本發(fā)明涉及質譜檢測領域，尤其涉及一種利用基質輔助激光解析電離質譜檢測外泌體小分子代謝物的方法。

背景技術：

外泌體是直徑約為30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1的小囊泡。外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，外泌體是活細胞分泌的來源于晚期核內體(也稱為多囊泡體)的膜性囊泡。外泌體有很多重要的功能，例如執(zhí)行蛋白運輸功能，特異靶定受體細胞，交換蛋白和脂類或引發(fā)下游信號事件。外泌體也運輸核酸，參與細胞間通訊?？傊?，其蛋白、RNA和脂肪成分特異，且攜帶了一些重要的代謝小分子，有望在多種疾病的早期診斷中發(fā)揮作用。目前，對外泌體的分析方法主要是涉及蛋白、多肽和基因，而代謝分子的檢測與分析仍然存在很大的研究空缺。傳統(tǒng)的分析方法如生化法和電噴霧電離質譜(ESI)因為其繁雜的樣品預處理方法難以實現(xiàn)對于小分子快速高效的檢測。同時，現(xiàn)在普遍使用的方法中單次檢測通常需要毫升級別的樣品量，這對于小分子的檢測都帶來了極大的障礙。故我們采用基質輔助激光解析電離質譜(MALDI)，MALDI作為一種新型的軟電離生物樣品分析方式，能夠對不同分子量級別的物質進行分析。它代表了一種簡單，快速，精準的方式，能夠同時對多種生物分子進行檢測。這種方法的有效性不僅在理論上，也在實際應用中得到了應證。但傳統(tǒng)的基質容易在小分子量端(m/z<1000)產(chǎn)生背景噪聲，對于小分子的檢測帶來極大的干擾。且在實際的生物體系當中，生物樣品通常十分復雜。各種生物大分子的存在，以及不同的酸堿度，含鹽量都會對小分子的檢測帶來阻礙。因此傳統(tǒng)的基質難以滿足對于小分子檢測的需求，一種新型的可以用于生物體系檢測，且具有一定的抗干擾和一定的耐鹽性的基質材料亟待開發(fā)。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于現(xiàn)有技術的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種新型的基于顆粒輔助的質譜檢測技術。通過采用微納米級的顆粒材料作為基質，克服傳統(tǒng)基質的缺陷，快速、高通量、高靈敏度地定量外泌體中待測分子。

本發(fā)明的技術方案如下：

本發(fā)明提供了一種利用質譜檢測外泌體小分子代謝物的方法，包括以下步驟：

步驟1：儀器與試劑的準備：激光解析電離質譜，正離子模式檢測，只有信噪比大于10的質譜信號用于定性和定量分析；

步驟2：制備含鐵氧化物納米顆?；|，含鐵氧化物納米顆粒基質的制備包括以下步驟：

2.1：將三氯化鐵和檸檬酸三鈉溶解在乙二醇溶液中；

2.2：在上述的混合溶液中加入乙酸鈉，并在室溫下超聲半小時直到溶液變成均相體系；

2.3：反應在鐵氟龍高壓反應釜中進行，150-195攝氏度條件下反應8小時以上，從而形成含鐵氧化物納米顆粒；

2.4：將步驟2.3中得到的含鐵氧化物納米顆粒用乙醇和去離子水反復沖洗，最后在62～70攝氏度下干燥以備使用；

2.5：將含鐵氧化物納米顆粒重懸在去離子水中，作為基質使用；

步驟3：提取外泌體，將稀釋后的外泌體樣品點樣在靶板上，室溫下干燥；

步驟4：在外泌體樣品上點含鐵氧化物納米顆粒基質，室溫下干燥；

步驟5：對步驟4中得到的外泌體樣品進行質譜檢測；

步驟6：對質譜檢測結果進行分析，得出結論。

進一步地，含鐵氧化物納米顆?；|的直徑小于1μm，顆粒粒度均一，含鐵氧化物納米顆?；|具有粗糙表面。

進一步地，含鐵氧化物納米顆?；|為Fe_xO_y或其混合物,其中x為小于等于10，y為大于等于0小于等于10。

進一步地，含鐵氧化物納米顆?；|的尺寸范圍為200nm～300nm。

進一步地，含鐵氧化物納米顆?；|的粗糙表面由50nm以下的納米小球組成。在性能方面，該含鐵氧化物顆粒具有紫外吸收。

更進一步地，含鐵氧化物納米顆?；|的粗糙表面由直徑為5nm～8nm的納米小球組成。

進一步地，對外泌體的稀釋倍數(shù)小于10000倍以得到外泌體樣品。

進一步地，外泌體包括血清，血漿和細胞中提取的外泌體。

進一步地，檢測分子量范圍為小于等于10000Da。

進一步地，檢測的分子包括糖類和氨基酸。

本發(fā)明的有益效果在于：微納米級的含鐵氧化物顆?；|制備成本低，可以大批量制作，合成步驟簡單；該微納米級的含鐵氧化物顆?；|能夠去除傳統(tǒng)基質的背景干擾和熱點效應，具有高耐鹽性。本發(fā)明只需消耗痕量外泌體，在無需富集、分離操作的前提下即可快速、高效地定量檢測分析外泌體中的代謝物；整個檢測過 程步驟簡單、成本低、通量高；所獲得的定量結果準確度高，可應用于臨床中。

以下將結合附圖對本發(fā)明作進一步說明，以充分說明本發(fā)明的目的、技術特征和技術效果。

附圖說明

圖1為本發(fā)明較優(yōu)實施例中制備得到的鐵氧化物顆粒的表征圖片，圖1a為SEM表征圖片，圖1b為TEM表征圖片；

圖2為具體實施例1中激光解析電離技術檢測由血清提取的外泌體中代謝小分子的質譜圖?！硎灸蛩?，表示乳酸，●表示半胱氨酸，■表示甘露醇；

圖3為具體實施例2中激光解析電離技術檢測由細胞提取的外泌體中代謝小分子的質譜圖?！硎灸蛩?，表示乳酸，示纈氨酸，示精氨酸，示葡萄糖。

具體實施方式

下面結合附圖及實施例對本發(fā)明進行進一步描述。

含鐵氧化物納米顆?；|的制備包括以下步驟：

步驟1：將三氯化鐵和檸檬酸三鈉溶解在乙二醇溶液中；

步驟2：在上述的混合溶液中加入乙酸鈉，并在室溫下超聲半小時直到溶液變成均相體系；

步驟3：反應將在鐵氟龍高壓反應釜中進行，在150-195攝氏度下反應8小時以上，形成含鐵氧化物納米顆粒；

步驟4：將步驟3中得到的含鐵氧化物納米顆粒用乙醇和去離子水反復沖洗，最后在62～70攝氏度下干燥以備使用；

步驟5：將含鐵氧化物納米顆粒重懸在去離子水中，作為基質使用。

基質的表征：

表征所用儀器有：表征所用儀器有：采用JEOL JEM-2100F儀器獲得透射電鏡圖片、高分辨透射電鏡圖片以及選區(qū)電子衍射花樣；采用硅片制備掃描電鏡樣品，并通過Hitachi S-4800儀器獲得掃描電鏡圖片；

表征結果為：

所獲得的顆粒材料為球形，尺寸大小約為250 nm。如圖1所示，通過透射電鏡圖片可以看出，顆粒材料具有亞單元結構，并且通過選取顆粒材料邊緣區(qū)域獲得高分辨率透射電鏡圖片也可以看出，規(guī)整的晶格圖形進一步證明顆粒材料是由很多納米晶體組成。根據(jù)測得的掃描電鏡圖片，可以看出顆粒材料表面呈現(xiàn)粗糙狀，并且尺寸均一。以上結構是成為良好的生物分子質譜檢測的基質材料的重要條件。

下面通過幾個典型的應用實施例來進一步闡明基質輔助激光解析電離質譜在外泌體代謝分子的檢測分析中的應用。

實施例1：血清提取的外泌體中代謝小分子的檢測

(1)儀器與試劑的準備：激光解析電離質譜儀，只有信噪比大于10的質譜信號用于分析。采用AB SCIEX TOF/TOF^TM 5800質譜儀，Nd:YAG激光器，波長為355nm。采用脈沖電場延時提取及反射的工作方式，正離子模式進行檢測。采用DataExplorer觀察、處理、分析數(shù)據(jù)，只有信噪比大于10的質譜信號用于分析。

(2)制備含鐵氧化物納米顆粒。

(3)取1ml～10ml血清，15000-25000G轉速下超高速離心4～10小時提取外泌體，配置0.1mg/ml～10mg/ml濃度的外泌體溶液。

(4)依次用甲酸、無水乙醇、去離子水超聲清洗MALDI靶板共1.5小時。

(5)含鐵氧化物納米顆粒在去離子水中超聲震蕩分散，與外泌體溶液混合，點樣于干燥的MALDI靶板。

(6)樣品干燥后，用激光解析離子化質譜檢測。

結果如圖2所示。

實施例2：細胞提取的外泌體中代謝小分子的檢測

(1)儀器與試劑的準備：激光解析電離質譜儀，只有信噪比大于10的質譜信號用于分析。采用AB SCIEX TOF/TOF^TM 5800質譜儀，Nd:YAG激光器，波長為355nm。采用脈沖電場延時提取及反射的工作方式，正離子模式進行檢測。采用DataExplorer觀察、處理、分析數(shù)據(jù)，只有信噪比大于10的質譜信號用于分析。

(2)制備含鐵氧化物納米顆粒。

(3)取1ml-10ml細胞溶液(對各種類型的細胞適用)，15000-25000G轉速下超高速離心4～10小時提取外泌體，配置0.1mg/ml～10mg/ml濃度的外泌體溶液。

(4)依次用甲酸、無水乙醇、去離子水超聲清洗MALDI靶板共1.5小時。

(5)含鐵氧化物納米顆粒在去離子水中超聲震蕩分散，與外泌體溶液混合，點樣于干燥的MALDI靶板。

(6)樣品干燥后，用激光解析離子化質譜檢測。

結果如圖3所示。

以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員依本發(fā)明的構思在現(xiàn)有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。