加快鳳陽產(chǎn)氣霉生長的方法及所用的預處理后活性炭顆粒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領域，尤其是提供一種用活性炭吸附加快鳳陽產(chǎn)氣霉生長 的方法。
【背景技術】
[0002] 產(chǎn)氣霉（Muscodor spp.)(現(xiàn)在也稱麝香霉）是一類屬于炭角菌科的內(nèi)生真菌， 最早由Worapong等（2001)從肉桂樹分離所得，其顯著特征是能產(chǎn)生揮發(fā)性有機化合物 (volatile organic compounds，簡稱VOCs)，這些VOCs具有廣泛的生物活性，能抑制或殺死 許多病原真菌、病原細菌和一些昆蟲。而后，人們利用其特有的形態(tài)學、生理學、生物化學方 面的特征及核糖體RNA的序列來尋找和鑒定新的產(chǎn)氣霉屬內(nèi)生真菌，越來越多的產(chǎn)氣霉種 被發(fā)現(xiàn)。由于產(chǎn)氣霉能產(chǎn)生有廣泛抑菌活性的VOCs，科學家們利用GC-MS等化學分析手段 分離鑒定了產(chǎn)氣霉產(chǎn)生的VOCs成分，發(fā)現(xiàn)不同菌株產(chǎn)生的VOCs成分不盡相同。盡管VOCs 具有廣泛的抑菌活性，而產(chǎn)氣霉自身生長速度非常緩慢，在工業(yè)發(fā)酵上成為難以突破的瓶 頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種加快鳳陽產(chǎn)氣霉生長的方法及所用的預處 理后活性炭顆粒。
[0004] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種用于加快鳳陽產(chǎn)氣霉生長的預處理后活 性炭顆粒，其制備方法為依次進行以下步驟：
[0005] 1)、加熱洗滌：
[0006] 在活性炭顆粒中加入去離子水后煮沸，棄去廢液后，得初次洗滌后活性炭顆粒；
[0007] 2)、超聲波清洗：
[0008] 在初次洗滌后活性炭顆粒中加入去離子水進行超聲波清洗，棄去廢液后，得二次 洗滌后活性炭顆粒；
[0009] 3)、將二次洗滌后活性炭顆粒用去離子水反復清洗，直至洗滌液中無肉眼可見渾 濁；
[0010] 4)、將步驟3)所得的活性炭顆粒瀝干水分后于50~70°C (較佳為60°C )烘干至 恒重。
[0011] 作為本發(fā)明的用于加快鳳陽產(chǎn)氣霉生長的預處理后活性炭顆粒的改進：
[0012] 所述步驟1)的加熱洗滌重復3~5次后，再進行步驟2)。
[0013] 作為本發(fā)明的用于加快鳳陽產(chǎn)氣霉生長的預處理后活性炭顆粒的進一步改進：
[0014] 所述步驟1)中：活性炭顆粒與去離子水的用量比為Ig :4~6ml，煮沸時間為20~ 40min ；
[0015] 所述步驟2)中：于53KHZ超聲波清洗儀進行清洗，清洗時間為20~40min (例如 為30min)。去離子水與步驟1)中的活性炭顆粒的用量比為8~10ml :lg。
[0016] 本發(fā)明還同時提供了利用上述預處理后活性炭顆粒進行加快鳳陽產(chǎn)氣霉生長的 方法，在鳳陽產(chǎn)氣霉生長環(huán)境中配設預處理后活性炭顆粒（目的是為了吸附鳳陽產(chǎn)氣霉生 長過程中所產(chǎn)生的VOCs)。一般而言，每100g培養(yǎng)基配設20~30g預處理后活性炭顆粒。
[0017] 備注說明：上述預處理后活性炭顆粒實際使用前，需高壓（1.05X 105Pa、12rC ) 滅菌鍋中滅菌30min，烘干（60°C烘干至恒重）。然后才能放入鳳陽產(chǎn)氣霉生長環(huán)境中。
[0018] 作為本發(fā)明的加快鳳陽產(chǎn)氣霉生長的方法的改進：鳳陽產(chǎn)氣霉的生長方式為平皿 生長或發(fā)酵生長。
[0019] 在本發(fā)明中，活性炭顆粒的粒徑約為200目。例如可選用滬試牌顆粒活性炭（編 號 7440440)。
[0020] 本發(fā)明所述的鳳陽產(chǎn)氣霉為Muscodor sp. ZJLQ024 (亦名：Muscodor. fengyangensis ZJLQ024)，在專利號為 200910153512. 0 的發(fā)明《Muscodorsp.屬植物內(nèi)生 真菌ZJLQ024及其用途和殺菌劑》中有明確告知，保藏號為CGMCC No. 2863。
[0021] 產(chǎn)氣霉因其產(chǎn)生的VOCs對多數(shù)細菌、真菌及昆蟲具有抑制甚至殺死作用，其作為 生物防治制劑具有很大的應用潛力，目前在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥及工業(yè)應用上受到越來越多科技工 作者的重視。鳳陽產(chǎn)氣霉Muscodor. fengyangensis ZJLQ024在培養(yǎng)的過程中生長十分慢， 是由于產(chǎn)生的VOCs成分抑制了自身的生長。本發(fā)明采用預處理后活性炭吸附的方法，證明 活性炭吸附對鳳陽產(chǎn)氣霉為Muscodor sp. ZJLQ024生長有促進作用，為鳳陽產(chǎn)氣霉快速發(fā) 酵提供指導意義。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)點是：在鳳陽產(chǎn)氣霉生長過程中，提供活性炭吸附VOCs的方法，使有 抑菌活性的VOCs部分被活性炭吸附，從而減緩VOCs對鳳陽產(chǎn)氣霉生長的影響而加快鳳陽 產(chǎn)氣霉的生長。
【附圖說明】
[0023] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0024] 圖1為不同條件下生長的鳳陽產(chǎn)氣霉ZJLQ024(培養(yǎng)8天）；
[0025] 圖2為鳳陽產(chǎn)氣霉ZJLQ024生長曲線；
[0026] 圖3為有無活性炭的鳳陽產(chǎn)氣霉ZJLQ024對峙病原指示菌效果對比；
[0027] 對峙病原指示菌從上至下依次為青霉菌（KH8)、灰霉（ZAU10)、立枯絲核菌 (ZAU05)、桃子褐腐菌（TZ01);
[0028] 圖4為固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用測定的鳳陽產(chǎn)氣霉ZJLQ024揮發(fā)性有機化合物的總 離子流圖；
[0029] 圖5為固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用測定的加活性炭的處理組產(chǎn)氣霉Z幾 Q024揮發(fā)性有 機化合物的GC-MS總離子流圖；
[0030] 圖6為加入活性炭（左圖）和不加活性炭（CK，右圖）的固體發(fā)酵產(chǎn)物的生長對 比。
【具體實施方式】
[0031] 材料：供試菌株為鳳陽產(chǎn)氣霉Muscodor fengyangensis ZJLQ024。
[0032] 病原指不菌包括：KH8 青霉菌 Penicillium expansum ;ZAU10 灰霉菌 Botrytis cinerea;ZAU05立枯絲核菌Rhizoctonia solani ;TZ01 桃子褐腐菌Monilinia fructicola 等；
[0033] 活性炭來源為滬試牌顆?；钚蕴浚ň幪?440440)，該試劑大小約為200目，黑色無 定形粒狀物或細微粉末。無臭。無味。無砂性。不溶于任何溶劑。對各種氣體有選擇性的 吸附能力，對有機色素和含氮堿有高容量吸附能力，每g總表面積可達500~1000m2,相對 密度約1. 9~2. 1，表觀相對密度約0. 08~0. 45。
[0034] 本發(fā)明所涉及的儀器包括超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、pH計、烘箱、 電磁爐、微波爐、冰箱、真空干燥箱、GRT-20D型50L固體發(fā)酵罐、超聲波儀、Agi I ent 6890N-5975B型GC-MS儀、MLS3750型高壓滅菌鍋、BS233S型分析天平、頂空固相微萃取裝 置等。
[0035] 本發(fā)明涉及五種培養(yǎng)基，分別為PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、冷凍保存培 養(yǎng)基和麥粒固體發(fā)酵培養(yǎng)基，其配制方法分別如下：
[0036] PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂L 5% (即， 15g瓊脂），自來水1000mL。取定量土豆切成均勻小塊，加水煮沸至土豆用玻璃棒一戳擊破， 8層紗布過濾，加入20g葡萄糖，冷卻，加自來水定容至lOOOmL，三角瓶裝1. 5%的瓊脂，加入 液體，封裝，121°C、15min高壓滅菌。
[0037] PDB培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基）：土豆200g，葡萄糖20g，自來水1000mL。取定 量土豆切成均勻小塊，加水煮沸至土豆用玻璃棒一戳擊破，8層紗布過濾，加入20g葡萄糖， 冷卻，加自來水定容至lOOOmL，封裝，121°C、15min高壓滅菌。
[0038] 察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉 3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂（MgS04. 7H20)0. 5g，氯化鉀0. 5g， 硫酸亞鐵0. 〇lg，蔗糖30g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。將離子化合物硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫 酸鎂、氯化鉀及硫酸亞鐵加離子水配成母液，用無菌過濾器過濾液體。其余如蔗糖，瓊脂，蒸 餾水按比例裝瓶，121°C、15min高壓滅菌。將其溶解后倒在培養(yǎng)皿前，將無機離子化合物混 合液按比例與培養(yǎng)基混合。
[0039] 冷凍保存培養(yǎng)基（液體）：葡萄糖10g，酵母提取物lg，酸水解酪蛋白0. 5g，丙三醇 (甘油）180mL。用蒸餾水將葡萄糖、酵母提取物、酸水解酪蛋白溶解后，再加入甘油、最后用 蒸餾水定容至lOOOmL，121°C、滅菌20min。
[0040] 麥粒固體發(fā)酵培養(yǎng)基：取一定量麥粒加自來水浸泡過夜，浸泡時間7-9h左右。倒 掉麥粒多余的水分，l〇〇g麥粒裝至IL的三角瓶，121 °C、40min連續(xù)高壓滅菌兩次。
[0041] 實施例1、菌株的保存和活化培養(yǎng)（屬于常規(guī)技術）
[0042] 1、菌株的常溫或低溫保存
[0043] 在超凈工作臺，于2ml無菌冷凍保存管加入不超過I. 5ml融化的PDA培養(yǎng)基，蓋 蓋，傾斜放置。待凝固后，將保存的菌株接種到斜面培養(yǎng)基，數(shù)天后，菌絲成功定殖于斜面， 可見新鮮的菌絲長出，加入經(jīng)3次高壓滅菌的石蠟將菌絲淹沒，蓋蓋，于常溫下或KTC冰箱 保存。使用時，用無菌牙簽挑取菌組織，接種于平板PDA培養(yǎng)基上進行活化。
[0044] 2、菌株的冷凍保存
[0045] 于超凈工作臺，在PDA上的菌落挖取4-5塊菌塊，置于2ml無菌冷凍保存管，加入 高壓滅菌的冷凍保存液，將菌塊淹沒。蓋蓋，將冷凍保存管依次于4°C和-20 °C下放置Ih后， 轉(zhuǎn)移至-80°C超低溫冰箱中進行長期保存。使用時，于室溫中自然解凍，挑取其中的菌塊接 種于平板PDA培養(yǎng)基上進行活化。
[0046] 3、菌株的活化
[0047] 用牙簽從保存菌株的冷凍保存管中取得菌塊，將其接種到PDA培養(yǎng)基，封口膜封 口于25 °C，黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0048] 實施例2、活性炭的預處理
[0049] 為保證活性炭的高吸附活性，活性炭進行如下預處理，依次進行以下步驟：
[0050] 1)、加熱洗滌：
[0051] 稱取100g剛開封的