明配套儀器是小型便攜儀器，儀器只與芯片發(fā)生物理接觸，芯片內(nèi)液體不與儀器接觸，不會(huì)污染儀器而產(chǎn)生交叉干擾。
【附圖說明】
[0056]圖1為腦鈉肽定量檢測微流控芯片主體結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為頂板，2為底板，3為氣栗，4為加樣口，5為標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池，6為過濾區(qū)，7為磁顆粒包被區(qū)，8為檢測區(qū)，9為清洗液存儲(chǔ)池，1為發(fā)光基底液存儲(chǔ)池，11為蓋子，12為樣本填充區(qū)，13為樣本混合區(qū)，14為清洗區(qū)，15為廢液池，16為液體釋放通道，17為發(fā)光基底液和清洗液存儲(chǔ)池讓位孔(于頂板)，18為磁鐵滑軌讓位孔。
[0057]圖2為腦鈉肽定量檢測的完整微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為頂板，2為底板，19為雙面膠帶，20為單面膠帶，21為發(fā)光基底液和清洗液存儲(chǔ)池讓位孔(于雙面膠帶)，22為混合液流入過濾區(qū)時(shí)的讓位孔。
[0058]圖3為雙發(fā)光基底液的微流控芯片底板結(jié)構(gòu)示意圖，其中23為發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A，24為發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B，25為預(yù)混合通道。
【具體實(shí)施方式】
[0059]本發(fā)明公開了一種cTnl定量檢測的微流控磁微?；瘜W(xué)發(fā)光方法及其專用微流控芯片，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0060]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0061 ]實(shí)施例1:酶促化學(xué)發(fā)光測定cTnl
[0062](一)抗體標(biāo)記
[0063]取50yg HRP溶解于ImL蒸餾水中，再加入1ymol新配Na14溶液，室溫避光反應(yīng)20min后，以ImM pH4.4醋酸鈉緩沖液透析純化溶液。再以pH9.5碳酸鹽緩沖液將pH調(diào)至9.0，加入10yg抗cTnl單抗，室溫避光反應(yīng)2h。加0.1mL 4mg/mL新配NaBH4，混勾后于4°C反應(yīng)2h。將上述溶液裝入透析袋，以0.15M pH7.4PBS透析，4°C過夜，得到HRP標(biāo)記cTnl抗體。
[0064]向ρΗ7.4磷酸緩沖液中加入Img磁顆粒(直徑為2ym)、10yg EDC和15yg NHS溶液和10?30yg抗cTnl單抗(與HRP標(biāo)記的抗體不同)溶液，混合均勾并于室溫下反應(yīng)4h，加入Img甘氨酸封閉。以磁鐵富集純化，去除未反應(yīng)的cTnl單抗，得到磁顆粒標(biāo)記cTnl抗體。
[0065](二)微流控芯片組裝
[0066]HRP 標(biāo)記 cTnl 抗體溶液中含1%BSA、0.2% 吐溫20和0.05%Proclin300的 ρΗ7.4硼酸緩沖液;磁顆粒標(biāo)記cTnl抗體溶液為包含0.5%BSA、2%葡萄糖、I %吐溫-20和0.05%Proclin300的ρΗ7.4硼酸緩沖液。
[0067]將HRP標(biāo)抗體溶液放入頂板標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池中，密封。將磁標(biāo)抗體溶液放入底板磁顆粒包被區(qū)中，室溫干燥。
[0068]清洗液為0.3%BSA,0.2%吐溫-20和0.03%Proclin300的pH7.2硼酸緩沖液。將清洗液注入清洗液存儲(chǔ)池。發(fā)光基底液分為HRP底物(魯米諾的雙氧水溶液)和堿性增強(qiáng)液(苯衍生物的堿性溶液)，分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A(23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(24)中，密封。按圖1所示，將過濾區(qū)粘入底板中。然后按圖2所示，以單面膠帶和雙面膠帶，將頂板和底板組裝成微流控芯片。裝入鋁箔袋中，密封4°保存。
[0069](三)樣本檢測
[°07°]用正常人血楽作稀釋液，將。1']11標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如下濃度:(^8/1111、5(^8/1111、100?區(qū)/ml、500pg/ml、lng/ml、5ng/ml、lOng/ml和50ng/ml。
[0071]將50μ1樣本滴入加樣口后，蓋上蓋子。將微流控芯片放入配套儀器(磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為6000高斯)中，儀器擠出HRP標(biāo)記單抗，并使樣本和HRP標(biāo)記單抗混合均勻后注入底板過濾區(qū)。樣本過濾后，到達(dá)微通道，并溶解磁顆粒標(biāo)記單抗，磁鐵加速樣本反應(yīng)，形成HRP標(biāo)記單抗-cTnl抗原-磁顆粒標(biāo)記單抗的三明治結(jié)構(gòu)，然后磁鐵收集磁顆粒。存儲(chǔ)池釋放清洗液，將磁顆粒清洗后，發(fā)光基底液釋放，儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度。總檢測時(shí)間15min。每個(gè)樣本分別用3個(gè)微流控芯片測定3次，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0072]將50μ1全血樣本滴入加樣口，15分鐘內(nèi)儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中cTnl濃度。
[0073]檢測原理為:當(dāng)全血加入微流控芯片后，全血先與HRP標(biāo)記抗體混合，然后經(jīng)過濾區(qū)后，混合了HRP標(biāo)記抗體的血漿到達(dá)微通道，血漿溶解磁標(biāo)記抗體。當(dāng)血樣中含有cTnl，則形成HRP標(biāo)記抗體-cTnl-磁顆粒標(biāo)記抗體的三明治結(jié)構(gòu)(雙抗體夾心法)。經(jīng)清洗后，再發(fā)光基底液作用下發(fā)光，儀器檢測系統(tǒng)測試發(fā)光信號(hào)。依據(jù)配套儀器獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而分析血樣中cTnl濃度。樣本中cTnl含量越高，則發(fā)光信號(hào)越強(qiáng)。
[0074]結(jié)果表明，其最低檢測限為50pg/ml，最低定量限為200pg/ml，定量檢測范圍為
0.05?50ng/ml，線性相關(guān)系數(shù)R2>0.99 ；在檢測范圍內(nèi)，未出現(xiàn)HOOK效應(yīng);且批內(nèi)與批間重復(fù)性均小于10%?？蔀樾墓Ｐ乃ゼ膊≡\斷提供參考。
[0075]實(shí)施例2:直接化學(xué)發(fā)光測定cTnl
[0076](— )抗體標(biāo)記
[0077]向磷酸緩沖液中加入適量活化的吖啶酯和10yg抗cTnl單抗溶液，混合均勻后于室溫下反應(yīng)3h，加入Img甘氨酸封閉。透析分離純化，得到吖啶酯標(biāo)記cTnl抗體。
[0078]向Iml 1mM pH7.4磷酸緩沖液中加入Img磁顆粒(直徑為Ιμπι)、20yg EDC和20ygNHS溶液和30yg鏈霉親和素，混合均勻并于室溫下反應(yīng)4h，加入Img甘氨酸封閉。以磁鐵吸附富集，去除未反應(yīng)的鏈霉親和素，得到磁顆粒標(biāo)記鏈霉親和素。
[0079]將20yg抗cTnl單抗加入1yL0.25mg/mL Sulfo-NHS-LC-b1tin溶液中，反應(yīng)lh。超濾離心純化，去除未反應(yīng)的生物素，得到b1tin-cTnl抗體。
[0080]通過親和素-生物素間的相互作用，把抗cTnl抗體連接到磁顆粒表面，得到磁顆粒標(biāo)記cTnl抗體。其中親和素標(biāo)記的磁顆粒和生物素化的抗體比例在I: 14?2:105。
[0081 ] (二)微流控芯片組裝
[0082]吖啶酯標(biāo)記cTnl抗體溶液中含0.5%BSA、I %甘油、0.2%吐溫20、I %曲拉通X-100和0.1 %疊氮鈉的PH7.4磷酸鹽緩沖液;磁顆粒標(biāo)記cTnl抗體溶液為包含0.2%BSA、0.2%酪蛋白、I %蔗糖、0.5 %吐溫20、0.5 %曲拉通X-100和0.1 %疊氮鈉的pH7.4磷酸鹽緩沖液。將吖啶酯標(biāo)記抗體溶液放入頂板標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池中，密封。將磁標(biāo)抗體溶液放入底板磁顆粒包被區(qū)中，室溫干燥。
[0083]清洗液為0.3%BSA,0.5%吐溫20、I %曲拉通X-100和0.02 %疊氮鈉的pH7.2磷酸鹽緩沖液。將清洗液注入清洗液存儲(chǔ)池。發(fā)光基底液分為包含雙氧水溶液和堿性溶液，分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A(23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(24)，密封。按圖1所示，將濾血膜粘入底板過濾區(qū)中，將存儲(chǔ)池內(nèi)置入底板。然后按圖2所示，以單面膠帶和雙面膠帶，將頂板和底板組裝成微流控芯片。裝入鋁箔袋中，密封4°保存。
[0084](三)樣本檢測
[0085]用正常人血漿作稀釋液，將cTnl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如下濃度:0pg/ml、100pg/ml、500pg/ml、lng/ml、5ng/ml、lOng/ml和50ng/ml。
[0086]將50μ1樣本滴入加樣口后，蓋上蓋子。將微流控芯片放入配套儀器(磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為4000高斯)中，儀器擠出吖