本發(fā)明屬于色譜分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用感光高分子聚合物重氮樹脂在二氧化硅微球表面修飾環(huán)糊精進(jìn)行改性的HPLC手性固定相及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著社會的進(jìn)步與發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到手性藥物與生活息息相關(guān)，而手性藥物在醫(yī)藥市場的份額也逐年攀升。隨著人們對手性藥物需求的急劇增加，建立快速的手性分離方法，對藥代動力學(xué)研究和手性藥物產(chǎn)品質(zhì)量控制都具有十分重要的意義。目前，色譜法已成為光學(xué)拆分最有用的方法。這些方法包括氣相色譜法，薄層色譜法，超臨界流體色譜法，毛細(xì)管電泳，逆流色譜，離心分配色譜法，高效液相色譜法(HPLC)。高效液相色譜憑借著其高效、高靈敏度、分析速度快、運用范圍廣等優(yōu)勢成為手性分離領(lǐng)域一項重要技術(shù)。

液相色譜法手性拆分依據(jù)其原理可分為手性衍生法、手性流動相法和手性固定相法。手性固定相法是基于樣品與固定相表面的手性選擇劑形成暫時的非對映體配合物的能量差異或穩(wěn)定性不同而達(dá)到手性分離，是不經(jīng)過轉(zhuǎn)變成非對映體的直接拆分的方法。手性固定相拆分法的優(yōu)點是制備方便，能適用于各類化合物的拆分。手性固定相法是目前最具優(yōu)勢的光學(xué)異構(gòu)體拆分方法。

在手性色譜分離中，一種理想的手性固定相應(yīng)具備以下優(yōu)點：分離范圍廣，適應(yīng)多種結(jié)構(gòu)類型的對映體分離；分析速度快，分離速率高，能快速、準(zhǔn)確測定對映體的純度；分離具有特定性；分離選擇性和柱容量較高，具有制備分離能力。在過去的幾年中，大量的手性固定相得到了開發(fā)與應(yīng)用，已合成的商品手性固定相多達(dá)上百種，但迄今為止，還沒有一種手性固定相能同時滿足上述各方面的要求。

β環(huán)糊精(Cyclodextrins，βCD)是由一定數(shù)量的葡萄糖單元通過α-1，4-糖苷鍵連接而成的環(huán)狀分子。分子整體上具有環(huán)內(nèi)疏水和環(huán)外親水的特性和較強的手性識別能力而在手性藥物的分離中占有比較重要的地位。Armstrong等率先通過烷基化、?；桶被姿狨セ黾恿诵碌氖中宰R別位點，使環(huán)糊精類固定相的手性色譜性能有較大的提高。而用不同的衍生化試劑對βCD的羥基進(jìn)行修飾，可以提高鍵合相與手性分子之間的作用力，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。環(huán)糊精類色譜固定相一般是將βCD或其衍生物鍵合到硅膠基質(zhì)上，硅膠先經(jīng)過硅烷化試劑預(yù)處理，常用的硅烷化試劑有γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)、y-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)和γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH570)。βCD經(jīng)過修飾后，常連有氨基、羥基、烯基或環(huán)氧基官能團(tuán)，可與硅烷化硅膠鍵合；也有采用硅烷化試劑將βCD衍生化，再在無水條件下與硅膠的硅羥基反應(yīng)，即將βCD連接到硅膠基質(zhì)上。

CN103601823A公開了一種β開環(huán)糊精手性固定相的制備方法，以SiO₂微球為原料，通過γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)，三甲基氯硅烷，4,4’-二苯基甲烷二異氰酸酯(MDI)，將β-環(huán)糊精鍵合到SiO₂微球表面，得到一種β-環(huán)糊精手性固定相。CN104841408A公開了一種環(huán)糊精手性固定相及其制備方法與應(yīng)用，通過點擊反應(yīng)制備巰基-乙烯基鍵合環(huán)糊精手性固定相手性色譜填料，通過對環(huán)糊精6位的選擇性改性和硅膠的巰基化處理，利用高效催化劑通過點擊反應(yīng)進(jìn)而制備化學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)異的巰基-乙烯基鍵合的環(huán)糊精手性固定相。以上兩種方法在制備環(huán)糊精手性固定相時均使用了硅烷偶聯(lián)劑，而改性過程中常用的硅烷偶聯(lián)劑往往具有一定的毒性并且對水敏感，需要控制在無水條件下使用，相對苛刻，而且過程繁瑣，耗時較長；另外，這些因素會引起環(huán)境污染等問題，大大限制了其應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于現(xiàn)有HPLC手性固定相制備方法復(fù)雜耗時且環(huán)境不友好，進(jìn)而提供一種新型HPLC手性固定相的制備方法，該制備方法利用無毒的感光高分子重氮樹脂取代硅烷偶聯(lián)劑，先將βCD接枝到聚丙烯酸(PAA)鏈上以增加其水溶性，然后將βCD修飾到二氧化硅上，從而在微球表面引入手性識別基團(tuán)，反應(yīng)條件溫和，時間短，易操作，且改性后的色譜柱填料具有良好的手性分離效果。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種HPLC手性固定相的制備方法，包括下述步驟：

S1、將二氧化硅微球均勻分散于重氮樹脂溶液中，室溫下避光攪拌2-4小時，離心分離后用水洗滌微球；

S2、將步驟S1的產(chǎn)物置于β-環(huán)糊精/聚丙烯酸復(fù)合物溶液中，室溫下避光攪拌2-4小時，離心分離后用水洗滌微球；

S3、將步驟S2的微球干燥后置于紫外光下曝光處理10-20min，得到可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球。

所述制備方法還包括：

S0、將二氧化硅微球均勻地分散在濃度為0.08-0.12mol/L的鹽酸溶液中進(jìn)行活化處理15-45min，離心分離后用水洗滌微球至中性。

所述二氧化硅微球為平均粒徑1-3μm的單分散性微球。

所述步驟S1中重氮樹脂溶液為8-12mg/mL的重氮樹脂水溶液，所述步驟S2中β-環(huán)糊精/聚丙烯酸復(fù)合物溶液為8-12mg/mL的β-環(huán)糊精/聚丙烯酸復(fù)合物水溶液。所述步驟S0、S1、S2中用水洗滌微球是用去離子水洗滌微球2-4次。所述步驟S3中微球干燥是將微球放入真空箱中進(jìn)行室溫干燥12-14小時。

一種所述方法制備得到的HPLC手性固定相。

所述的HPLC手性固定相在分離手性物質(zhì)中的應(yīng)用，包括下述步驟：

將HPLC手性固定相用裝柱機填注到不銹鋼色譜柱中，在柱溫為20～30℃、流速為0.2mL/min條件下，對手性物質(zhì)樣品進(jìn)行高效液相色譜分離。

所述的手性物質(zhì)樣品為酒石酸美托洛爾、異丙嗪、二氧丙嗪或撲爾敏。

本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明提供的HPLC手性固定相制備方法為利用感光高分子重氮樹脂將βCD接到SiO₂微球表面。光照后，重氮樹脂與硅羥基之間的氫鍵作用、重氮樹脂與環(huán)糊精表面羥基之間的氫鍵作用轉(zhuǎn)化為共價鍵作用，從而使βCD穩(wěn)定的接到微球表面，得到βCD-PAA@SiO₂微球。βCD-PAA@SiO₂微球用作液相色譜柱填料，對手性藥物有較強的拆分能力。此制備方法簡便且效率高，改性后的色譜柱填料具有良好的分離效果。

(2)本發(fā)明的原料二氧化硅微球采用鹽酸進(jìn)行活化處理，活化的目的在于提高二氧化硅微球表面的硅羥基含量，使其穩(wěn)定均勻存在，提高后續(xù)修飾的改性率。

(3)采用本發(fā)明的方法，工藝設(shè)備簡單，重復(fù)性好，所用原料易得，生產(chǎn)成本低且效率高；此外，本發(fā)明采用的感光高分子重氮樹脂，與傳統(tǒng)硅烷偶聯(lián)劑相比，具有無毒害，易合成，環(huán)境友好性等特點。

(4)通過本發(fā)明方法改性的單分散二氧化硅微球，作為高效液相色譜柱填料，在不同流動相模式下對多種手性藥物對映體實現(xiàn)了基線分離，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為實施例1所用的單分散二氧化硅微球的掃描電鏡圖片；

圖2為實施例1所得的改性與未改性的二氧化硅微球的傅立葉變換紅外光譜分析曲線圖片；

圖3為應(yīng)用例1所得的高效液相色譜的分離譜圖；

圖4為應(yīng)用例2所得的高效液相色譜的分離譜圖；

圖5為應(yīng)用例3所得的高效液相色譜的分離譜圖；

圖6為應(yīng)用例4所得的高效液相色譜的分離譜圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。本發(fā)明可以以許多不同的形式實施，而不應(yīng)該被理解為限于在此闡述的實施例。相反，提供這些實施例，使得本公開將是徹底和完整的，并且將把本發(fā)明的構(gòu)思充分傳達(dá)給本領(lǐng)域技術(shù)人員，本發(fā)明將僅由權(quán)利要求來限定。

掃描電鏡照片由JEOLJSM-6390LV型掃描電鏡測得。

傅立葉變換紅外光譜分析圖片由Nicolet6700型紅外光譜儀測得。

高效液相色譜圖由青島七彩虹SEV P500型液相色譜儀測得。

實施例1-4中使用的重氮樹脂具有式(1)所示結(jié)構(gòu)：

其中n為3-6的整數(shù)。

實施例1-4中使用的β-環(huán)糊精/聚丙烯酸復(fù)合物βCD-PAA具有式(2)所示結(jié)構(gòu)：

式(2)中黑色鈴鐺狀物即為β環(huán)糊精。

所選βCD-PAA復(fù)合物，其制備過程如下：將0.5g氨基化β基環(huán)糊精，0.2g二環(huán)己基碳二亞胺，1.4gPAA加入40mL1-甲基-2-吡咯烷酮，60℃反應(yīng)12h，將產(chǎn)物過濾并用甲醇洗滌三遍即可。

實施例1

本實施例的HPLC手性固定相的制備方法，包括下述步驟：

S0、二氧化硅微球的活化處理：

將2g平均粒徑為2μm的單分散二氧化硅微球均勻地分散在濃度為0.1mol/L的鹽酸水溶液中處理30min，離心分離并將二氧化硅微球用去離子水洗滌至中性；

S1、對活化處理后的二氧化硅微球進(jìn)行改性：

將活化后的二氧化硅微球置于濃度為10mg/mL的重氮樹脂水溶液中，室溫下避光、磁力攪拌3小時，離心分離后將微球用去離子水洗滌3次；

S2、將步驟S1得到的微球置于濃度為10mg/mL的βCD-PAA水溶液中，室溫下避光、磁力攪拌3小時，離心分離后將微球用去離子水洗滌3次。

S3、將步驟S2得到的微球放于真空干燥箱中室溫干燥12h，將干燥后的微球置于紫外光下曝光處理15min，得到可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂。本實施例的重氮樹脂為式(1)所示結(jié)構(gòu)，其中n＝4。

發(fā)明人采用掃描電子顯微鏡對所選的二氧化硅微球原料進(jìn)行了微觀形貌分析，如圖1所示，從圖中可以看出，微球單分散性好，粒徑均一，微球的粒徑約為2μm；另外，采用傅里葉變換紅外光譜法對改性與未改性的二氧化硅微球的紅外光譜圖進(jìn)行了分析，如圖2所示，其中a線為改性前二氧化硅微球的紅外分析譜圖，b線為表面修飾βCD-PAA后的二氧化硅微球的紅外分析譜圖，圖中1093cm^-1處是二氧化硅中Si-O振動峰，1639cm^-1和1384cm^-1處是環(huán)糊精上C-H振動吸收峰。

實施例2

本實施例的HPLC手性固定相的制備方法，包括下述步驟：

S0、二氧化硅微球的活化處理：

將2g平均粒徑為3μm的單分散二氧化硅微球均勻地分散在濃度為0.08mol/L的鹽酸水溶液中處理45min，離心分離并將二氧化硅微球用去離子水洗滌至中性；

S1、對活化處理后的二氧化硅微球進(jìn)行改性：

將活化后的二氧化硅微球置于濃度為12mg/mL的重氮樹脂水溶液中，室溫下避光、磁力攪拌2小時，離心分離后將微球用去離子水洗滌3次；

S2、將步驟S1得到的微球置于濃度為12mg/mL的βCD-PAA水溶液中，室溫下避光、磁力攪拌2小時，離心分離后將微球用去離子水洗滌3次。

S3、將步驟S2得到的微球放于真空干燥箱中室溫干燥12h，將干燥后的微球置于紫外光下曝光處理20min，得到可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂。

本實施例的重氮樹脂為式(1)所示結(jié)構(gòu)，其中n＝5。

實施例3

本實施例的HPLC手性固定相的制備方法，包括下述步驟：

S0、將2g平均粒徑為1μm的單分散二氧化硅微球均勻地分散在濃度為0.12mol/L的鹽酸水溶液中處理15min，離心分離并將二氧化硅微球水洗至中性；

S1、對活化處理后的二氧化硅微球進(jìn)行改性：

將活化后的二氧化硅微球置于濃度為8mg/mL的重氮樹脂水溶液中，室溫下避光、磁力攪拌4小時，離心分離后將微球用去離子水洗滌3次；

S2、將步驟S1得到的微球置于濃度為8mg/mL的βCD-PAA水溶液中，室溫下避光、磁力攪拌4小時，離心分離后將微球用去離子水洗滌3次。

S3、將步驟S2得到的微球放于真空干燥箱中室溫干燥13h，將干燥后的微球置于紫外光下曝光處理15min，得到可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂。

本實施例的重氮樹脂為式(1)所示結(jié)構(gòu)，其中n＝6。

實施例4

本實施例的HPLC手性固定相的制備方法，包括下述步驟：

S0、二氧化硅微球的活化處理：

將2g平均粒徑為1μm的單分散二氧化硅微球均勻地分散在濃度為0.12mol/L的鹽酸水溶液中處理30min，離心分離并將二氧化硅微球水洗至中性；

S1、對活化處理后的二氧化硅微球進(jìn)行改性：

將活化后的二氧化硅微球置于濃度為12mg/mL的重氮樹脂水溶液中，室溫下避光、磁力攪拌3小時，離心分離后將微球用去離子水洗滌3次；

S2、將步驟S1得到的微球置于濃度為12mg/mL的βCD-PAA水溶液中，室溫下避光、磁力攪拌3小時，離心分離后將微球用去離子水洗滌3次。

S3、將步驟S2得到的微球放于真空干燥箱中室溫干燥14h，將干燥后的微球置于紫外光下曝光處理15min，得到可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂。

本實施例的重氮樹脂為式(1)所示結(jié)構(gòu)，其中n＝3。

應(yīng)用例1

將實例1所得的可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂在40Mpa壓力下用裝柱機填到長度為100mm，直徑為4.6mm的不銹鋼色譜柱中，以乙腈作為流動相，在0.2mL/min的流速下，對手性藥物酒石酸美托洛爾進(jìn)行了高效液相色譜分離，并在250nm波長的紫外檢測條件下對分離物質(zhì)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如附圖3所示，圖3顯示具有兩個清晰的波峰，這說明酒石酸美托洛爾的(S)-對映體和(R)-對映體實現(xiàn)了分離，因此修飾后的微球手性固定相作為色譜柱填料具有良好的手性分離效果。需要說明的是，如果酒石酸美托洛爾的(S)-對映體和(R)-對映體沒有被分離開，則檢測結(jié)果將只出現(xiàn)一個波峰。

應(yīng)用例2

將實例1可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂在40Mpa壓力下用裝柱機填到長度為100mm，直徑為4.6mm的不銹鋼色譜柱中，以乙腈-TEAA(二者體積比7:3)(TEAA為乙酸和三乙胺的混合水溶液，其中三乙胺在TEAA中的濃度為0.3％，TEAA的PH為4)作為流動相，在0.2mL/min的流速下，對手性藥物異丙嗪進(jìn)行了高效液相色譜分離，并在250nm波長的紫外檢測條件下對分離物質(zhì)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如附圖4所示。

圖4顯示具有兩個清晰的波峰，這說明手性藥物異丙嗪的(S)-對映體和(R)-對映體實現(xiàn)了分離，因此修飾后的微球手性固定相作為色譜柱填料具有良好的手性分離效果。需要說明的是，如果手性藥物異丙嗪的(S)-對映體和(R)-對映體沒有被分離開，則檢測結(jié)果將只出現(xiàn)一個波峰。

應(yīng)用例3

將實例1可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂在40Mpa壓力下用裝柱機填到長度為100mm，直徑為4.6mm的不銹鋼色譜柱中，以乙腈-TEAA(二者體積比7:3)(TEAA為乙酸和三乙胺的混合水溶液，其中三乙胺在TEAA中的濃度為0.3％，TEAA的PH為4)作為流動相，在0.2mL/min的流速下，對手性藥物二氧丙嗪進(jìn)行了高效液相色譜分離，并在250nm波長的紫外檢測條件下對分離物質(zhì)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如附圖5所示。

圖5顯示具有兩個清晰的波峰，這說明手性藥物二氧丙嗪的(S)-對映體和(R)-對映體實現(xiàn)了分離，因此修飾后的微球手性固定相作為色譜柱填料具有良好的手性分離效果。需要說明的是，如果手性藥物二氧丙嗪的(S)-對映體和(R)-對映體沒有被分離開，則檢測結(jié)果將只出現(xiàn)一個波峰。

應(yīng)用例4

將實例1可用作HPLC手性固定相的改性二氧化硅微球βCD-PAA@SiO₂在40Mpa壓力下用裝柱機填到長度為100mm，直徑為4.6mm的不銹鋼色譜柱中，以甲醇-TEAA(7:3)(其中TEAA為0.3％PH 4)作為流動相，在0.2mL/min的流速下，對手性藥物撲爾敏進(jìn)行了高效液相色譜分離，并在250nm波長的紫外檢測條件下對分離物質(zhì)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如附圖6所示。

圖6顯示具有兩個清晰的波峰，這說明手性藥物撲爾敏的(S)-對映體和(R)-對映體實現(xiàn)了分離，因此修飾后的微球手性固定相作為色譜柱填料具有良好的手性分離效果。需要說明的是，如果手性藥物撲爾敏的(S)-對映體和(R)-對映體沒有被分離開，則檢測結(jié)果將只出現(xiàn)一個波峰。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。