>[0134] 當THA = 0時，抗凍蛋白樣品不具有抗凍活性，當THA > 0時，即為高純度的抗凍 蛋白；而后采用日立835-50氨基酸自動分析儀測定抗凍蛋白樣品中氨基酸的含量，符合中 國國家標準即可；
[0135] 2)鈣離子的提取
[0136] 利用現(xiàn)有技術提取鈣離子，并將提取的鈣離子在0°C保存?zhèn)溆茫?br>[0137] 3)海藻糖的制備
[0138] 通過將酵母菌株發(fā)酵并擴大培養(yǎng)后，收集菌體脫水、干燥、粉碎，待菌體粉碎完畢 后溶于水中過濾，即得含有海藻糖的溶液；
[0139] 4)檸檬酸的制備
[0140] 通過甘油和碳源表面發(fā)酵制備檸檬酸，并將制備的檸檬酸在0°C保存?zhèn)溆茫?br>[0141] 5)組分混合配制
[0142] 將已獲得的抗凍蛋白8g與鈣離子Ig先添加在水中，待鈣離子與抗凍蛋白中的 氨基酸殘基充分反應生成Ca2+-依靠型抗凍蛋白后，再添加鈣離子lg，當Ca2+-依靠型抗凍 蛋白與鈣離子再次相互接合后，抗凍蛋白分子形成了一種新的構(gòu)象，有利于形成更多的冰 晶結(jié)合域，故抗凍蛋白的THA將得到增強；最后將海藻糖I. 2g、檸檬酸Ig添加至抗凍蛋白 溶液中充分混合后制得載冷劑；通過檢測該載冷劑溶液的冰結(jié)點為-17. 6°C，溶液粘度為 14mm2/S，熱擴散系數(shù)0. 504mm2/S，溶液PH為7,抗凍蛋白的THA為0. 51°C，適宜在-15°C~ 55°C環(huán)境溫度下使用。
[0143] 實施例5
[0144] 以載冷劑質(zhì)量百分比計，由10%抗凍蛋白、2. 5%鈣離子、1. 5%海藻糖、1. 3%檸檬 酸與水構(gòu)成載冷劑，其制備方法具體步驟如下：
[0145] 1)抗凍蛋白制備
[0146] ①抗凍蛋白粗品的制備
[0147] 稱取20g黑麥草葉片，溶解于200ml的0. 07mol/L、PH值為6的HCL緩沖溶液中， 在浴鍋中保持提取溫度55 °C的條件下恒溫搗碎攪拌Ih并通過透析袋過濾，所得濾液在 7000r/min、4°C的條件下離心15min，取上清液，再通過透析袋內(nèi)透析后，冷凍干燥24h，得 抗凍蛋白粗品13. 78g，抗凍蛋白粗品的得率為13. 78% ;
[0148] ②抗凍蛋白純化
[0149] 將獲得的抗凍蛋白粗品IOg溶于100mmol/L、PH值為6. 5的Tris-HCL洗脫緩沖液 中，并采用SePHadex G-100凝膠色譜進行層析分離，層析柱規(guī)格為φ l.OcmX IOciTh而后 通過洗脫緩沖液梯度洗脫進行離子交換，先將層析分離后的濾液通過lOOmmol/L、PH值為 6. 5的Tris-HCL洗脫緩沖液洗脫，再通過PH值為6. 5、lOOmmol/L的Nacl洗脫緩沖液進行 洗脫，洗脫緩沖液流速為〇. 35ml/min，檢測波長為220nm，收集洗脫峰，而后對收集洗脫峰 的濾液分別進行冷凍干燥24h，得抗凍蛋白樣品，且在-8°C保存?zhèn)溆茫?br>[0150] ③鑒定抗凍蛋白的抗凍活性
[0151] 將獲得的抗凍蛋白樣品分別配制成l〇mg/ml的蛋白溶液，取10 μ 1置于鋁制液體 坩堝中，按照下列溫控程序，通過DSC-7熱差分析儀測定蛋白溶液中抗凍蛋白的熱滯活性：
[0152] a、以4°C /min的速率由室溫降至-15°C，保持5min ;
[0153] b、以1°C /min的速率由-15°C升至20°C，記錄樣品熔點Tm;
[0154] c、以 1°C /min 的速率由 20°C 降至-15°C，保持 5min ;
[0155] d、以1°C /min的速率由-15°C升至液液混合態(tài)（保留溫度Th)，保留2min ;
[0156] e、以1°C /min的速率由Th降至-15°C，記錄樣品體系開始結(jié)晶的溫度Ttl;計算熱 滯活性 THA = Th-Ttl;
[0157] 當THA = 0時，抗凍蛋白樣品不具有抗凍活性，當THA > 0時，即為高純度的抗凍 蛋白；而后采用日立835-50氨基酸自動分析儀測定抗凍蛋白樣品中氨基酸的含量，符合中 國國家標準即可；
[0158] 2)鈣離子的提取
[0159] 利用現(xiàn)有技術提取鈣離子，并將提取的鈣離子在0°C保存?zhèn)溆茫?br>[0160] 3)海藻糖的制備
[0161] 通過將酵母菌株發(fā)酵并擴大培養(yǎng)后，收集菌體脫水、干燥、粉碎，待菌體粉碎完畢 后溶于水中過濾，即得含有海藻糖的溶液；
[0162] 4)檸檬酸的制備
[0163] 通過甘油和碳源表面發(fā)酵制備檸檬酸，并將制備的檸檬酸在0°C保存?zhèn)溆茫?br>[0164] 5)組分混合配制
[0165] 將已獲得的抗凍蛋白IOg與鈣離子I. 5g先添加在水中，待鈣離子與抗凍蛋白中的 氨基酸殘基充分反應生成Ca2+-依靠型抗凍蛋白后，再添加鈣離子lg，當Ca2+-依靠型抗凍 蛋白與鈣離子再次相互接合后，抗凍蛋白分子形成了一種新的構(gòu)象，有利于形成更多的冰 晶結(jié)合域，故抗凍蛋白的THA將得到增強；最后將海藻糖I. 5g、檸檬酸I. 3g添加至抗凍蛋 白溶液中充分混合后制得載冷劑；通過檢測該載冷劑溶液的冰結(jié)點為-10. 1°C，溶液粘度 為llmm2/S，熱擴散系數(shù)0. 528mm2/S，溶液PH為8,抗凍蛋白的THA為0. 6°C，適宜在_7°C~ 55°C環(huán)境溫度下使用。
[0166] 實施例6
[0167] 以載冷劑質(zhì)量百分比計，由12%抗凍蛋白、3%鈣離子、1. 8%海藻糖、1. 7%檸檬酸 與水構(gòu)成載冷劑，其制備方法具體步驟如下：
[0168] 1)抗凍蛋白制備
[0169] ①抗凍蛋白粗品的制備
[0170] 稱取15g黑麥草葉片，溶解于150ml的0. 07mol/L、PH值為6的HCL緩沖溶液中， 在浴鍋中保持提取溫度55 °C的條件下恒溫搗碎攪拌Ih并通過透析袋過濾，所得濾液在 7500r/min、4°C的條件下離心15min，取上清液，再通過透析袋內(nèi)透析后，冷凍干燥24h，得 抗凍蛋白粗品12. 34g，抗凍蛋白粗品的得率為12. 34% ;
[0171] ②抗凍蛋白純化
[0172] 將獲得的抗凍蛋白粗品IOg溶于100mmol/L、PH值為6. 7的Tris-HCL洗脫緩沖液 中，并采用SePHadex G-100凝膠色譜進行層析分離，層析柱規(guī)格為鄧LOcmX IOcm;而后 通過洗脫緩沖液梯度洗脫進行離子交換，先將層析分離后的濾液通過lOOmmol/L、PH值為 6. 7的Tris-HCL洗脫緩沖液洗脫，再通過PH值為6. 7、lOOmmol/L的Nacl洗脫緩沖液進行 洗脫，洗脫緩沖液流速為〇. 35ml/min，檢測波長為220nm，收集洗脫峰，而后對收集洗脫峰 的濾液分別進行冷凍干燥24h，得抗凍蛋白樣品，且在-4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0173] ③鑒定抗凍蛋白的抗凍活性
[0174] 將獲得的抗凍蛋白樣品分別配制成lOmg/ml的蛋白溶液，取10 μ 1置于鋁制液體 坩堝中，按照下列溫控程序，通過DSC-7熱差分析儀測定蛋白溶液中抗凍蛋白的熱滯活性：
[0175] a、以4°C /min的速率由室溫降至-15°C，保持5min ;
[0176] b、以1°C /min的速率由-15°C升至20°C，記錄樣品熔點Tm;
[0177] c、以 1°C /min 的速率由 20°C 降至-15°C，保持 5min ;
[0178] d、以1°C /min的速率由-15°C升至液液混合態(tài)（保留溫度Th)，保留2min ;
[0179] e、以1°C /min的速率由Th降至-15°C，記錄樣品體系開始結(jié)晶的溫度Ttl;計算熱 滯活性 THA = Th-Ttl;
[0180] 當THA = 0時，抗凍蛋白樣品不具有抗凍活性，當THA > 0時，即為高純度的抗凍 蛋白；而后采用日立835-50氨基酸自動分析儀測定抗凍蛋白樣品中氨基酸的含量，符合中 國國家標準即可；
[0181] 2)鈣離子的提取
[0182] 利用現(xiàn)有技術提取鈣離子，并將提取的鈣離子在0°C保存?zhèn)溆茫?br>[0183] 3)海藻糖的制備
[0184] 通過將酵母菌株發(fā)酵并擴大培養(yǎng)后，收集菌體脫水、干燥、粉碎，待菌體粉碎完畢 后溶于水中過濾，即得含有海藻糖的溶液；
[0185] 4)檸檬酸的制備
[0186] 通過甘油和碳源表面發(fā)酵制備檸檬酸，并將制備的檸檬酸在(TC保存?zhèn)溆茫?br>[0187] 5)組分混合配制
[0188] 將已獲得的抗凍蛋白12g與鈣離子2g先添加在水中，待鈣離子與抗凍蛋白中的氨 基酸殘基充分反應生成Ca2+-依靠型抗凍蛋白后，再添加鈣離子lg，當Ca2+-依靠型抗凍蛋 白與鈣離子再