-1/GFP:采用以HIV-1 (人類免疫缺陷I型病毒)為載體的慢病毒轉染技術，攜帶GFP外源基因穩(wěn)定地整合入宿主細胞基因組中，在細胞分裂、轉移和分化時，GFP也可以穩(wěn)定表達，而不出現熒光逐漸減低的情況；同時，在小鼠體內篩選前，對細胞進行單細胞克隆化培養(yǎng)，使GFP熒光均一，防止細胞在后續(xù)培養(yǎng)中出現GFP脫失的情況;所建立的SKM-1/GFP細胞株生長特性與母細胞基本保持一致，為后續(xù)的動物實驗建立了良好的基礎。
[0026]本發(fā)明中，慢病毒轉染后72h，熒光顯微鏡下觀察，多數細胞帶有綠色熒光，流式細胞儀檢測GFP陽性率在85%左右，以SKM-1母系細胞為對照，在普通顯微鏡下觀察，轉染前后細胞大小及形態(tài)未見明顯變化(如圖2所示)。
[0027]本發(fā)明中，采用有限稀釋法將轉染后的SKM-1細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，96孔細胞培養(yǎng)板中共接種32個單個細胞，在普通顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察，挑選出表達GFP的單個細胞20個，經完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4周后得到I株可持續(xù)增殖的單細胞克隆，并繼續(xù)擴增培養(yǎng);小鼠體內篩選后，經流式細胞儀檢測，單細胞克隆化培養(yǎng)的細胞GFP陽性率為100 % (如圖3所示)，結果表明，經體內或體外培養(yǎng)后，SKM-1/GFP細胞熒光表達率穩(wěn)定，無明顯衰減。
[0028]本發(fā)明中，所述的SKM-1細胞系購自日本Health Science Research ResourcesBank(HSRRB)，長期液氮保存和傳代，采用10%胎牛血清及90%的RPMI 1640培養(yǎng)液配置成完全培養(yǎng)基，在37 °C、5 % CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2-3天傳代一次。
[0029]本發(fā)明采用細胞內穩(wěn)定表達的GFP標記MDS轉白細胞，可進一步建立小鼠動物模型，利用熒光成像的優(yōu)勢，在動物體內長期觀察，明確白血病細胞分布模式;本發(fā)明的實施例中，在小鼠體內篩選前，對細胞進行單細胞克隆化培養(yǎng)，使GFP熒光均一，GFP表達效率在100%，防止細胞在后續(xù)培養(yǎng)中出現GFP脫失的情況，所建立的SKM-1/GFP細胞株生長特性與母細胞基本保持一致，為后續(xù)的動物實驗建立了良好的基礎。
[0030]本發(fā)明中，采用的動物為Nod/scid小鼠雄性，鼠齡為6周齡，體重23g，飼養(yǎng)于無特定病原體(SPF)級，單細胞克隆擴增培養(yǎng)后接種至Nod/sc id小鼠皮下，接種14天時，小鼠注射細胞處皮下可見黃豆大小的瘤塊，致瘤30天時，可肉眼觀察到凸出皮膚的腫塊，大小為14.75*21.75mm；
[0031]應用CCK-8法測定生長曲線，結果顯示，SKM-1/GFP與SKM-1生長曲線無明顯差異。
[0032]本發(fā)明的SKM-1/GFP細胞株具有以下生物學特性:
[0033]1.SKM-1/GFP細胞呈圓形，懸浮生長，形態(tài)和生長特性與SKM-1母系細胞無差異；
[0034]2.流式細胞儀檢測SKM-1/GFP細胞的GFP陽性率為100% ；
[0035]3.致瘤性:接種30天時，肉眼可觀察到凸出皮膚的腫塊，大小為14.75*21.75mm ；
[0036]4.SKM-1/GFP細胞生長曲線與SKM-1母系細胞無差異；
[0037]5.小鼠致瘤后，小動物活體熒光顯像可以顯示瘤塊。
[0038]本發(fā)明以人骨髓增生異常綜合征轉白細胞系SKM-1為母系細胞，通過攜帶GFP基因的慢病毒轉染，GFP陽性的單細胞克隆及小鼠體內篩選等建立了穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株SKM-1/GFP，該細胞系形態(tài)和生長特性與母系細胞無差異，生長曲線與母系細胞無差異，可以穩(wěn)定表達GFP，并且具有致瘤性。進一步可用于小鼠動物模型的建立，為MDS微小殘留病及其他臨床前研究提供平臺，以及為藥物篩選及MDS治療的選擇提供有意義的指導。
【附圖說明】
[0039]圖1 為pCMV-dR8.91 質粒圖。
[0040]圖2為SKM-1和SKM-1/GFP細胞光鏡和熒光顯微鏡下細胞形態(tài)，其中，A*SKM_1細胞光鏡下細胞形態(tài);B為SKM-1細胞熒光顯微鏡下圖像;C為SKM-1/GFP細胞光鏡下細胞形態(tài);D為SKM-1/GFP細胞熒光顯微鏡下圖像。
[0041 ]圖3，流式細胞儀檢測單細胞克隆擴大培養(yǎng)后細胞的GFP陽性率。
[0042]圖4是SKM-1/GFP細胞接種30天后，小鼠體內致瘤情況。
[0043]圖5是SKM-1和SKM-1/GFP細胞生長曲線。
[0044]圖6是小動物活體熒光顯像。
[0045]圖7SKM-1/GFP組荷瘤小鼠瘤塊行冰凍切片后，熒光顯微鏡下可見較為均一的GFP陽性腫瘤細胞浸潤。
【具體實施方式】
[0046]實施例1
[0047]采用下述方法:以人骨髓增生異常綜合征轉白細胞系SKM-1為母系細胞，通過攜帶GFP基因的慢病毒進行轉染，以有限稀釋法獲得GFP陽性的單細胞克隆，并將擴大培養(yǎng)后的細胞通過皮下注射的方式在小鼠體內篩選，致瘤后將瘤塊分離，繼續(xù)進行培養(yǎng)，獲得SKM-1/GFP，該細胞系可以穩(wěn)定表達GFP。
[0048]I)慢病毒包裝及轉染:
[0049]pCMV_dR8.91質粒購自上海斯丹賽生物技術有限公司，轉染前24h將對數生長期的293T細胞接種于六孔板，在37 °C、5 % C02條件下培養(yǎng)，當細胞密度到達80 % 一90 %時，進行轉染;將pCMV-dR8.91質粒以及輔助質粒pVSVG按照一定比例加入ΙΟΟμΙ無血清DMEM中，同時將10μ1 Lipofectamine 2000溶于ΙΟΟμΙ無血清DMEM中，靜置5min;然后將二者混勻靜置15min，加入無抗生素和無血清的DMEM培養(yǎng)基800μ1至lml，均勻加入到接種了 293T細胞的六孔板中，放入培養(yǎng)箱，8h后換液;次日熒光顯微鏡觀察轉染效率;48h后收集培養(yǎng)液，3000rpmX 1min離心，用0.45uM濾器過濾上清濾除細胞碎片后，分裝到無菌的2mL細胞凍存管中，可直接感染或_80°C凍存；
[0050]實驗前接種5X 14個目的細胞于12孔培養(yǎng)板中，加入濃度為I X 108TU/ml慢病毒20μ?，用適量完全培養(yǎng)基調整總體積為500μ1，同時向培養(yǎng)基中加入終濃度為5yg/ml的polybrene增強轉染，輕輕混勻;8_12小時后觀察細胞狀態(tài)，離心，棄去細胞上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，繼續(xù)培養(yǎng);72-96小時觀察熒光表達情況；
[0051 ] 2)單細胞克隆篩選:
[0052]調整細胞密度為0.5個/ΙΟΟμΙ，充分混勻，向96孔培養(yǎng)板中每孔加入ΙΟΟμΙ細胞懸液，分別在普通顯微鏡和熒光顯微鏡下挑選出表達GFP且為單個細胞的孔，進行標記，并進行擴大培養(yǎng)；
[0053]3)小鼠體內篩選:
[0054]在皮下注射腫瘤細胞前72小時、24小時腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)120mg/kg，調整細胞濃度至5 X 107/ml，皮下致瘤按照0.lml/10g注射液體量標準，在小鼠右側脅下部位注射腫瘤細胞懸液，觀察致瘤情況;30天時，常規(guī)處理小鼠，無菌分離小鼠皮下瘤塊并剪碎，注射器針芯碾磨后200目濾網過濾，制備單細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)；
[0055]4)CCK_8法檢測生長曲線
[0056]收集SKM-1及SKM-1/GFP細胞懸液，調整細胞濃度為105/ml，在96孔板中鋪板，每孔加入ΙΟΟμΙ細胞懸液，分別在0、24、48、72、96小時加入CCK-8溶液?ομ?/孔，在培養(yǎng)箱中孵育4小時后，在酶標儀上讀取OD值，檢測波長為450nm，同時選用參考波長為630nm，每次每組樣本設置3個平行樣本，計算平均值，取3次實驗數據進行統(tǒng)計；
[0057]5)冰凍切片:
[0058]取處理后小鼠新鮮的腫塊組織，浸入30 %的蔗糖溶液，沉底24h后，用OCT包埋，-70°C冰凍使其固化，制備連續(xù)冰凍切片，在熒光顯微鏡下475nm處觀察各組織中的綠色熒光；
[0059]結果顯示，建立的細胞系形態(tài)和生長特性與母系細胞無差異，生長曲線與母系細胞無差異，可以穩(wěn)定表達GFP，并且具有致瘤性。
【主權項】
1.一種穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株，其特征在于，所述細胞株于2015年12月保藏，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號:CGMCC 11798，分類命名:穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株SKM-1 /GFP。2.按權利要求1所述的穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株，其特征在于，所述的細胞株SKM-1/GFP以人骨髓增生異常綜合征轉白細胞系SKM-1為母系細胞，通過攜帶GFP基因的慢病毒進行轉染，以有限稀釋法獲得GFP陽性的單細胞克隆，進一步在小鼠動物模型體內篩選，小鼠致瘤后將瘤塊分離，繼續(xù)培養(yǎng)后獲得，該細胞系能穩(wěn)定表達穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白GFP。3.按權利要求1或2所述的穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株，其特征在于，所述的細胞株SKM-1/GFP具有以下生物學特性: I) SKM-1/GFP細胞呈圓形，懸浮生長，形態(tài)和生長特性與SKM-1母系細胞無差異； 2流式細胞儀檢測SKM-1/GFP細胞的GFP陽性率為100%; 3)致瘤性:接種30天時，肉眼可觀察到凸出皮膚的腫塊，大小為14.75*21.75mm; 4)SKM-1/GFP細胞生長曲線與SKM-1母系細胞無差異； 5)小鼠致瘤后，小動物活體熒光顯像可以顯示瘤塊。4.按權利要求2所述的穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株，其特征是，所述的動物模型為Nod/scid小鼠。5.權利要求1所述的穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株在用于建立MDS微小殘留病研究模型中的用途。6.權利要求1所述的穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株在用于建立MDS微小殘留病藥物篩選模型中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明屬微生物動物細胞系領域。設計穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株及其建立方法和用途，本發(fā)明以人骨髓增生異常綜合征轉白細胞系SKM-1為母系細胞，通過攜帶GFP基因的慢病毒進行轉染，以有限稀釋法獲得GFP陽性的單細胞克隆，并將擴大培養(yǎng)后的細胞通過皮下注射的方式在小鼠體內篩選，致瘤后將瘤塊分離，繼續(xù)培養(yǎng)后，獲得穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉白細胞株SKM-1/GFP。該細胞系形態(tài)和生長特性與母系細胞無差異，生長曲線與母系細胞無差異，可以穩(wěn)定表達GFP，并且具有致瘤性?？蛇M一步用于小鼠動物模型的建立以及為MDS微小殘留病及其他臨床前研究提供平。CGMCC 1179820151228
【IPC分類】C12N5/10, C12R1/91, A01K67/027
【公開號】CN105670999
【申請?zhí)枴緾N201610071162
【發(fā)明人】許小平, 莊琳, 王倩, 馬燕, 張晶, 朱晨
【申請人】復旦大學附屬華山醫(yī)院
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年2月1日