VIM重組質(zhì)粒的各種 濃度均不能被檢出。
[0157] W上結(jié)果說明該試劑盒具有較高的擴(kuò)增靈敏度與特異性。
[0158] 實(shí)施例4用于檢測耐碳青霉締類腸桿菌(CRE)試劑盒檢測感染樣本
[0159] 1、菌株
[0160] 收集武漢市協(xié)和醫(yī)院可疑耐碳青霉締類腸桿菌，用瓊脂擴(kuò)散敏感實(shí)驗(yàn)化-B法)篩 選對亞胺培南或美羅培南藥敏結(jié)果耐受或中介的腸桿菌科菌株，共計(jì)檢測到39株，具體見 表1。
[0161] 表1細(xì)菌分布科室情況
[0162]
[0163] 2、提取臨床標(biāo)本DNA
[0164] 臨床標(biāo)本DNA提取所用的試劑盒為OMEGA細(xì)菌基因組提取試劑盒，具體步驟如下：
[0165] 使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入等體積請參照瓶上的標(biāo)簽。所有離屯、 步驟均使用臺式離屯、機(jī)在常溫下離屯、。
[0166] (1)取菌培養(yǎng)液或細(xì)菌ImL，1200化pm離屯、Imin，盡量吸進(jìn)上清。
[0167] (2)向沉淀中加入溶液A，震蕩菌體充分懸浮(如果為革蘭氏陽性細(xì)菌，可W在此步 驟中加入終濃度為20mg/mL的溶菌酶），加入200μΙ lOmg/mL的RNaseA，37°C放置15-30min。 [016引 （3)向試管中加入20化lOmg/mL的蛋白酶K，混合均勻，55°C消化30-60min，期間可 顛倒離屯、管混勻數(shù)次。
[0169] (4)向試管中加入200化溶液B，75 °C條件下15-30min。
[0170] (5)向試管中加入2(K)yL無水乙醇，充分混勻，將溶液加入吸附柱中，靜置2min。
[0171] (6) 1200化pm離屯、Imin，廢棄液，將吸附柱放入收集管中。
[0172] (7)向吸附柱中加入7(Κ)化漂洗液用前檢查是否已加入無水乙醇），120(K)rpm離屯、 Imin，廢棄液，將吸附柱放入收集管中。
[0173] (8)向吸附柱中加入50化L漂洗液，12000rpm離屯、Imin，廢棄液，將吸附柱放入收集 管中。
[0174] (9) 12000巧m離屯、2min，驚干吸附柱。
[01巧](10)吸附柱中間加入20化心50化L 75°C預(yù)熱的洗脫緩沖液，靜置5min，12000巧m 離屯、2min。
[0176] (11)離屯、洗脫液重新加入吸附柱中，靜置2min，12000巧m離屯、2min，即獲得高質(zhì)量 的基因組DNA。
[0177] 上述中，溶液A、蛋白酶K、溶液B、吸附柱、漂洗液和洗脫緩沖液等均為OMEGA細(xì)菌基 因組提取試劑盒自帶產(chǎn)品或試劑。
[0178] 3、反應(yīng)體系配制
[0179]
[0180] 取34.4化的PCR反應(yīng)混合液、0.6化Taq酶和化L樣本DNA混合成為40化反應(yīng)溶液， 滿旋震蕩均勻后離屯、。
[0181] 4、巧光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)與檢測
[0182]
[0183] 巧光定量PCR反應(yīng)條件如上表所示:第一階段:94°C 5min;第二階段:94°C 20s、58°C 30s，40個(gè)循環(huán)，收集FAM/肥X信號。
[0184] 5、檢測結(jié)果
[0185] 本發(fā)明試劑盒的檢測結(jié)果顯示，針對W上每種耐碳青霉稀類腸桿菌，經(jīng)巧光定量 PCR方法檢測顯示均為陽性結(jié)果。其中部分上述耐碳青霉稀類腸桿菌為單個(gè)基因陽性，多數(shù) 為多基因檢測陽性，說明耐碳青霉稀類腸桿菌具有多種耐藥基因攜帶的情況普遍存在。通 過與傳統(tǒng)的檢測方法(瓊脂擴(kuò)散敏感實(shí)驗(yàn)化-B法））相比，本檢測試劑盒與傳統(tǒng)檢測方法一 致性好，并且能檢測耐碳青霉稀類腸桿菌的具體耐藥基因（傳統(tǒng)檢測方法不能確定）。本檢 測試劑盒和瓊脂擴(kuò)散敏感實(shí)驗(yàn)化-B法)檢測耐碳青霉稀類腸桿菌的統(tǒng)計(jì)結(jié)果參見下表2。表 2中"+"表示檢測的到，表2中空白表示沒有檢測到。根據(jù)表2中可W看出，各株菌均能檢測到 至少一種目的基因，說明運(yùn)些菌株屬于耐碳青霉稀類腸桿菌。
[0186] 表2檢測結(jié)果
[0187]
[018 引
[0189] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。







【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測耐碳青霉烯類腸桿菌的試劑盒，其特征在于，包括下述檢測引物對中的至 少一對：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述用于檢測耐碳青霉烯類腸桿菌的試劑盒，其特征在于，包括至少 一個(gè)對應(yīng)與上述檢測引物對匹配的檢測探針， 與檢測引物對1匹配的檢測探針為KPC探針： KPC探針：5'_熒光標(biāo)記物 1/GGCCGCTGGCTGGCTTTTCTGCCAC/淬滅劑-3'，如SEQ ID N0.3 所示； 與檢測引物對2匹配的檢測探針為NDM探針： NDM探針：5'-熒光標(biāo)記物2/TCGCACCGAATGTCTGGCAGCACA/淬滅劑-3'，如SEQIDN0·6所 示； 與檢測引物對3匹配的檢測探針為頂P探針： IMP探針：5 ' -熒光標(biāo)記物3/TAATTGCTTATTTTGCGTCAGTTTGGC/淬滅劑-3 '，如SEQ ID NO. 9所示； 與檢測引物對4匹配的檢測探針為V頂探針： VIM探針：5 ' -熒光標(biāo)記物4/TCGTTTGATGGCGCAGTCTACCCGTCC/淬滅劑-3 '，如SEQ ID NO. 12所示； 與檢測引物對5匹配的檢測探針為0XA-48探針： 0XA-48探針：5 ' -熒光標(biāo)記物5/ATTATTGGTAAATCCTTGCTGCTTATTC/淬滅劑-3 '，如SEQ ID NO. 15所示； 所述熒光標(biāo)記物1至熒光標(biāo)記物5選自不同的熒光標(biāo)記物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述用于檢測耐碳青霉烯類腸桿菌的試劑盒，其特征在于，還包括 PCR反應(yīng)混合液， PCR反應(yīng)混合液:Buffer 10 X緩沖液8yL、檢測引物對、檢測探針0.3μΜ和dNTP各組分 0·8mM; 檢測引物對包括KPC檢測引物對、NDM檢測引物對、MP檢測引物對、VIM檢測引物對和 OXA- 48檢測引物對，其中的上、下游檢測引物分別為0.3μΜ。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述用于檢測耐碳青霉烯類腸桿菌的試劑盒，其特征在于，還包括陽 性對照，所述陽性對照為包括檢測引物對檢測的基因的序列的DNA片段或質(zhì)粒； KPC檢測片段包括SEQ ID NO. 16所示的核苷酸序列； NDM檢測片段包括SEQ ID NO. 17所示的核苷酸序列； MP檢測片段包括SEQ ID NO. 18所示的核苷酸序列； 檢測片段包括SEQ ID NO. 19所示的核苷酸序列； 0XA-48檢測片段包括SEQIDN0.20所示的核苷酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述用于檢測耐碳青霉烯類腸桿菌的試劑盒，其特征在于，還包括陰 性對照，所述陰性對照為生理鹽水。6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述用于檢測耐碳青霉烯類腸桿菌的試劑盒在診斷或輔助性診 斷耐碳青霉烯類腸桿菌中的應(yīng)用。7. 用于檢測耐碳青霉烯類腸桿菌的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟： 將待測樣本、Taq酶加入到權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的PCR反應(yīng)混合液中，混勻，進(jìn)行熒 光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)熒光熒光定量PCR擴(kuò)增的結(jié)果分析耐碳青霉烯類腸桿菌類型。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述用于檢測耐碳青霉烯類腸桿菌的試劑盒的使用方法，其特征在 于，熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：熒光定量擴(kuò)增的反應(yīng)條件如上表所示：第一階段:94°C 5min;第二階段:94°C 20s、58 °C 30s，40個(gè)循環(huán)，收集熒光信號。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述用于檢測耐碳青霉烯類腸桿菌的試劑盒的使用方法，其特征在 于，在加入待測樣本的同時(shí)，還設(shè)定陽性對照和陰性對照。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測耐碳青霉烯類腸桿菌(CRE)的試劑盒與檢測方法。本發(fā)明中的檢測引物對選自KPC檢測引物對、NDM檢測引物對、IMP檢測引物對、VIM檢測引物對和OXA-48檢測引物對中的一對或幾對。本發(fā)明所述的試劑盒涵蓋了常見的耐碳青霉烯類基因，最低檢出1拷貝/uL。本發(fā)明所述檢測方法具有靈敏度好、特異性高、準(zhǔn)確定量等特點(diǎn)，對于日益嚴(yán)峻的CRE流行爆發(fā)進(jìn)行檢測監(jiān)控具有重要的臨床意義。
【IPC分類】C12R1/01, C12Q1/68, C12Q1/04, C12N15/11
【公開號】CN105671148
【申請?zhí)枴緾N201610028329
【發(fā)明人】張良祿, 殷雷, 洪昊巖
【申請人】武漢艾米森生命科技有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年1月15日