本發(fā)明涉及免疫層析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
霍亂弧菌(Vibrio cholerae)是霍亂的病原體，根據(jù)其O抗原的不同可分為200多個(gè)血清群，其中Ol群是引起人類霍亂的主要血清群?；魜y是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。人類是霍亂弧菌的唯一易感者?；魜y弧菌進(jìn)入消化道到達(dá)小腸，在腸粘膜表面吸附并迅速繁殖。產(chǎn)生的霍亂腸毒素作用于小腸粘膜，引起小腸液過(guò)度的分泌。曾在世界上引起多次大流行，主要表現(xiàn)為上吐下瀉，導(dǎo)致脫水和代謝性酸中毒、循環(huán)衰竭，死亡率甚高。屬于國(guó)際檢疫傳染病。
霍亂是我國(guó)法定的甲類傳染病，國(guó)家要求在接診24h內(nèi)報(bào)出檢驗(yàn)結(jié)果。因此，及早鑒定出霍亂弧菌對(duì)控制該病的流行和治療有極其重要的意義。目前霍亂弧菌的快速診斷方法如快速制動(dòng)試驗(yàn)和免疫熒光菌球試驗(yàn)等效果不理想，主要因?yàn)榛颊呒S便中的霍亂弧菌時(shí)多時(shí)少，最少時(shí)檢查結(jié)果呈陰性。
乳膠層析法是以彩色乳膠為標(biāo)記物的免疫層析法，其檢測(cè)原理與膠體金免疫層析法相類似，它不需要儀器，直接用肉眼判讀結(jié)果，具有操作簡(jiǎn)單、快速，試劑穩(wěn)定性好，易保存，單人份獨(dú)立包裝，試劑損耗少等優(yōu)點(diǎn)，適合臨床患者、健康體檢者等標(biāo)本的快速篩查。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，從提高檢測(cè)靈敏度出發(fā)，提供一種檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速的霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的第一方面公開了一種霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒，包括試劑條，所述試劑條包括襯底、濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，所述濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙依次首尾銜接并固定于所述襯底上，所述致敏 乳膠聚酯膜上包被有彩色乳膠顆粒標(biāo)記的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ⅰ，免疫硝酸纖維素膜上設(shè)有包被了抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ⅱ的檢測(cè)線和包被了羊抗兔IgG的質(zhì)控線。
較優(yōu)的，所述彩色乳膠顆粒為粒徑290～300nm的聚苯乙烯顆粒。
較優(yōu)的，所述彩色乳膠顆粒的顏色為紅色。
本發(fā)明致敏乳膠聚酯膜上標(biāo)記有彩色乳膠顆粒的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ⅰ和免疫硝酸纖維素膜檢測(cè)線(T線)包被的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ⅱ均為單克隆抗體。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括以下步驟：
1)致敏乳膠顆粒的制備：用羧基化的聚苯乙烯標(biāo)記抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ι，獲得致敏乳膠顆粒；
2)致敏乳膠聚酯膜的制備：用步驟1)獲得的致敏乳膠顆粒包被聚酯膜，獲得致敏乳膠聚酯膜；
3)將抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ⅱ和羊抗兔抗體分別噴在硝酸纖維素膜檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)的位置上，烘干備用，制得免疫硝酸纖維素膜；
4)將濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在PVC片上，切裁制得試劑條；
5)將試劑條裝入塑料盒，獲得霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒。
較優(yōu)的，所述步驟1)致敏乳膠顆粒的制備為：
a.取一定體積的羧基化的聚苯乙烯，用2～3倍體積20mM pH 6.0的碳酸緩沖溶液多次沖洗、離心、棄上清，獲得羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀；
b.用1～1.5倍體積20mM pH6.0的磷酸緩沖溶液懸浮上一步獲得的羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀，并加入1～1.5倍體積的水溶性炭化二亞胺，室溫下攪拌20～30分鐘，最后用2～3倍體積0.01M pH 8.0的硼酸緩沖溶液多次沖洗、離心、棄上清，獲得待標(biāo)記物；
c.向步驟b獲得的所述待標(biāo)記物中加入2～3倍體積0.2M pH 7.0的硼酸緩沖液制成乳膠懸液，并向所述乳膠懸液中加入抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ι；
d.充分反應(yīng)過(guò)夜，加入終止劑終止反應(yīng)，獲得致敏乳膠顆粒。
在致敏乳膠顆粒的制備過(guò)程中，加入的水溶性炭化二亞胺、各緩沖溶液的體積均以初 始所取的羧基化的聚苯乙烯的體積為基準(zhǔn)，按本發(fā)明所述的體積倍數(shù)加入：如所取的羧基化的聚苯乙烯顆粒的體積為1ml，則需要加入的pH 6.0 20mM的磷酸緩沖溶液體積可以為1～1.5ml，pH 7.0 0.2M的硼酸緩沖液的體積為2～3ml。
更優(yōu)的，所述步驟a中碳酸緩沖溶液為20mM pH 6.0含0.01％SDS的碳酸緩沖溶液。添加有SDS的碳酸緩沖溶液可以更好的洗去乳膠的表面活性物，清洗效果更好。
更優(yōu)的，所述步驟a中羧基化的聚苯乙烯濃度為6～12w/v％。
更優(yōu)的，所述步驟a中的離心條件為12000～14000rpm，離心10min。
更優(yōu)的，所述步驟b中水溶性炭化二亞胺的濃度為9～10mg/ml。
更優(yōu)的，所述步驟b中的離心條件為12000～14000rpm，離心10min。
更優(yōu)的，所述步驟c乳膠懸液中羧基化的聚苯乙烯顆粒偶聯(lián)抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ι的量為：0.5mg抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ι/10mg聚苯乙烯顆粒。
更優(yōu)的，所述步驟d中終止劑為50mM pH 8.2的Tris-HCl。
本發(fā)明中，v％指體積百分比；w/v％指重量體積百分比，如1w/v％即為100ml溶液中含1g物質(zhì)。
較優(yōu)的，所述步驟2)中致敏乳膠聚酯膜的制備具體步驟為：
A.用乳膠緩沖液稀釋致敏乳膠顆粒，獲得0.3～0.5w/v％的致敏乳膠溶液；
B.用步驟A制備好的致敏乳膠溶液噴涂聚酯膜，干燥，制得致敏乳膠聚酯膜。
更優(yōu)的，所述步驟A中的乳膠緩沖液配方如下：9～11v％1.0M Tris液，0.25～0.35w/v％聚乙二醇20000，0.18～0.20w/v％牛血清白蛋白，0.15～0.25w/v％脫脂牛奶，0.28～0.30w/v％酪蛋白，和0.04～0.06w/v％疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0±0.02，余量為水。
最優(yōu)的，所述步驟A中的乳膠緩沖液配方如下：10v％1.0M Tris液、0.3w/v％聚乙二醇20000、0.2w/v％牛血清白蛋白，0.2w/v％脫脂牛奶、0.3w/v％酪蛋白，和0.05w/v％疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0±0.02，余量為水。
進(jìn)一步較優(yōu)的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和特異性，本發(fā)明所述的乳膠緩沖液還包括下列組分：果糖、氯化鉀和甘氨酸，且果糖、氯化鉀和甘氨酸的總濃度為3.25～4.75g/L，緩沖液的pH值為7.3－7.5。
更優(yōu)選的，各組分在乳膠緩沖液中的濃度為：
果糖1.0-2.0g/L；氯化鉀0.25-0.5g/L；甘氨酸2.0-2.25g/L。
更優(yōu)的，步驟B中用致敏乳膠溶液噴涂聚酯膜，每261mm×220mm聚酯膜上噴涂1.28 ml致敏乳膠溶液，干燥，制得致敏乳膠聚酯膜。
較優(yōu)的，所述步驟3)中，噴在硝酸纖維素膜質(zhì)控線(C線)上的羊抗兔IgG的濃度為1.0～2.0mg/ml，噴在硝酸纖維素膜檢測(cè)線(T線)上的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ⅱ濃度為1.0～2.0mg/ml。較優(yōu)的，每50m長(zhǎng)硝酸纖維素膜分別包被有6ml的羊抗兔IgG和6ml的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ⅱ溶液，檢測(cè)線和質(zhì)控線的間距為4.0～6.0mm。
本發(fā)明制備的霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒靈敏度高，特異性強(qiáng)；此外本發(fā)明的試劑盒還具有操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低，儲(chǔ)存和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒的使用方法：
1.樣品的處理：用專用取樣棒隨機(jī)從病人糞便的不同部位取樣，取樣量以沾滿專用取樣棒前端的小圓環(huán)為準(zhǔn)；準(zhǔn)備一個(gè)樣品處理管，豎直放于處理管支架上，并在樣品管里加入0.6ml蒸餾水；將專用取樣棒上取好的樣品插入樣品管中的蒸餾水充分?jǐn)嚢杈鶆颍瑐溆?；建議處理好的樣品及時(shí)檢測(cè)，如不能立即檢測(cè)處理好的樣品可在2～8℃下儲(chǔ)存48小時(shí)。
2.樣品的檢測(cè)：用吸管吸取樣品液2-3滴加入到樣品槽中，待檢樣品在毛細(xì)作用下向吸水紙端層析，依次通過(guò)聚酯膜、硝酸纖維素膜。到達(dá)聚酯膜后，被乳膠標(biāo)記的單克隆抗體充分識(shí)別并結(jié)合，繼續(xù)層析到硝酸纖維素膜上，與硝酸纖維素膜上包被的抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體單克隆-Ⅱ發(fā)生免疫反應(yīng)，顯現(xiàn)出相應(yīng)的紅色線條。
3.結(jié)果的判讀：在滴加樣品后8-15分鐘判讀結(jié)果。
陽(yáng)性：在檢測(cè)試劑條的檢測(cè)線和質(zhì)控線位置各出現(xiàn)一條紅色線條，表示樣品中有霍亂弧菌O1型抗原的存在。
陰性：只在質(zhì)控線位置出現(xiàn)一條紅色線條，表示樣品中無(wú)霍亂弧菌O1型抗原的存在。
無(wú)效：質(zhì)控線位置無(wú)紅線出現(xiàn)，表示結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重試。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒靈敏度高，特異性強(qiáng)；此外本發(fā)明的試劑盒還具有操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低，儲(chǔ)存和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)。
附圖說(shuō)明
圖1：霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒試劑條示意圖(1.濾樣紙2.致敏乳膠聚酯膜3.免疫硝酸纖維素膜4.吸水紙5.檢測(cè)線6.質(zhì)控線)
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。
當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
實(shí)施例1霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒的制備
一、試劑來(lái)源：
羊抗兔IgG多克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)美迪生物技術(shù)有限公司MAXMED LABORATORIES INC.)
硝酸纖維素薄膜、聚酯膜、聚苯乙烯顆粒(購(gòu)自德國(guó)賽多利斯公司SARTORIUS)
聚苯乙烯顆粒(購(gòu)自WHATMAN公司)
二、制備步驟：
方法1：
1.致敏乳膠顆粒的制備：
a.取0.4ml 10％羧基化的聚苯乙烯乳膠放入離心管中，加入1ml pH 6.0含0.01％SDS 20mM的碳酸緩沖液沖洗兩次，14000g/min離心10min，棄上清，獲得羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀。
b.用0.5ml pH 6.020mM的磷酸緩沖溶液懸浮上一步獲得的羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀，并加入0.5ml 10％水溶性炭化二亞胺，室溫下攪拌30分鐘，最后用0.8ml 0.01M pH 8.0的硼酸緩沖溶液沖洗三次、離心、棄上清，獲得待標(biāo)記物。
c.向步驟b獲得的待標(biāo)記物中加入1ml 0.2M pH 7.0的硼酸緩沖液制成乳膠懸液，并向該乳膠懸液中加入2mg抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ι。
d.充分反應(yīng)12小時(shí)后，加入50mM pH8.2的Tris-HCl作為終止劑終止反應(yīng)，獲得致敏乳膠顆粒。
2.致敏乳膠聚酯膜的制備：
(1)乳膠緩沖液的制備：取800ml純化水，往里加入100ml 1.0M Tris液，準(zhǔn)確稱取3.0g聚乙二醇20000、2.0g牛血清白蛋白，2.0g脫脂牛奶，3.0g酪蛋白溶液，0.5g疊氮化鈉，1.5g果糖，0.4g氯化鉀，2.20g甘氨酸，加入溶液中，充分溶解，混合均勻，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，加純化水至總體積1000ml。
(2)用上一步的乳膠緩沖液稀釋致敏乳膠顆粒，獲得0.4w/v％的致敏乳膠溶液。
(3)取1.28ml致敏乳膠溶液用點(diǎn)乳膠機(jī)噴點(diǎn)在預(yù)處理后的聚酯膜上，置于37℃的溫度下烘干2小時(shí)，密封4-30℃下避光保存，制得致敏乳膠聚酯膜。
3.免疫硝酸纖維素膜的制備：
將2.0mg/ml羊抗兔抗體和1.5mg/ml抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ⅱ分別噴在硝酸纖維素膜質(zhì)控線和檢測(cè)線的位置上，37℃下烘干2小時(shí)，密封4-30℃下避光保存，制得免疫硝酸纖維素膜。每50m長(zhǎng)硝酸纖維素膜分別包被有6ml的羊抗兔IgG和抗霍亂弧菌O1型單克隆抗 體Ⅱ溶液，檢測(cè)線和質(zhì)控線的間距為5mm。
4.將濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在PVC片上，切裁制得試劑條；將試劑條裝入塑料盒制得檢測(cè)試劑盒，獲得霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒。(如圖1所示)。
方法2：
1.致敏乳膠顆粒的制備：
a.取1ml 6％羧基化的聚苯乙烯乳膠放入離心管中，加入2ml pH 6.0含0.01％SDS20mM的碳酸緩沖液沖洗三次，12000g/min離心10min，棄上清，獲得羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀。
b.用1.5ml pH 6.0 20mM的磷酸緩沖溶液懸浮上一步獲得的羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀，并加入1.5ml 9％水溶性炭化二亞胺，室溫下攪拌20分鐘，最后用3ml 0.01M pH 8.0的硼酸緩沖溶液沖洗三次、離心、棄上清，獲得待標(biāo)記物。
c.向步驟b獲得的待標(biāo)記物中加入2ml pH 7.0 0.2M的硼酸緩沖液制成乳膠懸液，并向該乳膠懸液中加入2.5mg抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ι。
d.充分反應(yīng)過(guò)夜后，加入終止劑終止反應(yīng)，獲得致敏乳膠顆粒。
2.致敏乳膠聚酯膜的制備：
(1)乳膠緩沖液的制備：取800ml純化水，往里加入90ml 1.0M Tris液，準(zhǔn)確稱取3.5g聚乙二醇20000、1.8g牛血清白蛋白，1.5g脫脂牛奶，3.0g酪蛋白溶液，0.6g疊氮化鈉1.0g果糖，0.25g氯化鉀，2.00g甘氨酸，加入溶液中，充分溶解，混合均勻，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，加純化水至總體積1000ml。
(2)用上一步的乳膠緩沖液稀釋致敏乳膠顆粒，獲得0.2w/v％的致敏乳膠溶液。
(3)取1.28ml致敏乳膠溶液用點(diǎn)乳膠機(jī)噴點(diǎn)在預(yù)處理后的聚酯膜上，置于37℃的溫度下烘干2小時(shí)，密封4-30℃下避光保存，制得致敏乳膠聚酯膜。
3.免疫硝酸纖維素膜的制備：
將1.5mg/ml羊抗兔抗體和2.0mg/ml抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體抗體Ⅱ分別噴在硝酸纖維素膜質(zhì)控線和檢測(cè)線的位置上，37℃下烘干2小時(shí)，密封4-30℃下避光保存，制得免疫硝酸纖維素膜。每50m長(zhǎng)硝酸纖維素膜分別包被有6ml的羊抗兔IgG和抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體抗體Ⅱ溶液，檢測(cè)線和質(zhì)控線的間距為5mm。
4.同方法1。
方法3：
1.致敏乳膠顆粒的制備：
a.取0.5ml 12％羧基化的聚苯乙烯乳膠放入離心管中，加入1.5ml pH 6.0含0.01％SDS20mM的碳酸緩沖液沖洗兩次，13000g/min離心10min，棄上清，獲得羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀。
b.用0.5ml pH 6.0 20mM的磷酸緩沖溶液懸浮上一步獲得的羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀，并加入0.5ml 10％水溶性炭化二亞胺，室溫下攪拌25分鐘，最后用1.5ml 0.01M pH8.0的硼酸緩沖溶液沖洗兩次、離心、棄上清，獲得待標(biāo)記物。
c.向步驟b獲得的待標(biāo)記物中加入1.5ml pH 7.0 0.2M的硼酸緩沖液制成乳膠懸液，并向該乳膠懸液中加入3.75mg抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ι。
d.充分反應(yīng)過(guò)夜后，加入終止劑終止反應(yīng)，獲得致敏乳膠顆粒。
2.致敏乳膠聚酯膜的制備：
(1)乳膠緩沖液的制備：取800ml純化水，往里加入110ml 1.0M Tris液，準(zhǔn)確稱取2.5g聚乙二醇20000、1.9g牛血清白蛋白，2.5g脫脂牛奶，2.8g酪蛋白溶液和0.4g疊氮化鈉2.0g果糖，0.5g氯化鉀，2.25g甘氨酸加入溶液中，充分溶解，混合均勻，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，加純化水至總體積1000ml。
(2)用上一步的乳膠緩沖液稀釋致敏乳膠顆粒，獲得0.6w/v％的致敏乳膠溶液。
(3)取1.28ml致敏乳膠溶液用點(diǎn)乳膠機(jī)噴點(diǎn)在預(yù)處理后的聚酯膜上，置于37℃的溫度下烘干2小時(shí)，密封4-30℃下避光保存，制得致敏乳膠聚酯膜。
3.免疫硝酸纖維素膜的制備：
將1.0mg/ml羊抗兔抗體和1.0mg/ml抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ⅱ分別噴在硝酸纖維素膜質(zhì)控線和檢測(cè)線的位置上，37℃下烘干2小時(shí)，密封4-30℃下避光保存，制得免疫硝酸纖維素膜。每50m長(zhǎng)硝酸纖維素膜分別包被有6ml的羊抗兔IgG和抗霍亂弧菌O1型單克隆抗體Ⅱ溶液，檢測(cè)線和質(zhì)控線的間距為4mm。
4.同方法1。
實(shí)施例2對(duì)比試劑盒的制備
對(duì)比試劑盒的制備方法：乳膠緩沖液中不含果糖、氯化鉀和甘氨酸，其他試劑及實(shí)驗(yàn) 方法均同實(shí)施例1中方法1～3。
實(shí)施例3霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)
檢測(cè)方法：
1.取實(shí)施例1制備的霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒和實(shí)施例2的對(duì)比試劑盒，將試劑盒放置在水平臺(tái)面上。
2.待測(cè)樣品的制備：按表1的四類實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用專用取樣棒隨機(jī)從檢測(cè)者糞便的不同部位取樣，取樣量以沾滿專用取樣棒前端的小圓環(huán)為準(zhǔn)；準(zhǔn)備一個(gè)樣品處理管，豎直放于處理管支架上，并在樣品管里加入0.6ml蒸餾水；將專用取樣棒上取好的樣品插入樣品管中的蒸餾水充分?jǐn)嚢杈鶆蜃鳛榇郎y(cè)樣品。
3.每類實(shí)驗(yàn)對(duì)象為100人，檢測(cè)結(jié)果如表1：
表1霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒特異性試驗(yàn)結(jié)果
由上表可知，本發(fā)明的霍亂弧菌O1乳膠法檢測(cè)試劑盒對(duì)大腸桿菌及痢疾桿菌均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。
以上的實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明公開的實(shí)施方案，并不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發(fā)明中方法、組合物的變化，在不脫離本發(fā)明的范圍和精 神的前提下對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。雖然已結(jié)合本發(fā)明的多種具體優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了具體的描述，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不應(yīng)僅限于這些具體實(shí)施例。事實(shí)上，各種如上所述的對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的修改來(lái)獲取發(fā)明都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。