濾液分別進(jìn)行冷凍干燥24h，得抗凍蛋白樣品，且在-12°C保存?zhèn)溆茫?br>[0081 ] ③鑒定抗凍蛋白的抗凍活性
[0082] 將獲得的抗凍蛋白樣品分別配制成10mg/ml的蛋白溶液，取10 μ 1置于鋁制液體 坩堝中，按照下列溫控程序，通過(guò)DSC-7熱差分析儀測(cè)定蛋白溶液中抗凍蛋白的熱滯活性：
[0083] a、以2°C /min的速率由室溫降至-15°C，保持5min ;
[0084] b、以0. 5°C /min的速率由-15°C升至20°C，記錄樣品熔點(diǎn)Tm;
[0085] c、以 0· 5°C /min 的速率由 20°C 降至-15°C，保持 5min ;
[0086] d、以0. 5°C /min的速率由-15°C升至液液混合態(tài)（保留溫度Th)，保留2min ;
[0087] e、以0. 5°C /min的速率由Th降至-15°C，記錄樣品體系開(kāi)始結(jié)晶的溫度T Q;計(jì)算 熱滯活性THA = Th-Ttl;
[0088] 當(dāng)THA = 0時(shí)，抗凍蛋白樣品不具有抗凍活性，當(dāng)THA > 0時(shí)，即為高純度的抗凍 蛋白；而后采用日立835-50氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定抗凍蛋白樣品中氨基酸的含量，符合中 國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)即可；
[0089] 2)鈣離子的提取
[0090] 利用現(xiàn)有技術(shù)提取鈣離子，并將提取的鈣離子在o°c保存?zhèn)溆茫?br>[0091] 3)海藻糖的制備
[0092] 通過(guò)將酵母菌株發(fā)酵并擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集菌體脫水、干燥、粉碎，待菌體粉碎完畢 后溶于水中過(guò)濾，即得含有海藻糖的溶液；
[0093] 4)檸檬酸的制備
[0094] 通過(guò)甘油和碳源表面發(fā)酵制備檸檬酸，并將制備的檸檬酸在(TC保存?zhèn)溆茫?br>[0095] 5)組分混合配制
[0096] 將已獲得的抗凍蛋白4g與鈣離子0. 5g先添加在水中，待鈣離子與抗凍蛋白中 的氨基酸殘基充分反應(yīng)生成Ca2+-依靠型抗凍蛋白后，再添加鈣離子0. 5g，當(dāng)Ca2+-依靠型 抗凍蛋白與鈣離子再次相互接合后，抗凍蛋白分子形成了一種新的構(gòu)象，有利于形成更多 的冰晶結(jié)合域，故抗凍蛋白的THA將得到增強(qiáng)；最后將海藻糖0. 6g、檸檬酸0. 4g添加至抗 凍蛋白溶液中充分混合后制得載冷劑；通過(guò)檢測(cè)該載冷劑溶液的冰結(jié)點(diǎn)為-16. 4°C，溶液 粘度為21mm2/S，熱擴(kuò)散系數(shù)0. 387mm2/S，溶液PH為5. 5,抗凍蛋白的THA為0. 28°C，適宜 在-13°C~55°C環(huán)境溫度下使用。
[0097] 實(shí)施例3
[0098] 以載冷劑質(zhì)量百分比計(jì)，由6%抗凍蛋白、1. 5%鈣離子、0. 9%海藻糖、0. 7%檸檬 酸與水構(gòu)成載冷劑，其制備方法具體步驟如下：
[0099] 1)抗凍蛋白制備
[0100] ①抗凍蛋白粗品的制備
[0101] 稱取15g黑麥草葉片，溶解于150ml的0. 07mol/L、PH值為5. 5的HCL緩沖溶液 中，在浴鍋中保持提取溫度53°C的條件下恒溫?fù)v碎攪拌Ih并通過(guò)透析袋過(guò)濾，所得濾液在 7500r/min、4°C的條件下離心15min，取上清液，再通過(guò)透析袋內(nèi)透析后，冷凍干燥24h，得 抗凍蛋白粗品10. 821g，抗凍蛋白粗品的得率為10. 82% ;
[0102] ②抗凍蛋白純化
[0103] 將獲得的抗凍蛋白粗品IOg溶于lOOmmol/L、PH值為6的Tris-HCL洗脫緩沖液 中，并采用SePHadex G-100凝膠色譜進(jìn)行層析分離，層析柱規(guī)格為'(p I.OcmX IOcm;而后 通過(guò)洗脫緩沖液梯度洗脫進(jìn)行離子交換，先將層析分離后的濾液通過(guò)l〇〇mmol/L、PH值為6 的Tris-HCL洗脫緩沖液洗脫，再通過(guò)PH值為6、lOOmmol/L的Nacl洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫， 洗脫緩沖液流速為〇. 35ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，收集洗脫峰，而后對(duì)收集洗脫峰的濾液 分別進(jìn)行冷凍干燥24h，得抗凍蛋白樣品，且在-KTC保存?zhèn)溆茫?br>[0104] ③鑒定抗凍蛋白的抗凍活性
[0105] 將獲得的抗凍蛋白樣品分別配制成l〇mg/ml的蛋白溶液，取10 μ 1置于鋁制液體 坩堝中，按照下列溫控程序，通過(guò)DSC-7熱差分析儀測(cè)定蛋白溶液中抗凍蛋白的熱滯活性：
[0106] a、以4°C /min的速率由室溫降至-15°C，保持5min ;
[0107] b、以1°C /min的速率由-15°C升至20°C，記錄樣品熔點(diǎn)Tm;
[0108] c、以 1°C /min 的速率由 20°C 降至-15°C，保持 5min ;
[0109] d、以1°C /min的速率由-15°C升至液液混合態(tài)（保留溫度Th)，保留2min ;
[0110] e、以1°C /min的速率由Th降至-15°c，記錄樣品體系開(kāi)始結(jié)晶的溫度Ttl;計(jì)算熱 滯活性 THA = Th-Ttl;
[0111] 當(dāng)THA = 0時(shí)，抗凍蛋白樣品不具有抗凍活性，當(dāng)THA > 0時(shí)，即為高純度的抗凍 蛋白；而后采用日立835-50氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定抗凍蛋白樣品中氨基酸的含量，符合中 國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)即可；
[0112] 2)鈣離子的提取
[0113] 利用現(xiàn)有技術(shù)提取鈣離子，并將提取的鈣離子在〇°C保存?zhèn)溆茫?br>[0114] 3)海藻糖的制備
[0115] 通過(guò)將酵母菌株發(fā)酵并擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集菌體脫水、干燥、粉碎，待菌體粉碎完畢 后溶于水中過(guò)濾，即得含有海藻糖的溶液；
[0116] 4)檸檬酸的制備
[0117] 通過(guò)甘油和碳源表面發(fā)酵制備檸檬酸，并將制備的檸檬酸在〇°C保存?zhèn)溆茫?br>[0118] 5)組分混合配制
[0119] 將已獲得的抗凍蛋白6g與鈣離子0.75g先添加在水中，待鈣離子與抗凍蛋白中 的氨基酸殘基充分反應(yīng)生成Ca2+-依靠型抗凍蛋白后，再添加鈣離子0. 75g，當(dāng)Ca2+-依靠 型抗凍蛋白與鈣離子再次相互接合后，抗凍蛋白分子形成了一種新的構(gòu)象，有利于形成更 多的冰晶結(jié)合域，故抗凍蛋白的THA將得到增強(qiáng)；最后將海藻糖0. 9g、檸檬酸0. 7g添加至 抗凍蛋白溶液中充分混合后制得載冷劑；通過(guò)檢測(cè)該載冷劑溶液的冰結(jié)點(diǎn)為-12. 8°C，溶 液粘度為18mm2/S，熱擴(kuò)散系數(shù)0. 462mm2/S，溶液PH為6,抗凍蛋白的THA為0. 36°C，適宜 在-KTC~55°C環(huán)境溫度下使用。
[0120] 實(shí)施例4
[0121] 以載冷劑質(zhì)量百分比計(jì)，由8%抗凍蛋白、2%鈣離子、1.2%海藻糖、1%檸檬酸與 水構(gòu)成載冷劑，其制備方法具體步驟如下：
[0122] 1)抗凍蛋白制備
[0123] ①抗凍蛋白粗品的制備
[0124] 稱取IOg黑麥草葉片，溶解于100mL的0. 07mol/L、PH值為5. 5的HCL緩沖溶液 中，在浴鍋中保持提取溫度53°C的條件下恒溫?fù)v碎攪拌Ih并通過(guò)透析袋過(guò)濾，所得濾液在 7000r/min、4°C的條件下離心15min，取上清液，再通過(guò)透析袋內(nèi)透析后，冷凍干燥24h，得 抗凍蛋白粗品10. 26g，抗凍蛋白粗品的得率為10. 26% ;
[0125] ②抗凍蛋白純化
[0126] 將獲得的抗凍蛋白粗品IOg溶于lOOmmol/L、PH值為6的Tris-HCL洗脫緩沖液 中，并采用SePHadex G-100凝膠色譜進(jìn)行層析分離，層析柱規(guī)格為φ ].Ocm X IOcm;而后 通過(guò)洗脫緩沖液梯度洗脫進(jìn)行離子交換，先將層析分離后的濾液通過(guò)l〇〇mmol/L、PH值為6 的Tris-HCL洗脫緩沖液洗脫，再通過(guò)PH值為6、lOOmmol/L的Nacl洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫， 洗脫緩沖液流速為〇. 35ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，收集洗脫峰，而后對(duì)收集洗脫峰的濾液 分別進(jìn)行冷凍干燥24h，得抗凍蛋白樣品，且在-KTC保存?zhèn)溆茫?br>[0127] ③鑒定抗凍蛋白的抗凍活性
[0128] 將獲得的抗凍蛋白樣品分別配制成10mg/ml的蛋白溶液，取10 μ 1置于鋁制液體 坩堝中，按照下列溫控程序，通過(guò)DSC-7熱差分析儀測(cè)定蛋白溶液中抗凍蛋白的熱滯活性：
[0129] a、以4°C /min的速率由室溫降至-15°C，保持5min ;
[0130] b、以1°C /min的速率由-15°C升至20°C，記錄樣品熔點(diǎn)Tm;
[0131] c、以 1°C /min 的速率由 20°C 降至-30°C，保持 5min ;
[0132] d、以1°C /min的速率由-15°C升至液液混合態(tài)（保留溫度Th)，保留2min ;
[0133] e、以TC /min的速率由Th降至-15°C，記錄樣品體系開(kāi)始結(jié)晶的溫度Ttl;計(jì)算熱 滯活性 THA = Th-Ttl;