包括基于金黃色葡萄球菌a蛋白的新配體的層析基質(zhì)的制作方法
【專利說明】包括基于金黃色葡萄球菌A蛋白的新配體的層析基質(zhì)
[00011 本申請為申請日為2012年6月8日、申請?zhí)枮?01210273398.7、發(fā)明名稱為"包括基 于金黃色葡萄球菌A蛋白的新配體的層析基質(zhì)"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請
[0003] 本申請要求2011年6月8日提交的美國臨時專利申請61/494701的優(yōu)先權(quán)，在此通 過援引的方式將其全部內(nèi)容并入本申請。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及層析基質(zhì)，其包括基于免疫球蛋白結(jié)合蛋白（如金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)A蛋白（SpA))的一個或多個結(jié)構(gòu)域的配體，也涉及它們的使用方 法。
【背景技術(shù)】
[0005] 用于親和層析的配體通常對于靶分子具有高選擇性，從而能夠以高產(chǎn)率、高純度、 快速且經(jīng)濟的方式純化靶分子?；诮瘘S色葡萄球菌A蛋白的試劑和層析介質(zhì)已經(jīng)在親和 層析領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，用于捕獲和純化抗體和含有Fc的蛋白；由于其能夠結(jié)合IgG，且不 會顯著影響免疫球蛋白與抗原的親和力，因此在規(guī)?；治隹贵w檢測方法中也得到廣泛應(yīng) 用。
[0006] 因此，包含A蛋白配體的各種試劑和介質(zhì)已經(jīng)建立起來并通過商業(yè)途徑可以獲得， 例如 /ProSepdvAHigh Capacity、Pr〇Sep?-vA.Ultra和ProSep? UltraPlus (MILLIPORE)和Protein A Sepharose?、MabSelect?、MabSelect Xtra?、MabSelect SuRe? (GE HEALTHCARE)、MabSelect SuRe? LX和Poros MasCapture A ?(LIFE TECHNOLOGIES)。
[0007] 為了保持層析配體(包括配體結(jié)合型固相支持物如結(jié)合SpA的層析基質(zhì)）的選擇 性，基質(zhì)需要進行清洗，而且通常在酸性或堿性條件下清洗，如用氫氧化鈉(NaOH)。例如，用 于基質(zhì)清洗和再生的標準過程是堿性原位清洗(CIP)方法，其通常包括用濃度為0.05M-1M 的NaOH處理結(jié)合配體的基質(zhì)，使pH范圍位于12.7-14.0。一般來講，將親和層析基質(zhì)進行重 復原位清洗循環(huán)會導致基質(zhì)對靶分子的結(jié)合能力隨清洗時間的延長而顯著喪失，從而整個 過程需要更多量的通常很昂貴的與基質(zhì)結(jié)合的配體。由于這樣會導致純化過程更加昂貴并 且時間延長，因此既不夠經(jīng)濟也不是所期望的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 基于A蛋白的層析基質(zhì)之前在現(xiàn)有技術(shù)中已有描述，其表現(xiàn)出在堿性條件下處理 后對于靶分子的結(jié)合能力下降。參見，如公開號為20100221844的美國專利出版物描述的親 和層析基質(zhì)以多點連接的方式將野生型(wt)SpA的B或Z結(jié)構(gòu)域結(jié)合到基質(zhì)上，即使用0.5M NaOH處理5小時或更長時間，其也能達到起始結(jié)合能力的95%。此外，公開號為20100048876 的美國專利出版物描述了一種結(jié)合了野生型SpA的C結(jié)構(gòu)域和含有3-6個氨基酸缺失的C結(jié) 構(gòu)域的親和層析基質(zhì)，用〇. 5M NaOH處理約5小時，其達到起始結(jié)合能力的95%。這些配體通 過半胱氨酸引導的單點連接方式固定到基質(zhì)上。進一步地，已經(jīng)有文獻描述了結(jié)合在一個 或多個天冬氨酸位點含有突變的A蛋白的層析基質(zhì)，在堿性條件下處理后，其基質(zhì)顯示出結(jié) 合能力相對于野生型SpA有所下降，其通過單點連接方式固定到基質(zhì)上。參見如US專利 6831161。
[0009] 盡管前述提到的親和層析基質(zhì)在苛性條件(caustic conditions)下處理后，似乎 顯示出對于靶分子的結(jié)合能力有所下降，但在苛性條件下處理后，其中許多基質(zhì)顯示出很 大程度的配體片段化，如使用SDS-PAGE和/或尺寸排阻層析（SEC)可以觀察到。由于很大程 度的配體片段化產(chǎn)生的配體小片段難以從靶分子中去除和分離，從而增加潛在的免疫原性 片段與治療性靶分子共純化的可能，因此這種片段化是不利的。此外，很大程度的片段化導 致加劇基質(zhì)與祀分子結(jié)合能力的下降。
[0010] 本發(fā)明提供了親和層析配體和結(jié)合該配體的基質(zhì)，其中所述配體基于一個或多個 金黃色葡萄球菌A蛋白（SpA)的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有從N末端第1位或第2位起始的缺失突 變。這些配體和基質(zhì)在純化使用時的片段化問題相對于之前描述的配體有所下降，這一點 通過SDS-PAGE和/或SEC技術(shù)可以證實，從而使得它們成為用于親和層析的更有吸引力和更 加經(jīng)濟的選擇。
[0011] 本發(fā)明的一個方面提供了親和層析基質(zhì)，其包括具有缺失突變的一個或多個SpA 蛋白B結(jié)構(gòu)域，具有缺失突變的一個或多個SpA蛋白C結(jié)構(gòu)域或具有缺失突變的一個或多個 SpA蛋白Z結(jié)構(gòu)域，其中一個或多個結(jié)構(gòu)域結(jié)合到固相支持物上。
[0012] 在一個實施方式中，本發(fā)明的親和層析基質(zhì)包括結(jié)合到固相支持物上的配體，其 中所述配體包含一個或多個金黃色葡萄球菌A蛋白（SpA)B結(jié)構(gòu)域，其中至少一個B結(jié)構(gòu)域包 含位于N末端的至少3個連續(xù)氨基酸的缺失。在另一實施方式中，本發(fā)明的親和層析基質(zhì)包 括結(jié)合到固相支持物上的配體，其中所述配體包含一個或多個金黃色葡萄球菌A蛋白（SpA) 的C結(jié)構(gòu)域，其中至少一個C結(jié)構(gòu)域包含位于N末端的至少3個連續(xù)氨基酸的缺失。
[0013] 在另一實施方式中，本發(fā)明的親和層析基質(zhì)包括結(jié)合到固相支持物上的配體，其 中所述配體包含一個或多個金黃色葡萄球菌A蛋白（SpA)的Z結(jié)構(gòu)域，其中至少一個Z結(jié)構(gòu)域 包含位于N末端的至少3個連續(xù)氨基酸的缺失。
[0014] 在又一實施方式中，本發(fā)明的親和層析基質(zhì)包括結(jié)合到固相支持物上的配體，其 中所述配體包含兩個或更多個B結(jié)構(gòu)域，兩個或更多個C結(jié)構(gòu)域或兩個或更多個Z結(jié)構(gòu)域，或 B、C和Z結(jié)構(gòu)域的任意組合，其中至少一個B、C或Z結(jié)構(gòu)域包含位于N末端的至少3個連續(xù)氨基 酸的缺失。
[0015] 在本發(fā)明的各種實施方式中，每個配體上多于一個位點連接到固相支持物（即多 點連接）。
[0016] 在本發(fā)明的各種實施方式中，所述配體或含有配體的基質(zhì)經(jīng)0.5M NaOH處理至少5 小時后，配體相對于其野生型對應(yīng)物顯示出降低的片段化，這通過SDS-PAGE或尺寸排阻層 析(SEC)可以確定。
[0017] 在本發(fā)明的一些實施方式中，所述配體包含N末端3個氨基酸缺失，N末端4個氨基 酸缺失，或N末端5個氨基酸缺失，其中配體上多于一個位點連接到固相支持物，從而形成親 和層析基質(zhì)。
[0018] 在一特定的實施方式中，配體具有SEQ ID N0:13-42、SEQ ID N0:55-84和SEQ ID NO: 93-94中任一所示的氨基酸序列。
[0019]在另一實施方式中，本發(fā)明的配體具有下列結(jié)構(gòu)：[(X)n，（Y)m] n+m，其中X代表SpA蛋 白的B結(jié)構(gòu)域、Z結(jié)構(gòu)域或C結(jié)構(gòu)域，η代表從零至(m-1)范圍的結(jié)構(gòu)域數(shù)目，Y代表N末端缺失 至少3個連續(xù)氨基酸的SpA蛋白B結(jié)構(gòu)域、Z結(jié)構(gòu)域或C結(jié)構(gòu)域，m代表范圍是1-8的Y結(jié)構(gòu)域的 數(shù)目，其中所述配體多于一個位點連接到固相支持物(如層析基質(zhì)）。
[0020] 在本發(fā)明的一些實施方式中，所述配體包含SpA蛋白的兩個B結(jié)構(gòu)域或兩個Z結(jié)構(gòu) 域或兩個C結(jié)構(gòu)域，或一個B和一個C結(jié)構(gòu)域，或一個B和一個Z結(jié)構(gòu)域，或一個C和一個Z結(jié)構(gòu) 域，其中至少一個B結(jié)構(gòu)域或至少一個Z結(jié)構(gòu)域或至少一個C結(jié)構(gòu)域包括N末端3個連續(xù)氨基 酸缺失或N末端4個連續(xù)氨基酸缺失或N末端5個連續(xù)氨基酸缺失。應(yīng)該理解，各種結(jié)構(gòu)域可 以任意順序分布。
[0021] 在另一實施方式中，本發(fā)明的配體包含三個B結(jié)構(gòu)域或三個Z結(jié)構(gòu)域或三個C結(jié)構(gòu) 域，或B、C或Z結(jié)構(gòu)域按照任意順序的任意組合，其中至少一個B結(jié)構(gòu)域或至少一個Z結(jié)構(gòu)域 或至少一個C結(jié)構(gòu)域包括N末端3個連續(xù)氨基酸缺失或N末端4個連續(xù)氨基酸缺失或N末端5個 連續(xù)氨基酸缺失。
[0022] 在又一實施方式中，本發(fā)明的配體包含四個B結(jié)構(gòu)域或四個Z結(jié)構(gòu)域或四個C結(jié)構(gòu) 域，或B、C或Z結(jié)構(gòu)域按照任意順序的任意組合，其中至少一個B結(jié)構(gòu)域或至少一個Z結(jié)構(gòu)域 或至少一個C結(jié)構(gòu)域包括N末端3個連續(xù)氨基酸缺失或N末端4個連續(xù)氨基酸缺失或N末端5個 連續(xù)氨基酸缺失。
[0023] 在又一實施方式中，本發(fā)明的配體包含五個B結(jié)構(gòu)域或五個Z結(jié)構(gòu)域或五個C結(jié)構(gòu) 域，或B、C或Z結(jié)構(gòu)域按照任意順序的任意組合，其中至少一個B結(jié)構(gòu)域或至少一個Z結(jié)構(gòu)域 或至少一個C結(jié)構(gòu)域包括N末端3個連續(xù)氨基酸缺失或N末端4個連續(xù)氨基酸缺失或N末端5個 連續(xù)氨基酸缺失。
[0024] 在又一實施方式中，本發(fā)明的配體包含六個B結(jié)構(gòu)域或六個Z結(jié)構(gòu)域或六個C結(jié)構(gòu) 域，或B、C或Z結(jié)構(gòu)域按照任意順序的任意組合，其中至少一個B結(jié)構(gòu)域或至少一個Z結(jié)構(gòu)域 或至少一個C結(jié)構(gòu)域包括N末端3個連續(xù)氨基酸缺失或N末端4個連續(xù)氨基酸缺失或N末端5個 連續(xù)氨基酸缺失。
[0025] 在又一實施方式中，本發(fā)明的配體包含七個B結(jié)構(gòu)域或七個Z結(jié)構(gòu)域或七個C結(jié)構(gòu) 域，或B、C或Z結(jié)構(gòu)域按照任意順序的任意組合，其中至少一個B結(jié)構(gòu)域或至少一個Z結(jié)構(gòu)域 或至少一個C結(jié)構(gòu)域包括N末端3個連續(xù)氨基酸缺失或N末端4個連續(xù)氨基酸缺失或N末端5個 連續(xù)氨基酸缺失。
[0026] 在進一步的實施方式中，本發(fā)明的配體包含八個B結(jié)構(gòu)域或八個Z結(jié)構(gòu)域或八個C 結(jié)構(gòu)域，或B、C或Z結(jié)構(gòu)域按照任意順序的任意組合，其中至少一個B結(jié)構(gòu)域或至少一個Z結(jié) 構(gòu)域或至少一個C結(jié)構(gòu)域包括N末端3個連續(xù)氨基酸缺失或N末端4個連續(xù)氨基酸缺失或N末 端5個連續(xù)氨基酸缺失。
[0027] 此外，本發(fā)明提供了親和層析基質(zhì)的使用方法。因此，提供了從樣品中親和純化一 種或多種靶分子(如免疫球蛋白或含有Fc的蛋白）的方法，所述方法包含下列步驟：（a)提供 包含一種或多種靶分子(如免疫球蛋白或含有Fc的蛋白）的樣品；（b)在使一種或多種靶分 子(如免疫球蛋白或含有Fc的蛋白）結(jié)合到基質(zhì)上的條件下將樣品與本發(fā)明的基質(zhì)接觸;和 (c)在適宜的條件如適宜的pH條件下，通過洗脫回收一種或多種結(jié)合的靶分子(如免疫球蛋 白或含有Fc的蛋白）。
[0028] 在一些實施方式中，本發(fā)明的親和層析基質(zhì)經(jīng)0.5M NaOH溫育5小時或10小時或15 小時或20小時或25小時或30小時后保留了初始靶分子結(jié)合能力的至少95%。
[0029]在特定實施方式中，本發(fā)明的親和層析基質(zhì)經(jīng)0.5M NaOH溫育5小時后保留了初始 結(jié)合能力的至少95%。
[0030] 在又一實施方式中，本發(fā)明的親和層析基質(zhì)經(jīng)0.1M NaOH溫育25小時后保留了初 始靶分子結(jié)合能力的至少95% ;經(jīng)0 · 3M NaOH溫育25小時后保留了初始靶分子結(jié)合能力的 至少85% ;或經(jīng)0.5M NaOH溫育25小時后保留了初始靶分子結(jié)合能力的至少65%。
[0031] 能被這里描述的不同配體結(jié)合的免疫球蛋白包括：如IgG、IgA和IgM，或包含抗體 和任意抗體片段的、能與Sp A結(jié)合的任意融合蛋白。
[0032] 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明所描述的不同配體的核酸分子，以及包括所述核酸分 子的宿主細胞。在一些實施方式中，宿主細胞是原核細胞。在另外的實施方式中，宿主細胞 是真核細胞。
[0033] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供了基于SpA的親和層析基質(zhì)，其與免疫球蛋白Fab 段的結(jié)合與野生型SpA配體相比發(fā)生了改變(升高或下降），同時保留了與免疫球蛋白Fc段 結(jié)合的能力。在一個實施方式中，本發(fā)明基于SpA的基質(zhì)與免疫球蛋白Fab段的結(jié)合與野生 型SpA相比出現(xiàn)下降。在一特定實施方式中，層析基質(zhì)結(jié)合SpA配體，該配體包括在第29位以 賴氨酸替代甘氨酸(對于SpA的B和C結(jié)構(gòu)域)或替代丙氨酸(對于SpA的Z結(jié)構(gòu)域）。
[0034] 附圖簡述
[0035]圖1描述了 SpA的野生型(wt)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及Z結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對，如 SEQ ID N0:1-6所示。
[0036] 圖2描述了含有編碼帶有A29K突變的二聚化Z結(jié)構(gòu)域配體的核苷酸序列的pETlla 質(zhì)粒圖譜，其氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:85(對照），以及編碼帶有A29K突變和第二結(jié)構(gòu) 域包括N末端4個連續(xù)氨基酸缺失的二聚化Z結(jié)構(gòu)域配體的核苷酸序列的pETl la質(zhì)粒圖譜， 其氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:78。配體構(gòu)建物進一步包括3'端的His-tag序列。
[0037] 圖3是考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE膠，用于分析游離或固定化的二聚化Z和C配體 經(jīng)過或不經(jīng)過0.5M NaOH苛性浸泡（caustic soak)25小時的片段化分布情況。SDS-PAGE膠 各泳道解釋如下：泳道1:分子量標志；泳道2:二聚化Z結(jié)構(gòu)域配體不經(jīng)過苛性處理(A29K，無 缺失，序列如SEQ ID N0:85所示，用作對照，有His-tag);泳道3:二聚化Z結(jié)構(gòu)域配體對照經(jīng) 過0.5M NaOH浸泡25小時;泳道4:固定到瓊脂糖層析樹脂上的二聚化Z結(jié)構(gòu)域配體對照經(jīng)過 0.5M NaOH浸泡25小時;泳道5:第二結(jié)構(gòu)域N末端具有4個連續(xù)氨基酸缺失的二聚化Z結(jié)構(gòu)域 配體不經(jīng)過堿性處理(A29K，第二結(jié)構(gòu)域有缺失，序列如SEQ ID N0:78所示，有His-tag);泳 道6:SEQ ID N0:78所示的、有His-tag的二聚化Z結(jié)構(gòu)域配體經(jīng)過0.5M NaOH浸泡25小時；泳 道7:有His-tag、固定到瓊脂糖層析樹脂上的、SEQ ID N0:78所示的二聚化Z結(jié)構(gòu)域配體經(jīng) 過0.5M NaOH浸泡25小時；泳道8:用作對照的、無缺失的二聚化C結(jié)構(gòu)域配體不經(jīng)過苛性處 理(氨基酸序列如SEQ ID N0:92所示;有His-tag);泳道9:二聚化C結(jié)構(gòu)域配體對照經(jīng)0.5M NaOH浸泡25小時；泳道10:固定到瓊脂糖層析樹脂上的二聚化C結(jié)構(gòu)域配體經(jīng)0.5M NaOH浸 泡25小時；泳道11:第二結(jié)構(gòu)域N末端有缺失的二聚化C結(jié)構(gòu)域配體(氨基酸序列如SEQ ID NO: 35所示，有Hi s-tag);泳道12: SEQ ID NO: 35所示的、有Hi s-tag的二聚化C結(jié)構(gòu)域配體經(jīng) 0.5M NaOH浸泡25小時；泳道13:SEQ ID N0:35所示的、有His-tag的、固定到瓊脂糖層析樹 脂上的二聚化C結(jié)構(gòu)域配體經(jīng)過0.5M NaOH浸泡25小時。
[0038]圖4是上述圖3概述的二聚化Z和C配體的尺寸排阻層析(SEC)結(jié)果。X軸代表保留時 間，以分鐘表不，小分子比大分子的保留時間長。y軸代表在280nm的紫外吸收值，以mAU表 示。層析圖上的方框表明第二結(jié)構(gòu)域N末端有缺失的二聚化Z和C結(jié)構(gòu)域配體經(jīng)長時間堿性 處理（如0.5M NaOH處理25小時）后的降低的片段化，箭頭所示的二聚化Z和C結(jié)構(gòu)域?qū)φ罩?存在的小片段。
[0039]圖5是考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE膠，用于分析游離或固定化的五聚化Z結(jié)構(gòu)域配 體經(jīng)過或不經(jīng)過0.5M NaOH苛性浸泡25小時的片段化分布情況。SDS-PAGE膠各泳道解釋如 下:泳道1:分子量標志;泳道2:具有A29K突變的、除第一結(jié)構(gòu)域外其余均具有N末端4個連續(xù) 氨基酸缺失的五聚化Z結(jié)構(gòu)域配體，氨基酸序列如SEQ ID N0:84所示，不經(jīng)過苛性處理;泳 道3: SEQ ID N0:84所示的五聚化Z結(jié)構(gòu)域配體經(jīng)過0.5M NaOH浸泡25小時；泳道4: SEQ ID NO: 84所示的、固定到瓊脂糖層析樹脂上的五聚化Z結(jié)構(gòu)域配體經(jīng)過0.5M NaOH浸泡25小時； 泳道5: SEQ ID N0:91所示的五聚化Z結(jié)構(gòu)域配體，用作對照，不經(jīng)過苛性浸泡；泳道6:五聚 化Z結(jié)構(gòu)域配體對照經(jīng)過0.5M NaOH浸泡25小時;泳道7:固定到瓊脂糖層析樹脂上的五聚化 Z結(jié)構(gòu)域配體對照經(jīng)過0.5M NaOH浸泡25小時;進一步，泳道8、9和10:是重組SPA(rSPA)經(jīng)過 相似處理的結(jié)果，其中泳道8代表rSPA不經(jīng)過苛性浸泡;泳道9代表rSPA經(jīng)過0.5M NaOH浸泡 25小時以及固定化的rSPA經(jīng)過0.5M NaOH浸泡25小時。條帶代表片段化，以箭頭標出。
[0040] 圖6是上述圖5概述的五聚化Z結(jié)構(gòu)域配體的尺寸排阻層析(SEC)結(jié)果。X軸代表保 留時間，以分鐘表示，小分子比大分子的保留時間長。y軸代表在280nm的紫外吸收值，以mAU 表示。證據(jù)表明：除第一結(jié)構(gòu)域外其余均具有N端缺失的五聚化Z結(jié)構(gòu)域配體經(jīng)長時間苛性 浸泡后的降低的片段化，這通過層析圖上的方框可以看出，五聚化Z結(jié)構(gòu)域?qū)φ罩写嬖诘男?片段用箭頭標出。進一步，rSPA的大量片段化也可以通過SEC觀察到。
[0041] 圖7是上述圖5概述的固定化五聚Z結(jié)構(gòu)域配體的尺寸排阻層析（SEC)結(jié)果。X軸代 表保留時間，以分鐘表示，小分子比大分子的保留時間長。y軸代表在280nm的紫外吸收值， 以mAU表示。證據(jù)表明：第二結(jié)構(gòu)域N端缺失的固定化五聚Z結(jié)構(gòu)域配體經(jīng)長時間苛性浸泡后 的降低的片段化，這通過層析圖上的方框可以看出，五聚化Z結(jié)構(gòu)域?qū)φ罩写嬖诘男∑斡?箭頭標出。進一步，rSPA的大量片段化也可以通過SEC觀察到。
[0042] 圖8是游離的二聚化Z結(jié)構(gòu)域配體經(jīng)長時間苛性浸泡后的尺寸排阻層析（SEC)結(jié) 果，其中所述配體包括在二聚化配體的第二結(jié)構(gòu)域N端缺失第一個(SEQ ID N0:87)，缺失前 二個（SEQ ID NO:88)，缺失前三個（SEQ ID NO:69)或缺失前四個（SEQ ID NO:78)<^軸代表 保留時間，以分鐘表示，小分子比大分子的保留時間長。y軸代表在280nm的紫外吸收值，以 mAU表示。證據(jù)表明，第二結(jié)構(gòu)域N端缺失前三個或前四個氨基酸的二聚化配體經(jīng)長時間苛 性浸泡后的降低的片段化，以方框標出。第二結(jié)構(gòu)域N末端無氨基酸缺失（SEQ ID N0:85)或 缺失第一個或前二個氨基酸的二聚化配體經(jīng)長時間苛性浸泡后出現(xiàn)片段化，通過箭頭所指 的層析片段可以顯示出來。
[0043]圖9比較了固定化C結(jié)構(gòu)域五聚體經(jīng)過反復苛性處理后保留的結(jié)合能力，其中一個 五聚體配體的每個結(jié)構(gòu)域都包括N末端四個氨基酸缺失，在五聚體中每個結(jié)構(gòu)域都有G29K 突變，并且第一位氨基酸均為丙氨酸(氨基酸序列如SEQ ID N0:93所示）；另一五聚體配體 是具有G29K突變的野生型（氨基酸序列如SEQ ID N0:95所示hx軸代表逐漸增加的處理時 間，層析基質(zhì)經(jīng)過0.7M NaOH處理16個循環(huán)、每循環(huán)30分鐘。y軸代表保留的結(jié)合能力百分 數(shù)。
[0044]發(fā)明詳述
[0045]本發(fā)明提供了結(jié)合基于SpA的一個或多個結(jié)構(gòu)域的配體的親和層析基質(zhì)，其中所 述單獨存在或固定于基質(zhì)的配體在用于純化過程中時相對于SpA野生型結(jié)構(gòu)域顯示出降低 的片段化。
[0046]基于SpA的層析配體先前已經(jīng)有示例性描述，包括，如公開號為20100221844的美 國專利出版物描述的親和層析基質(zhì)結(jié)合野生型(wt)SpA的B或Z結(jié)構(gòu)域，其中配體上多于一 個位點結(jié)合到層析基質(zhì)上（即多點結(jié)合）；公開號為20100048876的美國專利出版物描述了 一種結(jié)合野生型SpA的C結(jié)構(gòu)域的層析配體，其能夠與多種抗體的Fab段結(jié)合，并通過末端偶 聯(lián)基團在單一位點偶聯(lián)到不溶性載體上;US6831161描述了基于SpA的堿性層析配體，其中 一個或多個天冬氨酸殘基進行了修飾。
[0047] 如上述所討論的，這些配體在堿性條件處理后結(jié)合能力出現(xiàn)下降，其中許多配體 在純化使用過程中