用于檢測(cè)耐碳青霉烯類腸桿菌試劑盒與檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于耐碳青霉締類腸桿菌(CRE)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及碳青酶締酶基因 KPC、NDM、IMP、VIM和0XA-48的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 碳青霉締類抗生素是抗菌譜最廣，抗菌活性最強(qiáng)的非典型β-內(nèi)酷胺抗生素，因其 具有對(duì)β-內(nèi)酷胺酶穩(wěn)定W及毒性低等特點(diǎn)，已經(jīng)成為治療嚴(yán)重細(xì)菌感染最主要的抗菌藥物 之一。隨著其在臨床中的廣泛應(yīng)用，碳青霉締類抗生素出現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象，耐藥細(xì)菌表現(xiàn) 為廣泛耐藥。2000年W前，未見碳青霉締酶廣泛流行的報(bào)道，更多的是AmpC酶或者ES化合并 膜孔蛋白丟失造成碳青霉締耐藥的報(bào)道;2001年，美國(guó)北卡羅來(lái)納州首次報(bào)道KPC(該菌是 1996年在ICU分離出的一株細(xì)菌）；2004年，美國(guó)紐約布魯克林地區(qū)報(bào)道了 KPC的暴發(fā)流行； 從1996年到2006年間，KPC風(fēng)行美國(guó)全國(guó)；過(guò)去的十年，CRE逐漸成為威脅人類健康的一個(gè)重 要問(wèn)題。碳青霉締耐藥的腸桿菌（Ca;rbapenem-Resis1:ant Enterobacteriaceae)或耐碳青 霉締腸桿菌，包括腸桿菌、銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌等，具有特點(diǎn)包括（1)所 致感染病死率高；（2)意味著泛耐藥，治療方案有限（3)位于質(zhì)粒上的耐藥基因在不同種的 細(xì)菌間傳遞；（4)耐藥轉(zhuǎn)移速度快:從院內(nèi)到社區(qū)；因此對(duì)于耐藥菌株的快速檢測(cè)對(duì)于患者 抗生素精準(zhǔn)治療，減少抗生素濫用具有極為重要的臨床意義。
[0003] 越來(lái)越多研究表明，細(xì)CRE耐藥機(jī)理主要包括:碳青霉締酶與頭抱菌素酶合并膜孔 蛋白丟失。產(chǎn)碳青霉締酶基因存在多重，包括KPC、NDM-l、IMP、VIM與0XA-48等運(yùn)5種最流行 的碳青霉締類抗菌藥物耐藥機(jī)制。KPC是引起腸桿菌科細(xì)菌碳青酶締主要原因，KPC的基因 型已達(dá)約20種，目前流行的主要是KPC-2和KPC-3; NDM基因大約有12種NDM基因型，是引起全 球關(guān)注的新發(fā)水解活性極強(qiáng)的碳青霉締酶；IMP和VIM是臨床中最為常見的金屬β-內(nèi)酷胺 酶。0ΧΑ-48高度水解青霉素，輕度水解碳青霉締類藥物(活性中屯、無(wú)疏水橋），對(duì)ΙΡΜ的活性 大于ΜΗΜ。
[0004] 目前用于CRE基因型檢測(cè)的方法有多種類型，包括PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法、基 因忍片等，運(yùn)些方法存在檢測(cè)通量低、集成程度差、檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)較高等問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)所存在的問(wèn)題，本發(fā)明針對(duì)爆發(fā)流行最常見、最關(guān)鍵的基因，采用多 重?cái)U(kuò)增技術(shù)，結(jié)合CFX96 Touch?巧光定量pCR、biometra Toptical型巧光定量PCR等6通道 檢測(cè)系統(tǒng)，單次反應(yīng)檢測(cè)W上五種基因的多種亞型，為臨床工作者鑒定CRE基因型，縮短時(shí) 間、降低成本具有極大的臨床意義。
[0006] 本發(fā)明目的之一提供一種用于檢測(cè)耐碳青霉締類腸桿菌(CRE)的試劑盒，試劑盒 中包括下述組合物:檢測(cè)引物對(duì)和檢測(cè)探針。本發(fā)明的目的之二還在于提供基于該檢測(cè)引 物對(duì)和檢測(cè)探針的根進(jìn)一步的試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明的組合物、試劑盒及檢測(cè)方法能 夠多重?cái)U(kuò)增分別檢測(cè)KPC、NDM與IMP、VIM、0XA-48等耐藥基因，并且實(shí)現(xiàn)耐藥基因定量測(cè)定。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：
[0008] 本發(fā)明提供用于檢測(cè)耐碳青霉締類腸桿菌的試劑盒，包括下述檢測(cè)引物對(duì)中的至 少一對(duì)：
[0009] 檢測(cè)引物對(duì)1:
[0010] 邸(：上游引物為:5'-41^6〇1；1'(：了461'1'(：了6(：了6-3'，如沈9 10^.1所示，
[0011] KPC下游引物為:5' -TATCCATCGCGTACACACCG-3'，如沈Q ID NO. 2所示；
[0012] 檢測(cè)引物對(duì)2:
[0013] NDM上游引物為:5' -GCAAATGGAAACTGGCGACC-3'，如沈Q ID NO. 4所示，
[0014] NDM下游引物為:5' -TCAAACCGTTGGAAGCGACT-3'，如沈Q ID NO. 5所示；
[001引檢測(cè)引物對(duì)3:
[0016] 〇^上游引物為：5'-口^461766口^461761766了6-3'，如沈9 10^.7所示，
[0017] IMP下游引物為:5' -TGGATTAAATAGCCAAACTGACGC-3'，如沈Q ID NO. 8所示；
[001引檢測(cè)引物對(duì)4:
[0019] ￥0〇1游引物為：5'-40：464刊601；4了66了61'1'-3'，如沈9 10^.10所示，
[0020] ￥碰下游引物為:5'-1^61^4了64446了6〔6了664-3'，如沈9 10^.11所示；
[0021] 檢測(cè)引物對(duì)5:
[0022] 0乂4-48上游引物為:5'-666〔641^446口'4176664-3'，如沈9 10^.13所示，
[0023] 0乂4-48下游引物為：5'-66口'6了61'1'1'1766了66〔41'-3'，如沈9 10備.14所示。
[0024] 本發(fā)明從眾多基因中選擇KPC、NDM與IMP、VIM、0XA-48中的一種或幾種作為檢測(cè)的 目的基因，一方面，可W保證檢測(cè)結(jié)果的靈敏性和有效性，另一方面，具有操作簡(jiǎn)便、成本 低、所需時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。在引物的設(shè)計(jì)過(guò)程中，由于檢測(cè)樣本的不確定性，往往出現(xiàn)非特異 性擴(kuò)增、無(wú)法擴(kuò)增出或者引物與引物之間、引物與其他探針之間擴(kuò)增相互干擾等問(wèn)題，發(fā)明 人意外的發(fā)現(xiàn)上述序列的檢測(cè)引物具有很好的特異性和有效性，尤其，當(dāng)運(yùn)幾種基因 KPC、 NDM與IMP、VIM、0XA-48-起聯(lián)合使用時(shí)，效果會(huì)更好。
[00巧]進(jìn)一步，包括至少一個(gè)對(duì)應(yīng)與上述檢測(cè)引物對(duì)匹配的檢測(cè)探針，
[0026] 與檢測(cè)引物對(duì)1匹配的檢測(cè)探針為KPC探針：
[0027] KPC探針包括SEQ ID NO. 3所示的核巧酸序列，優(yōu)選地，
[0028] KPC探針為:5'-巧光標(biāo)記物 1/GGCCGCTGGCTGGCTTTTCTGCCAC/澤滅劑-3';
[0029] 與檢測(cè)引物對(duì)2匹配的檢測(cè)探針為NDM探針：
[0030] NDM探針包括SEQ ID NO.6所示的核巧酸序列，優(yōu)選地，
[0031] NDM探針為:5'-巧光標(biāo)記物2/TCGCACCGAATGTCTGGCAGCACA/澤滅劑-3';
[0032] 與檢測(cè)引物對(duì)3匹配的檢測(cè)探針為IMP探針：
[0033] IMP探針包括SEQ ID NO.9所示的核巧酸序列，優(yōu)選地，
[0034] IMP探針為:5'-巧光標(biāo)記物3/TAATTGCTTATTTTGCGTCAGTTTGGC/澤滅劑-3';
[0035] 與檢測(cè)引物對(duì)4匹配的檢測(cè)探針為VIM探針：
[0036] VIM探針包括SEQ ID NO. 12所示的核巧酸序列，優(yōu)選地，
[0037] VIM探針為:5'-巧光標(biāo)記物4/TCGTTTGATGGCGCAGTCTACCCGTCC/澤滅劑-3';
[003引與檢測(cè)引物對(duì)5匹配的檢測(cè)探針為0XA-48探針：
[0039] 0乂4-48探針包括569 10^.15所示的核巧酸序列，優(yōu)選地，
[0040] OXA-48探針為:5'-巧光標(biāo)記物5/ATTATTGGTAAATCCTTGCTGCTTATTC/澤滅劑-3'。
[0041] 所述巧光標(biāo)記物1至巧光標(biāo)記物5選自不同的巧光標(biāo)記物，用W保證在在同一體系 中通過(guò)不同的巧光標(biāo)記物來(lái)區(qū)分內(nèi)標(biāo)與目的基因。
[0042] 用上述引物對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸均在40bp至2(K)bp的范圍中，運(yùn)可W使得能夠 在短時(shí)間內(nèi)特異性基因。探針可選用下述任一巧光標(biāo)記物在其5/端標(biāo)記：FAM、VIC、TET、 JOE、肥 乂、〔￥3、〔￥5、3(^、1?60610、了6乂48 1?60、1?60670、肥0、如333巧05等；選用下述任一澤滅 劑在其3/端標(biāo)記：6-TAMRA、BHQ-l~3、和結(jié)合分子溝的非突光澤滅劑（Minor Groove Binder nonf luorescent quencher，MGBNFQ)〇
[0043] 優(yōu)選地，所述KPC探針的5/端標(biāo)有巧光基團(tuán)FAM，KPC探針的y端標(biāo)有澤滅基團(tuán)B冊(cè)- 1;所述NDM探針的5/端標(biāo)有巧光基團(tuán)肥X，NDM探針的y端標(biāo)有澤滅基團(tuán)B冊(cè)-1;所述IMP探針 的5/端標(biāo)有巧光基團(tuán)Texsa Red, IMP探針的y標(biāo)有澤滅基團(tuán)BHQ-2;所述VIM探針的5/端標(biāo) 有巧光基團(tuán)切5，VIM探針的y端標(biāo)有澤滅基團(tuán)B冊(cè)-2;所述0XA-48探針的5