一種微囊藻毒素-LR定量快速檢測傳感器的制備及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
藻毒素(Microcystins，簡稱MC)已成為環(huán)境水體中被普遍關(guān)注的污染物之一。MC是一類具有生物活性的環(huán)狀七肽化合物，主要由淡水藻類銅綠微囊藻產(chǎn)生，至今已發(fā)現(xiàn)MC有70多種異構(gòu)體。它是一種以肝為靶器官的、高度特異的毒素，具有明顯的肝細(xì)胞毒性，隨著對MC毒性的深入研究，發(fā)現(xiàn)MC具有多器官毒性、遺傳性和致癌性。藻毒素結(jié)構(gòu)主要由N-甲基脫氫丙氨酸及兩個(gè)L-氨基酸殘基X和Z組成，常見的有MC-LR，RR，YR三種毒素(L、R、Y分別代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸)，而淡水中尤以MC-LR為主要毒素，藻毒素是一種藻細(xì)胞內(nèi)毒素，當(dāng)藻細(xì)胞衰老、死亡后，毒素才被釋放到水體中。大面積嚴(yán)重的水華會使水體中的毒素濃度達(dá)到mg/L的水平，所以，在水華爆發(fā)的夏、秋兩季節(jié)湖體中微囊藻毒素的濃度會較高。冬春兩季節(jié)，部分隨著藻細(xì)胞和懸浮物沉淀在沉積物中的毒素，也會在外界因素的影響下慢慢釋放出來，有報(bào)道沉底泥中吸附的藻毒素含量達(dá)到13mg/L—24mg/L。因此，對飲用水源水中微囊藻毒素的監(jiān)測應(yīng)該是一項(xiàng)長期的工作，分析方法的研究也主要針對MC-LR來建立的。
國內(nèi)外關(guān)于水質(zhì)監(jiān)測的方法很多，飲用水源水和自來水中微囊藻毒素的測定方法主要是高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)、高效液相色譜(HPLC)、薄層層析(TLC)、氣相色譜(GC)等，其中HPLC為我國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)推薦采用的測定微囊藻毒素的方法。但是這些方法都費(fèi)時(shí)費(fèi)力，具有滯后性，無法對源水進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。
本發(fā)明提出將無標(biāo)記免疫傳感技術(shù)應(yīng)用到微囊藻毒素的監(jiān)測上，在國內(nèi)外尚未見報(bào)道，既可以對源水進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，又可以對水廠飲用水的制備過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，做到及早知道，及早處理，對于人民生活安定，社會的和諧會有著巨大的作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種微囊藻毒素-LR定量快速檢測傳感器的制備及應(yīng)用，該方法主要利用抗原抗體反應(yīng)的高特異性、電化學(xué)信號的高靈敏性以及現(xiàn)代信息技術(shù)的高智能化相結(jié)合，構(gòu)建無標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感裝置，實(shí)現(xiàn)自來水水源、水處理過程及出廠水中微囊藻毒素的實(shí)時(shí)快速全自動(dòng)監(jiān)測。
本發(fā)明的技術(shù)方案：一種微囊藻毒素-LR定量快速檢測傳感器的制備方法，該檢測傳感器為阻抗型電化學(xué)傳感器，由CHI760C型電化學(xué)工作站，三電極體系：免疫電極為工作電極，飽和甘汞標(biāo)準(zhǔn)電極為參比電極，鉑絲電極為對電極組成；將L-半胱氨酸、膠體金、微囊藻毒素抗體復(fù)合物依次分別包被于裸金電極表面制成免疫電極作工作電極即為藻毒素傳感器；步驟為：
(1)電極清洗
先將Φ＝2mm金電極置于Piranha溶液中浸泡10min，再用0.3μm和0.05μm的Al2O3拋光粉將電極表面拋光成鏡面，最后分別用金電極等量的硝酸、無水乙醇、超純水超聲清洗5min，氮?dú)獯蹈桑糜?℃冰箱備用；
(2)電極的修飾
選擇L-半胱氨酸-納米金作為自組裝方式，將清洗好的Au電極浸入到pH為5.0的0.5％的L-半胱氨酸L-Cys中室溫下浸置5h，取出用超純水洗凈得到L-Cys修飾的Au電極，然后浸入納米金溶膠溶液中4℃自組裝12h；
所述納米金溶膠的配置：用新制雙蒸水配制100mL質(zhì)量濃度為0.01％氯金酸溶液，置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸，在100r/min磁力攪拌下，迅速加入預(yù)先在37℃保溫的質(zhì)量濃度1％檸檬酸三鈉溶液4.5mL，保持溫度和轉(zhuǎn)速不變，繼續(xù)攪拌加熱15min，直至溶液呈現(xiàn)清亮的酒紅色，室溫冷卻，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?b>
(3)檢測抗體的包被
藻毒素-LR—KLH免疫得到藻毒素-LR多抗；
用超純水充分清洗nano-Au/L-Cys/Au修飾電極，然后電極表面滴加10μL500μg/L的藻毒素-LR多抗溶液，37℃恒溫恒濕溫育60min后取出，最后滴加10μL含有1％BSA的PBS溶液，37℃恒溫恒濕培育30min后取出，用PBS洗滌，制得的免疫電極作工作電極即為藻毒素傳感器，利用電化學(xué)工作站CHI760C，進(jìn)行樣品中藻毒素的檢測，未立即使用的免疫電極需用氮?dú)獯蹈珊螅糜趐H7.4的PBS中于4℃保存待用。
所述方法制備的微囊藻毒素-LR定量快速檢測傳感器產(chǎn)品的應(yīng)用方法：
(1)繪制檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線：
取出已制備好的MC-LR免疫電極，平衡至室溫，按照濃度從低到高的順序，在電極表面依次滴加10μL不同濃度的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別于37℃下孵化15min后，PBS洗凈吹干，均采用循環(huán)伏安法CV，交流阻抗法EIS于[Fe(CN)6]3-/4-探針電解液中測定工作電極界面的變化，并對電極表面抗體的固定效果進(jìn)行表征；CV的測試條件：電壓-0.2～0.6V，掃描速度0.1V/S，掃描至穩(wěn)定；EIS的測試條件：初始電位為0.2V，振幅0.05V，頻率范圍為1～100kHz，靜置時(shí)間2s，所有測試均在室溫下進(jìn)行，檢測時(shí)間為3min；
(2)純凈水，礦泉水，自來水出口水的檢測：
水樣無需前處理，直接進(jìn)行測定，取10μL待測水樣，滴加于免疫電極表面，37℃恒溫恒濕培育15min，PBS洗凈吹干，采用循環(huán)伏安法CV，交流阻抗法EIS于[Fe(CN)6]3-/4-探針電解液中進(jìn)行測定，測定條件同上。
(3)天然湖泊水，污水，自來水的檢測
由有機(jī)玻璃深水采樣器進(jìn)行采樣，采水深度為0.5m以下，采樣量為5L；經(jīng)砂芯漏斗去除大顆粒雜質(zhì)，再經(jīng)過0.45μm濾膜減壓過濾，于-20℃低溫冰箱中保存待檢；吸取樣液10μL，滴加于免疫電極表面，37℃恒溫恒濕培育15min后，PBS洗凈吹干，采用循環(huán)伏安法CV，交流阻抗法EIS于[Fe(CN)6]3-/4-探針電解液中進(jìn)行測定，測定條件同上；
(4)等效電路計(jì)算：計(jì)算公式為：
ΔRet=Ret(Ab-Ag)-Ret(Ab)]]>
Ret(Ab)：免疫電極封閉后的電子傳遞阻抗值；
Ret(Ab-Ag)：免疫電極與MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后的電極電子傳遞阻抗值；
反應(yīng)前后電子傳遞阻抗的變化值；
以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，阻抗變化值()為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)樣液實(shí)測阻抗變化值計(jì)算水樣中微囊藻毒素-LR濃度。
本發(fā)明的有益效果：通過將L-半胱氨酸，膠體金，微囊藻毒素抗體復(fù)合物分別包被于裸金電極表面，采用微型甘汞標(biāo)準(zhǔn)電極為參比電極，鉑電極為對電極，Au作為工作電極材料。當(dāng)微囊藻毒素抗體與樣液中的抗原(MC-LR)結(jié)合時(shí)將引起參比電極與工作電極之間電勢差的變化，這種電勢差的變化與樣品中抗原濃度呈現(xiàn)定量關(guān)系，以此進(jìn)行微囊藻毒素的檢測。從而成功地建立了快速、特異、靈敏的檢測微囊藻毒素抗原的生物傳感器。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：天然湖水中微囊藻毒素-LR的定量快速檢測：
1前處理：
由有機(jī)玻璃深水采樣器進(jìn)行采樣，采水深度為0.5m以下，采樣量為5L。經(jīng)砂芯漏斗去除大顆粒雜質(zhì)，再經(jīng)過0.45μm濾膜減壓過濾。收集濾液。取適量濾液進(jìn)行檢測分析。
2微囊藻毒素-LR定量快速檢測傳感器的使用方法：
取出已制備好的MC-LR免疫電極傳感器，平衡至室溫。按照濃度從低到高的順序，在電極表面依次滴加10μL不同濃度的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣品提取液，并分別于37℃下孵化15min后，PBS洗凈吹干。采用循環(huán)伏安法(CV)，交流阻抗法(EIS)于[Fe(CN)6]3-/4-探針電解液中進(jìn)行測定。CV的測試條件：電壓-0.2～0.6V，掃描速度0.1V/S，掃描至穩(wěn)定；EIS的測試條件：初始電位為0.2V，振幅0.05V，頻率范圍為1～100kHz，靜置時(shí)間2s，所有測試均在室溫下進(jìn)行。
取樣液10μL，滴加于免疫電極表面，37℃下恒溫恒濕培育15min后，PBS洗凈吹干。采用循環(huán)伏安法(CV)，交流阻抗法(EIS)于[Fe(CN)6]3-/4-探針電解液中進(jìn)行測定。測定條件同上。該方法微囊藻毒素檢測線性范圍為：0.05～300ng/mL，檢出限為1.82×10-2ng/mL。