42、SEQIDN0:55-84和SEQID N0:93-95組成的組的氨基酸序列的、基于SpA的層析配體的固相支持物與包括靶分子的混 合物在使靶分子特異性結(jié)合到配體上的條件下接觸;和(b)改變條件使靶分子不再與配體 結(jié)合，從而分離IE分子。
[0162] 在一些實施方式中，改變步驟包括改變pH，以使靶分子不再與配體結(jié)合。在特定實 施方式中，pH以一定方式改變以使比步驟(a)的pH條件酸性更強。例如，在一個實施方式中， 步驟(a)在中性pH或約6-約8的pH范圍進(jìn)行;步驟(b)在酸性pH如約1 -約5的pH范圍進(jìn)行。
[0163] 在另一實施方式中，步驟(b)包含在使用過程中改變緩沖液的鹽濃度，以使靶分子 不再與配體結(jié)合。例如，在一個實施方式中，步驟(a)可使用高鹽濃度如>0.1M，步驟(b)可 使用低鹽濃度如<〇.1Μ。反過來，在一些實施方式中，步驟(a)可使用低鹽濃度如<0.1M，步 驟(b)可使用高鹽濃度。在另一實施方式中，緩沖液的pH和鹽濃度都可以在步驟(a)和步驟 (b)之間改變。
[0164] 本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定靶分子與配體結(jié)合的適宜條件，因此能改變條件以中斷 革巴分子配體的結(jié)合。
[0165] 總體而言，推測本發(fā)明描述的配體可在常規(guī)使用天然狀態(tài)的SpA和重組SpA的任何 純化過程或純化過程鏈中使用。換句話說，希望用本發(fā)明描述的配體替代本領(lǐng)域現(xiàn)在使用 的天然狀態(tài)的SpA(如從金黃色葡萄球菌中分離的）和重組SpA(如重組表達(dá)的wt SpA)，以降 低總體成本并減少潛在的免疫原性SpA片段與潛在的治療性分子共純化的風(fēng)險。
[0166] 在一些實施方式中，本發(fā)明涉及親和層析純化抗體的方法，所述方法包括下列步 驟:過程進(jìn)料與本發(fā)明的親和層析基質(zhì)接觸，以結(jié)合進(jìn)料中的一個或多個抗體;任選洗滌步 驟;加入適宜的洗脫緩沖液以使結(jié)合的抗體從基質(zhì)上釋放出來;從洗脫液中回收一個或多 個抗體。本發(fā)明描述的親和層析基質(zhì)也可以用于從培養(yǎng)液、上清以及發(fā)酵液中分離抗體。對 于發(fā)酵液，使用親和層析基質(zhì)能夠從宿主細(xì)胞蛋白（HCP)、DNA、病毒、內(nèi)毒素、營養(yǎng)液、細(xì)胞 培養(yǎng)液的一種或多種成分如消泡劑和抗體以及產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)如非折疊蛋白和聚合物中 分離抗體。
[0167] 在特定實施方式中，進(jìn)料與本發(fā)明的親和層析基質(zhì)接觸之前進(jìn)行機(jī)械過濾，因此 流動相是澄清的細(xì)胞培養(yǎng)液。適于吸收的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
[0168]在另一實施方式中，本發(fā)明涉及多步驟純化抗體，其中包含在一個或多個快速純 化和/或精制抗體的連續(xù)步驟之后，用本發(fā)明的親和層析基質(zhì)進(jìn)行捕獲的步驟。在特定實施 方式中，捕獲步驟之后是疏水相互作用和/或離子交換層析和/或弱分離層析，以結(jié)合-洗脫 或穿流的方式。在替代步驟中，捕獲步驟之后是多模式陰離子或陽離子交換層析和/或弱分 離層析，以結(jié)合-洗脫或穿流的方式。
[0169]在另一實施方式中，任何來自親和層析基質(zhì)的、過濾的、基于SpA的配體可以通過 后續(xù)純化步驟去除至可接受的水平，如降至對于天然A蛋白配體可以接受的水平。
[0170] 總體而言，推測本發(fā)明的配體可以在通常利用A蛋白配體的任何過程中使用。
[0171] 本發(fā)明進(jìn)一步闡述了下面的實施例，這些實施例不應(yīng)視為對本發(fā)明的限定。本申 請通篇引用的所有參考文獻(xiàn)、專利、公開的專利申請以及附圖的全部內(nèi)容均通過引用的方 式并入本申請。 實施例
[0172] 實施例1:制備具有一個或多個結(jié)構(gòu)域、在N末端有4個連續(xù)氨基酸缺失的SpA配體
[0173] 編碼下列蛋白的合成基因從DNA2.0(Menlo Park，CA)獲得。含有兩個Z結(jié)構(gòu)域的 SpA二聚化蛋白，每個結(jié)構(gòu)域在第29位含有一突變(A29K)以降低或消除與Fab的結(jié)合(氨基 酸序列顯示于SEQ ID N0:85中）；含有兩個Z結(jié)構(gòu)域的SpA二聚化蛋白，每個結(jié)構(gòu)域在第29位 含有一突變(A29K)和第二個Z結(jié)構(gòu)域含有N末端有4個連續(xù)氨基酸的缺失(氨基酸序列顯示 于SEQ ID 從)：78中）；
[0174] 每個合成基因的5 '末端包括一起始甲硫氨酸密碼子，并且3 '末端包括6個組氨酸 密碼子(SEQ ID N0:86)便于后續(xù)使用NiNTA柱進(jìn)行純化。每個基因的5'和3'末端分別含有 Ndel和BamHI限ffjij酶切位點。這些合成基因以及使用的表達(dá)載體即pETlla(EMD)，用Ndel和 BamHI (NEW ENGLAND BIOLABS, Ipswich,MA)消化，DNA片段進(jìn)行0.7% 的瓊脂糖TAE凝膠電 泳，切割合適的DNA片段并用QIAGEN的凝膠提取試劑盒(Valencia，CA)純化。純化的片段用 T4DNA連接酶(NEW ENGLAND BIOLABS, Ipswich，MA)連入pETl la質(zhì)?；蚱渌m宜的表達(dá)載 體。
[0175] 連接反應(yīng)產(chǎn)物按照制造商的說明轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)（INVITR0GEN， Carlsbad，CA)，涂布含有100μg/ml氨芐青霉素的Technova LB平板，37°C培養(yǎng)過夜。為了得 到純化的DNA，挑取單克隆并在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中培養(yǎng)過夜。用QIAGEN (Valencia，CA)的快速小量制備試劑盒純化DNA。重組質(zhì)粒的鑒定使用Ndel和BamHI (NEW ENGLAND BIOLABS，Ipswich,ΜΑ)進(jìn)行限制性消化分析確認(rèn)。圖2顯示了包括Z結(jié)構(gòu)域二聚體 構(gòu)建物兩個插入基因的質(zhì)粒圖譜。
[0176] 此外，制備了表達(dá)含有5個Z結(jié)構(gòu)域、每個結(jié)構(gòu)域含有A29K突變的五聚體形式的SpA 配體(氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:91中）的構(gòu)建物，以及含有5個Z結(jié)構(gòu)域、每個結(jié)構(gòu)域含 有A29K突變并且除第一結(jié)構(gòu)域外均含有N末端4個連續(xù)氨基酸缺失（的五聚體形式的SpA配 體氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:84中）的構(gòu)建物。
[0177] 進(jìn)一步，也制備了含有C結(jié)構(gòu)域的二聚化SpA配體的構(gòu)建物。制備了表達(dá)C結(jié)構(gòu)域配 體的二聚化構(gòu)建物，其氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:92中；并且制備了表達(dá)2個C結(jié)構(gòu)域配 體的二聚化構(gòu)建物，其中只有第二個C結(jié)構(gòu)域在N末端4個連續(xù)氨基酸缺失，其氨基酸序列顯 示于SEQ ID NO: 35中。這些C結(jié)構(gòu)域二聚化配體在第29位無突變。
[0178] 實施例2:基于SpA的配體的表達(dá)和純化
[0179] 如上面所討論的，任何適宜的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)都可用于表達(dá)本發(fā)明描述的各種SpA 配體。例如，所述蛋白可使用pET載體如pETlla(EMD)、在大腸桿菌菌株如BL21(DE3) (PROMEGA,Madison WI)中表達(dá)。
[0180]從平板挑取單克隆并在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中在37°C培養(yǎng)過夜。 過夜培養(yǎng)物進(jìn)行1〇〇倍稀釋接入新鮮的、含有l(wèi)OOμg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至 600nm的光學(xué)密度約為0.8的細(xì)胞密度。加入ImM的異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，繼續(xù) 培養(yǎng)兩小時。表達(dá)通過SDS-PAGE分析和免疫印跡確認(rèn)。
[0181] 離心（4000rpm，4°C，5分鐘）收集細(xì)胞，重懸于含有20mM咪唑的3mL磷酸鹽緩沖液 中。超聲裂解細(xì)胞，細(xì)胞碎片通過離心（4000叩111，4°(3,30分鐘）沉淀。使用附-奶^樹脂 (QIAGEN)純化SpA配體，每3mL的柱處理25-30ml細(xì)胞裂解液。柱用含有20mM咪唑的30mL磷酸 鹽緩沖液洗滌兩次，SpA用含有200mM咪唑的3mL磷酸鹽緩沖液洗脫。SpA用18mega-〇hm 1^[迎-01)水（111^1?01^#11640&，1^)、然后用1011^恥!10)3透析過夜。蛋白濃度通過基 于理論消光系數(shù)(Pace et al.，Protein science4:2411(1995))的紫外分光光度計測定。
[0182] 實施例3:基于SpA的配體與固相支持物的結(jié)合
[0183] 按照實施例1和2的描述制備表達(dá)不同的配體之后，它們通過多點結(jié)合的方式固定 到固相支持物上。
[0184] 在示例性試驗中，瓊脂糖樹脂(Sepharose 4B)(GE HEALTH CARE)按照之前描述的 方法（Porath and Fornstedt，J·Chromatography，51:479( 1979))使用環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行交 聯(lián)。接下來瓊脂糖樹脂與帶正電荷的關(guān)聯(lián)基團(tuán)如陽離子按照下列方法進(jìn)行反應(yīng)：向l〇ml樹 脂中加入:5mL 75 % (wt)的縮水甘油三甲基氯化銨(GTMAC)、5mL ⑩水（MILLIP0RE， 811164。3，獻(xiàn))和0.258克50%(￥〇氫氧化鈉。反應(yīng)瓶于室溫在16吐116冊-10雜交儀(8188￥ SCIENTIFIC，Burlington，NJ)上旋轉(zhuǎn)過夜。然后過濾樹脂，以10mL體積的Milli-Q?水 (MILLIP0RE，Billerica, MA)洗滌三次。
[0185] 樹脂（10mL，濾餅)加入到含有3mL 4.6M NaOH的杯中?；旌衔飫驖{，然后加入4mL丁 二醇二環(huán)氧甘油醚（BUDGE )。混合物于35°C旋轉(zhuǎn)大約2小時。然后樹脂用5 X 10mL的 Μ皿-Q? 水(MI LLI PORE，B i 11 er i ca，嫩)洗滌，并用 2 X 1 OmL 的 1 OmM NaHC03平衡。
[0186] 緊跟于上述BUDGE活化步驟之后，向5mL過濾的珠餅中加入lOmllOmM的NaHC03溶 液，該溶液含有2.5和2.3mg/mL濃度的含A29K突變的二聚化Z結(jié)構(gòu)域配體(SEQ ID N0:85)或 在第二個Z結(jié)構(gòu)域含有N末端缺失的二聚化Z結(jié)構(gòu)域配體(SEQ ID N0: 78)?；旌衔镏糜诓Ａ?瓶中，蓋上蓋，然后玻璃瓶在37°C旋轉(zhuǎn)大約2小時。兩小時后，樹脂用10mL的Milli-Q?水洗 滌三次。過濾珠餅（10mL)加入到由lmL硫代甘油和9mL緩沖液組成的10mL溶液中，緩沖液含 有0.2M NaHC03和0.5M NaCl。混合物勻漿并在室溫旋轉(zhuǎn)過夜。然后將樹脂用10mL的下列緩 沖液洗滌3次:含有0.15M NaCl (pH8)和50mM醋酸(pH4.5)的0.1M Tri s緩沖液。然后用1 OmL 的ΜΠΗ-Q?水和10mL 20%乙醇水溶液(v/v)洗滌樹脂。終產(chǎn)物樹脂使用前儲存于20%乙 醇水溶液(v/V)中。將二聚化C結(jié)構(gòu)域配體偶聯(lián)到固相支持物的方法與此處描述的二聚化z 結(jié)構(gòu)域配體相類似。
[0187] 將上述描述的5結(jié)構(gòu)域配體(SEQ ID N0:91和84)偶聯(lián)到瓊脂糖樹脂的方法除在偶 聯(lián)步驟中使用15mg/mL的配體以外，與上述過程類似。Z結(jié)構(gòu)域五聚體不含有His-6標(biāo)簽。
[0188] 實施例4:游離或固定化配體經(jīng)苛性浸泡后收集上清進(jìn)行SDS-PAGE分析
[0189] SDS-PAGE分析能夠用于檢測本發(fā)明所描述的游離或固定化配體經(jīng)過長時間苛性 浸泡后的片段化。SDS-PAGE方法描述如下。
[0190] M i丨丨i-Q?水中的SpA、中和后的苛性處理的配體溶液與中和的樹脂溶液(每種含 有約0.5mg/mL的蛋白）用Laemmli緩沖液(BIORAD，Hercules，CA)按照1:1的比例進(jìn)行稀釋。 樣品于70°C孵育5分鐘以確保蛋白充分變性。10μ1每個樣品加入到AnyKD膠（BI0RAD， Hercules，CA)或 15 % 的Tris-HCl Ready膠（BIORAD，Hercules，CA)。凝膠電泳在 1 X Tris-Glycine-SDS電泳緩沖液中進(jìn)行，200伏30分鐘。然后SDS膠在Gelcode Blue染色劑 (THERMOFISHER，Waltham，ΜΑ)中染色1小時，在MilΠ -Q?水中脫色過夜。
[0191] 實施例5:游離或固定化配體經(jīng)苛性浸泡后收集上清進(jìn)行SEC分析
[0192]除了上述SDS-PAGE分析以外，SEC(尺寸排阻層析)也能用于分析游離或固定化配 體經(jīng)過長時間苛性浸泡后的片段化。SEC試驗描述如下。
[0193] SEC在Agilent 1100HPLC系統(tǒng)（AGILENT，Santa Clara，CA)中進(jìn)行。進(jìn)行SEC-HPLC 分析之前，MiUi-Q?水中的SpA對照、中和后的苛性浸泡的配體溶液(約0.5mg/mL)和中和 的樹脂溶液在13500RPM離心10分鐘。20μ1樣品注入SEC柱（SEPAX Zenix 7.8mm X 300mm， SEPAX TECHNOLOGIES，INC. Newak，Delaware)。磷酸鈉緩沖液（200mM，pH7.0)用作流動相，流 速為lmL/分鐘。來自Agi lent的ChemStation軟件用于獲取和分析230nm及280nm的SEC數(shù)據(jù)。
[0194] 實施例6:配體的苛性浸泡
[0195] 配體按照實施例2描述的方法表達(dá)之后，所述配體進(jìn)行堿性條件處理。
[0196] 向lmL上述每種配體中（濃度為lmg/mL)，加入lmL的1M NaOH至終濃度為0.5M NaOH 和0.5mg/mL配體。樣品輕輕旋轉(zhuǎn)25小時。然后溶液用32yL冰乙酸中和至pH約等于7。
[0197] 圖3顯示了Z結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域二聚化配體經(jīng)過和不經(jīng)過苛性浸泡后，通過SDS-PAGE進(jìn)行的片段化分析。由圖3可以看出，二聚化Z結(jié)構(gòu)域配體(A29K無缺失，序列顯示于SEQ ID N0:85，用作對照)在0.5M NaOH中苛性浸泡25小時后，表現(xiàn)出顯著的片段化，其通過存在 彌散以及存在7KDa左右的小片段(見泳道3)能夠證明。相比之下，具有A29K突變以及在第二 結(jié)構(gòu)域缺失4個連續(xù)氨基酸的二聚化Z結(jié)構(gòu)域配體（氨基酸序列為SEQ ID N0: 78)在0.5M NaOH中苛性浸泡25小時后，大部分是完整的(見泳道6)。
[0198] 相似的，不含突變的二聚化C結(jié)構(gòu)域配體(氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:92,用作 對照）在0.5M NaOH中苛性浸泡25小時后（見泳道9)，與氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:35的、 第二結(jié)構(gòu)域N末端缺失4個連續(xù)氨基酸的二聚化C結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體相比（見泳道12)，在SDS-PAGE上表現(xiàn)出存在彌散以及存在7KDa左右的小片段。
[0199] 此外，每個二聚化Z和C結(jié)構(gòu)域配體均包括His-6標(biāo)簽。不經(jīng)過苛性浸泡的配體顯示 于泳道2(二聚化Z結(jié)構(gòu)域?qū)φ眨?、泳?(具有N末端缺失的二聚化Z結(jié)構(gòu)域配體）、泳道8(二聚 化C結(jié)構(gòu)域?qū)φ眨?、和泳?(具有N末端缺失的二聚化C結(jié)構(gòu)域配體）。
[0200]進(jìn)一步通過SEC證明N末端缺失的二聚化Z和C結(jié)構(gòu)域配體經(jīng)苛性浸泡后的降低的 片段化。圖4以SEC色譜的形式顯示了代表性的SEC試驗的結(jié)果。由圖4可以看出，Z結(jié)構(gòu)域配 體對照(具有SEQ ID N0:85所示的氨基酸序列）與C結(jié)構(gòu)域配體(具有SEQ ID N0:92所示的 氨基酸序列）表現(xiàn)出顯著的片段化，這通過圖4中色譜圖上的箭頭可以確定。相比之下，在第 二結(jié)構(gòu)域具有N末端缺失的二聚化Z和C結(jié)構(gòu)域配體(Z結(jié)構(gòu)域配體的氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:78，C結(jié)構(gòu)域配體的氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:35)表現(xiàn)出降低的片段化，這通過 圖4中色譜圖上的方框可以確定。
[0201 ] 此外，上述五聚體形式的Z結(jié)構(gòu)域配體（即代表對照、具有SEQ ID N0:91所示氨基 酸序列的五聚化Z結(jié)構(gòu)域配體，和具有SEQ ID N0:84所示氨基酸序列的五聚化Z結(jié)構(gòu)域配 體，其代表除第一結(jié)構(gòu)域外的其它結(jié)構(gòu)域均含有N末端4個連續(xù)氨基酸缺失的五聚體）在 0.5M NaOH中苛性浸泡25小時后，也通過SDS-PAGE進(jìn)行片段化分析。
[0202]由圖5的SDS-PAGE膠顯示的數(shù)據(jù)可以看出，除第一結(jié)構(gòu)域外的其它結(jié)構(gòu)域均具有N 末端4個連續(xù)氨基酸缺失的五聚化Z結(jié)構(gòu)域配體（其氨基酸序列顯示于SEQ ID N0: 84)在 0.5M NaOH中處理25小時后，表現(xiàn)出的片段化(見泳道3)與氨基酸序列如SEQ ID N0:91所示 的五聚化Z結(jié)構(gòu)域配體對照（見泳道6)相比顯著降低。如上述所討論的，兩種形式的五聚體 均具有A29K突變。不經(jīng)過浸泡的配體是完整的（泳道2和5)。
[0203] 泳道8-10描述了純化過程中常規(guī)使用的、重組SpA(rSPA)配體的片段化。rSpA配體 經(jīng)0.5M NaOH苛性浸泡25小時后，顯示出甚至比Z結(jié)構(gòu)域?qū)φ崭叱潭鹊钠位?，這通過該 蛋白在SDS-PAGE膠上近乎消失可以觀察到（見泳道9)。不經(jīng)過苛性條件下處理的rSPA配體 顯示于泳道8。
[0204]該結(jié)果提示本發(fā)明描述的具有N末端缺失的、基于Z結(jié)構(gòu)域的配體遠(yuǎn)優(yōu)于常規(guī)使用 的SpA配體如rSPA。
[0205]具有N末端缺失的五聚化Z結(jié)構(gòu)域配體在0.5M NaOH中苛性浸泡25小時后的降低的 片段化進(jìn)一步通過SEC進(jìn)行確認(rèn)，一個代表性試驗的結(jié)果顯示于圖6中。
[0206]圖6中的色譜表明，無氨基酸缺失的五聚體形式的Z結(jié)構(gòu)域?qū)φ?SEQ ID N0:91)在 較低分子量顯不出清晰的可分辨峰，表明存在較小片段。相比之下，具有N末端缺失的五聚 體形式的Z結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:84)與對照相比，顯示出大大減少、程度更低的可分辨峰，代 表更低程度的片段化。
[0207]常規(guī)使用的SpA配體，rSPA，顯示出最強的片段化或斷裂，根本沒有完整分子保留 下來。值得注意的是，SEC色譜結(jié)果與圖5的SDS-PAGE分析結(jié)果一致，進(jìn)一步證實rSPA配體經(jīng) 過長時間苛性條件下處理（如在0.5M NaOH中處理25小時）后片段化嚴(yán)重以至于在SEC色譜 上看不到明顯的片段。
[0208]實施例7 :固定到樹脂上的配體的堿性處理
[0209]前面實施例描述的各種配體結(jié)合到固相支持物(如瓊脂糖層析樹脂），經(jīng)過苛性條 件下處理后評價其片段化。
[0210] 對于每種使用的樹脂而言，5mL-次性層析柱（EVERGREEN SCIENTIFIC, Los Ange 1 es，CA)中的lmL樹脂用Mi丨丨?-Q?水測量。樹脂在柱中使用，2CV(2mL)0 · 5M NaOH快速 平衡，重懸并抽真空。重復(fù)用NaOH處理一次后，真空狀態(tài)的樹脂濕餅移入4mL測試管 (1'冊1??)?13冊1?，131丨1^111，]\^)。將21^0.51恥0!1加入柱中（底部有蓋），迅速移入具有相應(yīng) 樹脂的測試管中。將蓋住的測試管置于旋轉(zhuǎn)儀并使測試管旋轉(zhuǎn)25小時。堿性處理結(jié)束后，測 試管中的物體倒入一次性柱中，收集濾液。將1.5mL濾液用50μ1冰冷的酸中和，可用于進(jìn)一 步的SEC和SDS-PAGE分析。
[0211] 固定化的二聚化Z和C結(jié)構(gòu)域配體經(jīng)過長時間苛性浸泡（如在0.5M NaOH中處理25 小時）后的SDS-PAGE分析顯示于圖3中?？傮w而言，可以預(yù)期：如果配體固定到層析基質(zhì)（如 瓊脂糖樹脂)后在堿性條件下是穩(wěn)定的，其不會顯示出任何顯著的片段化。
[0212] 由圖3的SDS-PAGE膠可以觀察到，二聚化Z和C結(jié)構(gòu)域配體固定化對照(氨基酸序列 分別顯示于SEQ ID N0:85和92,SDS-PAGE膠分別對應(yīng)于泳道4和10)以及在第二結(jié)構(gòu)域含有 N末端缺失的、二聚化Z和C結(jié)構(gòu)域固定化配體(氨基酸序列分別顯示于SEQ ID N0: 78和35， SDS-PAGE膠分別對應(yīng)于泳道7和13)經(jīng)過0.5M NaOH浸泡處理25小時后，都不顯示