利用紅豆杉聯(lián)產(chǎn)紫杉烷類有效成分和乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從植物中分離提取有效成分的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用紅豆杉聯(lián)產(chǎn)紫杉烷類有效成分和乙醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紫杉烷類化合物是提取于高等裸子植物紅豆杉的樹皮、根和葉等部位的一類化合物，主要含有紫杉醇、三尖杉寧堿、10-DABm、7木糖基紫杉醇等，有許多已被證明具有細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性。較為常用的從紅豆杉屬植物中提取制備紫杉醇等的方法，其工藝路線一般為:先用機(jī)溶劑提取，然后回收有機(jī)溶劑得到浸膏，對(duì)浸膏脫脂后進(jìn)行柱分離，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展了許多改進(jìn)工藝，但是這些現(xiàn)有工藝均大量使用溶劑，容易造成環(huán)境污染，成本也大大提高?，F(xiàn)有提取紫杉烷類有效成分的方法，如申請(qǐng)?zhí)枮?01510388338.3的“一種從紅豆杉中高效提取紫杉醇的方法”專利，公開的提取紫杉烷類有效成分的方法是:先將紅豆杉原料研磨粉碎過100-200目篩，然后加入5-10倍量的水和0.1 %的冰醋酸進(jìn)行超聲輔助酶解，靜置過濾分液，超聲輔助有機(jī)溶劑萃取，柱層析除雜，堿性樹脂柱連續(xù)純化分離，進(jìn)而獲得紫杉醇產(chǎn)品。該方法的主要缺點(diǎn)是:①只對(duì)紫杉紫杉烷類中的紫杉醇進(jìn)行純化，忽略了三尖杉寧堿、1-DABm等有效成分;②酶解的酶單一，只采用纖維素酶進(jìn)行酶解;③酶解產(chǎn)生的糖類未充分利用，導(dǎo)致資源浪費(fèi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的是針對(duì)現(xiàn)有提取紫杉烷類有效成分方法的不足，提供一種利用紅豆杉聯(lián)產(chǎn)紫杉烷類有效成分和乙醇的方法，能同時(shí)提取獲得紫杉醇、三尖杉寧堿和1-DABm等紫杉烷類有效成分和乙醇，具有制備工藝、生產(chǎn)設(shè)備及操作步驟簡(jiǎn)單，提取效率高，實(shí)用性強(qiáng)，并聯(lián)廣乙醇等特點(diǎn)。
[0004]本發(fā)明的利用紅豆杉聯(lián)產(chǎn)紫杉烷類有效成分和乙醇的方法，包括以下步驟:將紅豆杉在弱酸性條件下酶解纖維素和半纖維素后發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，然后利用產(chǎn)生的乙醇提取紫杉烷類有效成分；
[0005]進(jìn)一步，包括以下步驟:
[0006]a.酶水解:向破碎的紅豆杉枝葉中加入pH為4.0?5.5檸檬酸鈉緩沖溶液后添加纖維素酶和半纖維素酶，置于35-45°C下反應(yīng)10?50h，得到含有糖類的水解混合物；
[0007]b.發(fā)酵:將步驟b中的水解混合物在pH為4.5?6.0，溫度為30?35°C下發(fā)酵20?50h，得到含有乙醇的發(fā)酵混合物；
[0008]c.提取:將含有乙醇的發(fā)酵混合物攪拌提取20?60min收集提取液，將提取液回收乙醇后得到含有紫杉醇、三尖杉寧堿和1-DABm的浸膏；
[0009]進(jìn)一步，步驟a中，所述紅豆杉枝葉與檸檬酸鈉緩沖溶液的質(zhì)量比為1:2?10;所述纖維素酶為紅豆杉總量的0.01?0.5%，半纖維素酶為紅豆杉總量的0.01?0.5% ;
[0010]進(jìn)一步，步驟a中，所述紅豆杉枝葉與檸檬酸鈉緩沖溶液的質(zhì)量比為1:6;所述纖維素酶為紅豆杉總量的0.15%，半纖維素酶為紅豆杉總量的0.1% ;
[0011]進(jìn)一步，步驟a中，所述檸檬酸鈉緩沖溶液pH為5;在40°C下反應(yīng)35h;
[0012]進(jìn)一步，步驟b中，調(diào)節(jié)水解混合物中總糖濃度為5?50g/L，再利用檸檬酸或氨水調(diào)節(jié)混合物的PH為4.5.0?6.0后接種酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵；
[0013]進(jìn)一步，可加入還原性糖液調(diào)節(jié)總糖濃度；
[0014]進(jìn)一步，步驟b中，混合物總糖濃度為30g/L，pH為5.5，發(fā)酵溫度為32 °C，發(fā)酵時(shí)間35h；
[0015]進(jìn)一步，步驟c中，調(diào)節(jié)發(fā)酵混合物中乙醇體積分?jǐn)?shù)為20?60%后攪拌提取；
[0016]進(jìn)一步，步驟c中，調(diào)節(jié)發(fā)酵混合物中乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%后提取40min，將浸膏純化制得紫杉醇、三尖杉寧堿和1-DABm。
[0017]本發(fā)明的有益效果:利用紅豆杉聯(lián)產(chǎn)紫杉烷類有效成分和乙醇的方法，以曼地亞紅豆杉枝葉為原料，將紅豆杉中的纖維素和半纖維素進(jìn)行水解，通過酶水解纖維素后發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，以使紫杉烷類有效成分能更好的溶解于乙醇提取液中，能同時(shí)提取紫杉醇、三尖杉寧堿和1-DABm等紫杉烷類有效成分和乙醇，紫杉醇的提取率99%以上，三尖杉寧堿提取率99%以上，1-DABm提取率99%以上，浸膏中紫杉醇含量I %?5%，三尖杉寧堿含量I %?3%，1-DABm含量I %?3%，該工藝中，酶解產(chǎn)生的糖類為發(fā)酵提供碳源，發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇用于有效成分的提取，達(dá)到循環(huán)使用、節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本、綠色環(huán)保的目的；該方法具有制備工藝、操作步驟及生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)單，提取效率高，實(shí)用性強(qiáng)，并聯(lián)產(chǎn)乙醇等特點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本實(shí)施例的利用紅豆杉聯(lián)產(chǎn)紫杉烷類有效成分和乙醇的方法，包括以下步驟:將紅豆杉在弱酸性條件下酶解纖維素和半纖維素后發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，然后利用產(chǎn)生的乙醇提取紫杉烷類有效成分;酶解產(chǎn)生的糖類為發(fā)酵提供碳源，發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇用于有效成分的提取，達(dá)到循環(huán)使用、節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本、綠色環(huán)保的目的。
[0019]本實(shí)施例中，包括以下步驟:
[0020]a.酶水解:向破碎的紅豆杉枝葉中加入pH為4.0?5.5檸檬酸鈉緩沖溶液后添加纖維素酶和半纖維素酶，置于35-45°C下反應(yīng)10?50h，得到含有糖類的水解混合物；
[0021 ] b.發(fā)酵:將步驟b中的水解混合物在pH為4.5?6.0，溫度為30?35°C下發(fā)酵20?50h，得到含有乙醇的發(fā)酵混合物；
[0022]c.提取:將含有乙醇的發(fā)酵混合物攪拌提取20?60min收集提取液，將提取液回收乙醇后得到含有紫杉醇、三尖杉寧堿和1-DABm的浸膏；以曼地亞紅豆杉枝葉為原料，將紅豆杉中的纖維素和半纖維素進(jìn)行水解，以使紫杉烷類有效成分能更好的溶解于乙醇提取液中，提高提取率，酶解產(chǎn)生的糖類為發(fā)酵提供碳源，充分利用發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇作為有效成分的提取劑，提取后的濾渣作為廢渣處理，收集的提取液回收乙醇后得到浸膏，回收的乙醇重復(fù)利用，采用現(xiàn)有的方法回收乙醇。
[0023]本實(shí)施例中，步驟a中，所述紅豆杉枝葉與檸檬酸鈉緩沖溶液的質(zhì)量比為1:2?10;所述纖維素酶為紅豆杉總量的0.01?0.5%，半纖維素酶為紅豆杉總量的0.01?0.5% ;上述參數(shù)與酶解溫度和時(shí)間協(xié)同作用確保紅豆杉枝葉中的纖維素和半纖維素充分酶解，便于有效成分的溶出并產(chǎn)生能為下一步的發(fā)酵提供足夠碳源的糖。
[0024]本實(shí)施例中，步驟a中，所述紅豆杉枝葉與檸檬酸鈉緩沖溶液的質(zhì)量比為1:6;所述纖維素酶為紅豆杉總量的0.15%，半纖維素酶為紅豆杉總量的0.1%;所述檸檬酸鈉緩沖溶液pH為5;在40°C下反應(yīng)35h;上述參數(shù)使紅豆杉枝葉中的纖維素和半纖維素酶解效果最佳，更利于有效成分的溶出并產(chǎn)生能為下一步的發(fā)酵提供足夠碳源的糖，確保反應(yīng)的效果最佳，更利于提高提取率，確保有效成分的純度。
[0025]本實(shí)施例中，步驟b中，調(diào)節(jié)水解混合物中總糖濃度為5?50g/L，再利用檸檬酸或氨水調(diào)節(jié)混合物的pH為4.5.0?6.0后接種酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵;可加入還原性糖液調(diào)節(jié)總糖濃度;當(dāng)反應(yīng)中產(chǎn)生的糖不足時(shí)，可通過外加糖類調(diào)節(jié)混合物中總糖的濃度，確保發(fā)酵的效果更好，以使紫杉烷類有效成分能更好的溶解于乙醇提取液中，提高提取率。
[0026]本實(shí)施例中，步驟b中，混合物總糖濃度為30g/L，pH為5.5，發(fā)酵溫度為32 °C，發(fā)酵時(shí)間35h;上述參數(shù)使發(fā)酵的效果更好，使紫杉烷類有效成分充分溶出，確保有效成分溶出的純度。
[0027]本實(shí)施例中，步驟c中，調(diào)節(jié)發(fā)酵混合物中乙醇體積分?jǐn)?shù)為20?60%后攪拌提?。徊捎脭嚢璧姆绞教崛?，工藝簡(jiǎn)單，避免使用其他外加劑而影響有效成分的純度，進(jìn)而影響最終的提取率。
[0028]本實(shí)施例中，步驟c中，調(diào)節(jié)發(fā)酵混合物中乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%后提取40min，將浸膏純化制得紫杉醇、三尖杉寧堿和1-DABm;采用傳統(tǒng)純化方法純化浸膏即可得到紫杉醇、三尖杉寧堿和1-DABm產(chǎn)品，采用本發(fā)明生產(chǎn)的紫杉醇產(chǎn)品可作為抗癌制劑的原料，生產(chǎn)的三尖杉寧堿和1-DABm可用于紫杉醇、多西他賽、卡巴他賽的合成原料，應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)用中。
[0029]下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。
[0030]實(shí)施例一
[0031]本實(shí)施例的利用紅豆杉聯(lián)產(chǎn)紫杉烷類有效成分和乙醇的方法，包括以下步驟:
[0032]a.酶水解:將曼地亞紅豆杉枝葉進(jìn)行破碎，向破碎的紅豆杉枝葉中加入pH為4.0梓檬酸鈉緩沖溶液，固液比為1: 2，然后添加紅豆杉總量0.01%的纖維素酶和紅豆杉總量0.01%的半纖維素酶，置于35°C下反應(yīng)1h，得到含有糖類的水解混合物；
[0033]b.發(fā)酵:將步驟b中的水解混合物調(diào)節(jié)總糖濃度為5g/L，用檸檬酸或氨水調(diào)節(jié)pH為4.5后接種酵母菌株，在溫度為30°C下發(fā)酵20h，得到含有乙醇的發(fā)酵混合物；
[0034]c.提取:將含有乙醇的發(fā)酵混合物調(diào)節(jié)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%攪拌提取20min后過濾收集提取液，將提取液回收乙醇后得到含有紫杉醇、三尖杉寧堿和1-DABm的浸膏;濾渣作為廢渣處理；回收的乙醇重復(fù)利用，浸膏用傳統(tǒng)純化方法純化即可得到紫杉醇、三尖杉寧堿和I O-DABm產(chǎn)品。
[0035]本實(shí)施例中，紫杉醇的提取率99.5%以上，三尖杉寧堿提取率99.5%以上，10-DABm提取率99.5 %以上，浸膏中紫杉醇含量2 %，三尖杉寧堿含量2 %，1-DABm含量1.5 %。
[0036]實(shí)施例二
[0037]本實(shí)施例的利用紅豆杉聯(lián)產(chǎn)紫杉烷類有效成分和乙醇的方法，包括以下步驟:
[0038]a.酶水解:將曼地亞紅豆杉枝葉進(jìn)行破碎，向破碎的紅豆杉枝葉中加入pH為5.5梓檬酸鈉緩沖溶液，固液比為1: 10，然后添加紅豆杉總量0.5%的纖維素酶和紅豆杉總量0.5 %的半纖維素酶，置于45 °C下反應(yīng)50h，得到含有糖類的水解混合物；
[0039]b.發(fā)酵:將步驟b中的水解混合物調(diào)節(jié)總糖濃度為50g/L，用檸檬酸或氨水調(diào)節(jié)pH為6.0后接種酵母菌株，在溫度為35°C下發(fā)酵50h，得到含有乙醇的發(fā)酵混合物；
[0040]c.提取:將含有乙醇的發(fā)酵混合物調(diào)節(jié)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%攪拌提取60min后過濾收集提取液，將提取液回收乙醇后得到含有紫杉醇、三尖杉寧堿和1-DABm的浸膏;濾渣作為廢渣處理；回收的乙醇重復(fù)利用，浸膏用傳統(tǒng)純化方法純化即可得到紫杉醇、三尖杉寧堿和I O-DABm產(chǎn)品。
[0041 ] 本實(shí)施例中，紫杉醇的提取率99.3%以上，三尖杉寧堿提取率99.6%以上，10-DABm提取率99.5 %以上，浸膏中紫杉醇含量3 %，三尖杉寧堿含量2 %，1-DABm含量1.5 %。
[0042]實(shí)施例三
[0043]本實(shí)施例的利用紅豆杉聯(lián)產(chǎn)紫杉烷類有效成分和乙醇的方法，包括以下步驟:
[0044]a.酶水解:將曼地亞紅豆杉枝葉進(jìn)行破碎，向破碎的紅豆杉枝葉中加入pH為5檸檬酸鈉緩沖溶液，固液比為1:6，然后添加紅豆杉總量0.15%的纖維素酶和紅豆杉總量0.1 %的半纖維素酶，置于4