定量檢測(cè)全血中肌鈣蛋白i的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)和微流控芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)全血樣本中cTnl高靈敏定量檢測(cè)的方法，特別公開了一種定量檢測(cè)全血中肌鈣蛋白I的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片，可實(shí)現(xiàn)全血樣本中cTnl的準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測(cè)，屬于微流控芯片化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)前我國(guó)心血管疾病的防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻，心血管疾病發(fā)病率呈不斷上升態(tài)勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，心血管病死亡率占人口死亡的40%，因此做好早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早救治，提高心血管病防治水平是關(guān)鍵。心血管疾病傳統(tǒng)檢測(cè)項(xiàng)目大多為心肌酶譜。但存在酶活性升高出現(xiàn)較晚、特異性較差和持續(xù)時(shí)間短等不足。而心肌肌鈣蛋白是唯一存在于心肌的收縮蛋白，對(duì)心肌壞死有高度敏感性和特異性。
[0003]心肌肌鈣蛋白是由cTnl、cTnC和cTnT三種，在肌肉舒張和收縮過程中起重要調(diào)節(jié)作用。但cTnC無心肌特異性，一般不用于心肌損傷檢測(cè)。正常狀態(tài)下cTnl和cTnT均不能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入血液，所以健康人血中cTnl和cTnT極低;如心肌細(xì)胞受損，cTnl和cTnT進(jìn)人細(xì)胞間質(zhì)和血液。在腎衰竭、肺炎和敗血癥等疾病中，血液中cTnT含量也可升高，所以其特異性不如cTnl ^TnI在發(fā)病后3?5小時(shí)升高，15?24小時(shí)達(dá)高峰，持續(xù)時(shí)間久，5?10天后可降至正常。cTnl是目前最好的心肌損傷標(biāo)志物之一。
[0004]傳統(tǒng)上多用酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法和免疫層析法(試紙條)等檢測(cè)cTnl。但酶聯(lián)免疫法操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng);化學(xué)發(fā)光法需配套大型昂貴儀器，測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)，不易實(shí)現(xiàn)快速即時(shí)檢測(cè)。膠體金免疫層析法雖簡(jiǎn)便快速，但重復(fù)性差、靈敏度低，容易出現(xiàn)誤判。
[0005]中國(guó)專利200780015772.0公布了一種肌鈣蛋白高靈敏分析系統(tǒng)，采用微量滴定板(微孔板)進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，但操作復(fù)雜、測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)范圍窄。中國(guó)專利200610028913.X描述了一種以膠體金免疫層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)cTnl檢測(cè)的試劑盒，但只能進(jìn)行定性檢測(cè)，而無法定量。中國(guó)專利201010619731.6公開了一種全程定量檢測(cè)cTn I的免疫層析試紙條，以熒光膠乳微粒替代膠體金，實(shí)現(xiàn)對(duì)cTnl的定量檢測(cè)，但仍無法解決試紙條重復(fù)性差等缺陷。
[0006]因此開發(fā)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測(cè)方法，具有巨大發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。與熒光和吸收光相比，化學(xué)發(fā)光沒有外來激發(fā)光源背景信號(hào)干擾，交叉干擾小，靈敏度高、線性范圍寬。微流控芯片技術(shù)把樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，可完成全過程分析。
[0007]針對(duì)現(xiàn)有cTnl檢測(cè)方法的不足和缺陷，微流控磁微粒化學(xué)發(fā)光方法利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光和微流控技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)cTnl準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為針對(duì)現(xiàn)有快速診斷方法靈敏度低、重復(fù)性差、受干擾明顯，以及現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光配套儀器昂貴、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的問題，提供一種定量檢測(cè)全血中肌鈣蛋白I的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片，通過集成化芯片(把除測(cè)試樣本外所有組分均集成到芯片內(nèi))并配套小型便攜設(shè)備，從而實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)全血樣本中CTnI的快速、準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測(cè)。
[0009 ]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0010]—種定量檢測(cè)全血中肌鈣蛋白I的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括頂板(I)結(jié)構(gòu)和底板(2)結(jié)構(gòu)，其中頂板(I)上氣栗(3)、加樣口(4)、樣本填充區(qū)(12)、標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)和樣本混合區(qū)(13)依次連接;底板上過濾區(qū)(6)、磁顆粒包被區(qū)(7)、清洗區(qū)(14)、檢測(cè)區(qū)(8)、液體釋放通道(16)依次連接;底板的檢測(cè)區(qū)(8)分別與清洗液存儲(chǔ)池(9)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(1)通過液體釋放通道(16)連接；
[0011]所述標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)存儲(chǔ)預(yù)封裝酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗cTnl抗體，磁顆粒包被區(qū)
(7)包被預(yù)封裝磁顆粒標(biāo)記抗cTnl抗體，清洗液存儲(chǔ)池(9)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(1)存儲(chǔ)預(yù)封裝清洗液和發(fā)光基底液;所述微流控芯片測(cè)試流程中，用磁鐵操控磁顆粒移動(dòng)或聚集;所述標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池、清洗液存儲(chǔ)池和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池為液體密封池，可通過外力擠壓而局部破裂，釋放液體;所述過濾區(qū)包含濾血膜所述頂板(I)與底板(2)用膠帶(19和20)密封。
[0012]具體地，本發(fā)明所述的微流控芯片，發(fā)光基底液保質(zhì)期少于I年時(shí)應(yīng)分開，用發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A(23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(24)替代發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)，所述發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A( 23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B (24)通過預(yù)混合通道(25)連接。
[0013]具體地，本發(fā)明所用磁顆粒包含鐵、鈷、鎳的化合物，主要包含但不限于三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物。優(yōu)選磁顆粒為聚苯乙烯為殼，三氧化二鐵為核的顆粒，磁顆粒尺寸和磁鐵的磁感應(yīng)強(qiáng)度對(duì)檢測(cè)結(jié)果有明顯的影響。
[00?4] 具體地，所述磁顆粒標(biāo)記抗cTn I抗體使用的磁顆粒尺寸為0.1?ΙΟμπι ；與磁珠匹配的磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為500?30000高斯。
[0015]優(yōu)選地，所述磁顆粒標(biāo)記抗cTnl抗體使用的磁顆粒尺寸為0.5?3μηι，與磁珠匹配的磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為1000?8000高斯。
[0016]具體地，所述酶或發(fā)光劑標(biāo)記cTnl抗體溶液、磁顆粒標(biāo)記cTnl抗體溶液和清洗液均包含緩沖液、蛋白質(zhì)、表面活性劑和防腐劑，且發(fā)光劑標(biāo)記cTnl抗體溶液還包含甘油，磁顆粒標(biāo)記cTnl抗體溶液還包含糖類。
[0017]具體地，所述酶標(biāo)記cTnl抗體溶液包含牛血清白蛋白(BSA)、吐溫-20和Procl in300的硼酸緩沖液；磁顆粒標(biāo)記cTnI抗體溶液包含BSA、葡萄糖、吐溫-20和Proc I in300的硼酸緩沖液;所述清洗液包含BSA、吐溫-20和Proc I in300的硼酸緩沖液。
[0018]具體地，所述發(fā)光劑標(biāo)記cTnl抗體溶液包含BSA、甘油、吐溫-20、曲拉通X-100和疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液;所述磁顆粒標(biāo)記cTnl抗體溶液包含BSA、酪蛋白、蔗糖、吐溫-20、曲拉通X-100和疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液;所述清洗液包含BSA、吐溫20、曲拉通X-100、聚乙二醇和疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液。
[0019]具體地，所述發(fā)光基底液包含與酶對(duì)應(yīng)的底物及發(fā)光增強(qiáng)液，可合并后注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)，或分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A(23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(24)。
[0020]具體地，所述發(fā)光基底液包含發(fā)光劑對(duì)應(yīng)的雙氧水溶液和堿性溶液，可合并后注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)，或分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A( 23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(24)。
[0021 ]本發(fā)明所述微流控芯片制備方法如下:
[0022]步驟I)酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗cTnl抗體，磁顆粒標(biāo)記抗cTnl抗體，這兩種抗體可相同或不同；
[0023]步驟2)將酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液放入頂板的標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池中，密封，將磁顆粒標(biāo)記抗體溶液放入底板的包被區(qū)中，干燥，將清洗液和發(fā)光基底液分別注入清洗液存儲(chǔ)池和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池中，密封，將頂板和底板組裝成微流控芯片。
[0024]本發(fā)明提供的一種定量檢測(cè)全血中肌鈣蛋白I的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片是一種以化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)、在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)cTnl快速、準(zhǔn)確、高靈敏檢測(cè)的微流控芯片。
[0025]這種芯片是將抗cTnl抗體修飾酶，抗cTnl抗體修飾在磁顆粒上，利用抗原抗體作用，如雙抗體夾心法原理結(jié)合磁顆粒富集、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)全血樣本中是否含有cTnl，并準(zhǔn)確分析其含量。
[0026]本發(fā)明中所述酶，包含但不限于過氧化氫酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。發(fā)光基底液為酶對(duì)應(yīng)的發(fā)光底物(如魯米諾或金剛烷)和發(fā)光增強(qiáng)液(如苯衍生物等增強(qiáng)劑)，其中發(fā)光底物和發(fā)光增強(qiáng)液可合并，如圖1所示混合均勻后注入一個(gè)發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10);但當(dāng)混合液保質(zhì)期少于I年時(shí)應(yīng)分開，如圖3所示分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A(23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)