本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因油菜、大豆等作物的谷物散糧及其粗加工產(chǎn)品中的蛋白CP4-EPSPS的快速檢測方法，屬于轉(zhuǎn)基因檢測領域。

背景技術：

隨著各種各樣的轉(zhuǎn)基因食品大量涌入市場，轉(zhuǎn)基因食品的安全性日益?zhèn)涫荜P注，世界各國對轉(zhuǎn)基因食品的安全性存在較大的爭議。歐盟，日本等地區(qū)已制定相關法規(guī)對轉(zhuǎn)基因食品進行嚴格的管理。因此，快速檢測轉(zhuǎn)基因作物/植物中轉(zhuǎn)基因蛋白的方法具有重要的意義。

自1996年孟山都(Monsato)公司上市第一例抗草甘膦大豆一來，轉(zhuǎn)基因作物的推廣應用經(jīng)歷了18年，抗除草劑性狀仍然是轉(zhuǎn)基因植物的首要性狀。CP4EPSPS被應用于多種作物的轉(zhuǎn)基因研究中，包括玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜和苜蓿等。

隨著各種各樣的轉(zhuǎn)基因食品通過貿(mào)易大量進入國際市場，轉(zhuǎn)基因食品的安全性受到人們的日益關注，世界各國對轉(zhuǎn)基因食品的安全性存在著較大的爭議，歐盟、日本等地區(qū)已經(jīng)制定了相關法規(guī)對轉(zhuǎn)基因食品進行了嚴格的管理。因此，檢測轉(zhuǎn)基因作物/植物中轉(zhuǎn)基因蛋白的定量技術逐漸成為研究熱點之一。

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)是莽草酸合成途徑中的關鍵酶，能夠催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與莽草酸-3-磷酸(SP3)生成5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)，為芳香族氨基酸的合成提供前提物質(zhì)，該酶廣泛存在于微生物和高等植物體內(nèi)。除草劑草甘膦的靶標酶即為EPSPS。來自根癌農(nóng)桿菌CP4菌株的EPSPS對高濃度的草甘膦表現(xiàn)出非常高的抗性，從此，該基因被廣泛用于多種轉(zhuǎn)基因作物中。

目前常用的CP4-EPSPS檢測方法包括基于DNA的PCR檢測方法及基于蛋白質(zhì)的酶聯(lián)免疫吸附法。PCR法能夠從作物種子開始到作物成熟整個過程中對轉(zhuǎn)基因成分進行精確檢測，不受樣品的處理方法的影響，但易出現(xiàn)假陽 性和假陰性等問題，且因經(jīng)高度處理過的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其衍生物，如植物油、糖或者淀粉等中不含任何DNA成分，因此PCR方法無法實現(xiàn)對此類轉(zhuǎn)基因食品的檢測。酶聯(lián)免疫吸附法可對樣本進行批量處理，但其耗時較長，需要專業(yè)技術人員，且需特殊的儀器，因此該種檢測方法不利于在無相關專業(yè)技術用戶市場的推廣和使用。本發(fā)明采用膠體碳免疫層析技術，可實現(xiàn)快速檢測，肉眼即可進行判斷，無需專業(yè)技術人員的便于推廣的目的。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述情況，本發(fā)明提供一種利用膠體碳建立的快速檢測轉(zhuǎn)基因作物(油菜、大豆等)的谷物散糧及其粗加工產(chǎn)品中的CP4-EPSPS的檢測試紙條，采用標記了兔多克隆抗體E01的膠體碳墊與包被了兔多克隆抗體C01的硝酸纖維素膜(檢測線)和包被了羊抗兔IgG的硝酸纖維素膜(質(zhì)控線)制成硝酸纖維素膜配合；采用雙抗體夾心免疫層析的原理，樣本中的抗原在側(cè)向移動的過程中與膠體碳標記的特異性抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復合物，繼續(xù)向前方流動和硝酸纖維素膜的檢測線上特異性抗體結(jié)合形成雙抗體夾心復合物進而形成肉眼可見的條帶而進行結(jié)果的判定，它具備操作簡便，迅速，反應靈敏度高，成本低以及便于大規(guī)模推廣使用的優(yōu)點。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：

快速檢測轉(zhuǎn)基因植物中CP4-EPSPS的方法，包括以下步驟：

步驟一，膠體碳的制備；

步驟二，適合PH值條件下膠體碳標記抗體的制備；

步驟三，抗體包被至反應膜作為T線及二抗包被至反應膜的C線；

步驟四，膠體碳試紙條的制備；

步驟五，從待檢植物中提取蛋白，制備蛋白提取液；

步驟六，將檢測試紙條插入蛋白提取液中反應；

步驟七，適當反應時間后，進行肉眼判斷結(jié)果。

優(yōu)選的，步驟二中所述抗體為兔抗CP4-EPSPS多克隆抗體；優(yōu)選的，步驟二中PH值為8～10，最優(yōu)選的PH值為9.0。

優(yōu)選的，步驟三中所述抗體亦為兔抗CP4-EPSPS多克隆抗體。

優(yōu)選的，步驟三中抗體包被量為100ug/1ml碳。

優(yōu)選的，步驟三中所述二抗為羊抗兔IgG抗體。

優(yōu)選的，步驟六中所述反應溫度為10℃～30℃，更優(yōu)選15℃-25℃。

優(yōu)選的，步驟七中所述反應時間為3-15分鐘，更優(yōu)選5-10分鐘。

本發(fā)明的優(yōu)點是：采用膠體碳免疫層析技術，可實現(xiàn)快速檢測，肉眼即可進行判斷，無需專業(yè)技術人員的便于推廣的目的。采用膠體碳檢測試紙條，制備出表面帶有游離氨基基團的膠體碳納米顆粒，膠體碳相對膠體金具備一系列優(yōu)越性：膠體碳較膠體金更易制備，更易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)且批間差??；膠體碳黑白信噪比更高，而膠體金紅白對照不易辨別且易受全血檢測的影響；檢測動力學范圍更廣，大大降低了膠體金易出現(xiàn)的HOOK效應的可能性；較膠體金更穩(wěn)定，可于室溫下保存更久；固態(tài)碳對環(huán)境友好，避免了膠體金技術出現(xiàn)的環(huán)境重金屬污染的情況?？焖贆z測轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因蛋白采用雙抗體夾心免疫層析的原理，樣本中的抗原在側(cè)向移動的過程中與膠體碳標記的特異性抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復合物，繼續(xù)向前方流動和NC膜檢測線上特異性抗體結(jié)合形成雙抗體夾心復合物進而形成肉眼可見的條帶而進行結(jié)果的判定。

一種CP4-EPSPS膠體碳快速檢測試紙條，其特征在于，包括PVC底板、樣品墊、硝酸纖維素膜、質(zhì)控線、檢測線、吸水濾紙，PVC底板一側(cè)設有樣品墊，另一側(cè)設有吸水濾紙；樣品墊和吸水濾紙之間設有硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜右側(cè)卡接在吸水濾紙中；所述硝酸纖維素膜中部設有檢測線和質(zhì)控線，檢測線靠近樣品墊，還包括膠體碳墊，所述膠體碳墊為包被兔多克隆抗體E01的膠體碳墊，樣品墊右端與膠體碳墊搭接相連，膠體碳墊右側(cè)與硝酸纖維素膜搭接相連。

一種CP4-EPSPS膠體碳快速檢測試紙條的使用方法，包括以下步驟：

一、樣本處理：

a)稱取待測谷物樣品至帶有蓋子的反應容器中；

b)利用攪拌機或其它類似設備將谷物打碎成細顆粒狀；

c)依據(jù)樣品總質(zhì)量加入相應體積的超純水或去離子水，其中水的體積(毫升)為樣品總質(zhì)量(克)的4～6倍；

d)擰緊反應容器的蓋子，上下振蕩至少30～60秒，確保樣品與超純水 或去離子水充分混勻；

e)靜置至反應容器中固體物質(zhì)沉降；

二、樣本檢測：

a)用吸管吸取反應容器中上清液加入樣品杯，直至樣品杯中上清液加滿至基準線，保證樣品杯中的上清液中沒有顆粒物；

b)靜置30～60秒后，將樣品杯中的上清液滴入快速檢測試紙條的加樣區(qū)，即可開始測試；

三、結(jié)果判斷：

當上清液為陰性(-)時：檢測線(T線)不顯色；當上清液為陽性(+)時：檢測線(T線)顯黑色、肉眼可見；當未出現(xiàn)質(zhì)控線(C線)，可能操作不當或試紙已失效。在此情況下，應再次仔細閱讀說明書，并用新的試紙重新測試。

優(yōu)選的，步驟一c)中加入的超純水或去離子水為樣品總質(zhì)量的5倍。

優(yōu)選的，步驟一d)中振蕩時間為30秒。

優(yōu)選的，步驟二a)進行之前，將反應器中混合液于離心機(日立離心機，CF16RXII)中1000rpm離心5分鐘。

優(yōu)選的，步驟二b)中靜置時間為30秒。

本發(fā)明的優(yōu)點是：采用標記了多克隆抗體E01的膠體碳墊與包被了多克隆抗體E01的硝酸纖維素膜(檢測線)和包被了羊抗兔IgG的硝酸纖維素膜(質(zhì)控線)制成檢測試紙條；采用雙抗體夾心免疫層析的原理，樣本中的抗原在側(cè)向移動的過程中與膠體碳標記的特異性抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復合物，繼續(xù)向前方流動和硝酸纖維素膜的檢測線上特異性抗體結(jié)合形成雙抗體夾心復合物進而形成肉眼可見的條帶而進行結(jié)果的判定。本檢測試紙采用膠體金標記，較膠體金制備更簡單難，黑白信噪比更低，且不易受全血檢測的影響，不易出現(xiàn)的HOOK效應，穩(wěn)定且易保存，且成本較低。綜上所述，本檢測試紙條具備操作簡便，迅速，反應靈敏度高，成本低以及便于大規(guī)模推廣使用的優(yōu)點。

附圖說明

圖l為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明檢測轉(zhuǎn)基因油菜籽的檢測結(jié)果。

圖3為本發(fā)明檢測轉(zhuǎn)基因大豆的檢測結(jié)果。

在圖中：1-PVC底板，2-樣品墊，3-硝酸纖維素膜，4-質(zhì)控線，5-檢測線，6-吸水濾紙，7-膠體碳墊，8-加樣區(qū)。

具體實施方式

為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體圖示，進一步闡述本發(fā)明。

參見圖1～圖3，一種快速檢測轉(zhuǎn)基因植物中CP4-EPSPS的方法，包括以下步驟：

步驟一，膠體碳的制備；

步驟二，適合PH值條件下膠體碳標記抗體的制備；

步驟三，抗體包被至反應膜作為T線及二抗包被至反應膜的C線；

步驟四，膠體碳試紙條的制備；

步驟五，從待檢植物中提取蛋白，制備蛋白提取液；

步驟六，將檢測試紙條插入蛋白提取液中反應；

步驟七，適當反應時間后，進行肉眼判斷結(jié)果。

優(yōu)選的，步驟二中所述抗體為兔抗CP4-EPSPS多克隆抗體；優(yōu)選的，步驟二中PH值為8～10，最優(yōu)選的PH值為9.0。

優(yōu)選的，步驟三中所述抗體亦為兔抗CP4-EPSPS多克隆抗體。

優(yōu)選的，步驟三中抗體包被量為200ug/1ml碳。

優(yōu)選的，步驟三中所述二抗為羊抗兔IgG抗體。

優(yōu)選的，步驟六中所述反應溫度為10℃～30℃，更優(yōu)選15℃-25℃。

優(yōu)選的，步驟七中所述反應時間為3-15分鐘，更優(yōu)選5-10分鐘。

作為優(yōu)選實施例，步驟一膠體碳的制備方法具體為：

1、向100g碳粉中加入超純水，定容至500ml，攪拌溶解30分鐘后離心(12000g，30分鐘)，收集上清于干凈的燒杯中；

向步驟1的溶液中加入0.5g十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)，并定容至500ml，即溶液中碳粉的終濃度(質(zhì)量體積比)為20％，CTAB的終濃度(質(zhì)量體積比)為0.1％；

2、將步驟2所得溶液進行超聲破碎：超聲變幅桿Φ6，輸出功率60％，超聲開時3秒，關時3秒，總時長5分鐘(寧波新芝超聲波細胞粉碎機，Scientz-IID)，使之成為懸浮狀的膠體碳納米顆粒溶液；電鏡下觀察，顆粒直徑覆蓋范圍由數(shù)十納米至數(shù)百納米不等；

3、向步驟3所得溶液中加入100ml的無水乙醇，充分攪勻后，加入10ml硅烷化試劑(購于Thermo公司，貨號48927)，攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘，通入氮氣情況下，55℃反應8小時；待反應結(jié)束后，用無水乙醇清洗3～5次，然后再用0.02M PBS(PH7.4)緩沖液洗滌3～5次，至此，制備完成表面帶有游離氨基基團的膠體碳納米顆粒。

作為優(yōu)選實施例，步驟二適合PH值條件下膠體碳標記抗體的制備具體方法為：

1、膠體碳最適PH值確定

向一系列不同PH值梯度的硼酸鹽緩沖液中先后加入0.1％納米碳懸液及0.1％TritonX-100。超聲處理(300W，超聲6秒停4秒，工作80個循環(huán))上述混合液后，200rpm離心10分鐘，收集上清并靜置24小時后，觀察無沉淀者即為最適PH值。本發(fā)明中，PH9時，膠體碳最為穩(wěn)定，無沉淀，因此PH 9作為標記抗體最適PH值。

2、多克隆抗體的膠體碳標記

向800ul 0.02M硼酸緩沖液(PH9.0，下同)中加入200ul抗CP4-EPSPS多克隆抗體E01(購買于華葵金配公司，1mg/ml)，渦旋振蕩混勻。向上述混合液中加入20ul 1.5％(質(zhì)量體積比)EDC溶液，于室溫條件下旋轉(zhuǎn)震蕩20分鐘；向上述混合液中加入200ul實施例所制備膠體碳納米顆粒，于恒溫搖床中300轉(zhuǎn)，25℃放置2小時；向上述混合液中加入100ul含20％BSA的硼酸緩沖液，繼續(xù)于恒溫搖床中300轉(zhuǎn)，25℃放置5小時；于12000g離心20分鐘，留取沉淀，0.02M硼酸緩沖液反復重懸-離心，洗滌4次；最終，1ml 0.02M硼酸鹽緩沖液重懸沉淀并于超聲破碎儀(寧波新芝超聲波細胞粉碎機，Scientz-IID)中，超聲分散輸出功率60％，超聲開時3秒，關時3秒，總時長5分鐘；至此，即得膠體碳標記的CP4-EPSPS抗體，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

作為優(yōu)選實施例，CP4-EPSPS膠體碳快速檢測試紙條的制備方法具體為：

本發(fā)明檢測試紙條采用雙抗體夾心免疫層析的原理，樣本中的抗原在側(cè)向移動的過程中與膠體碳標記的特異性抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復合物，繼續(xù)向前方流動和NC膜檢測線上特異性抗體結(jié)合形成雙抗體夾心復合物進而形成肉眼可見的條帶而進行結(jié)果的判定。具體步驟包括：

1、制備用膠體碳標記的CP4-EPSPS抗體E01。

2、碳標墊及反應膜的制備：

按照1∶100比例稀釋膠體碳標記的兔抗CP4-EPSPS多克隆抗體E01，噴涂于膠體碳墊上，干燥后備用；按照1∶8000比例稀釋多克隆抗體E01(初濃度為1mg/ml，購買于華葵金配公司)及1∶10000比例稀釋羊抗兔IgG(初濃度為1mg/ml)后分別包被于硝酸纖維素膜的T線及C線位置，干燥后備用。3、貼膜及切膜：

從左向右依次將樣品墊，膠體碳墊，硝酸纖維素膜，吸水濾紙依次貼附于PVC底板上且相互之間依附搭接相連。完成之后將試紙切割成寬3mm的試紙條成品。

一種CP4-EPSPS膠體碳快速檢測試紙條的使用方法，包括以下步驟：

一、樣本處理：

a)稱取待測谷物樣品至帶有蓋子的反應容器中；

b)利用攪拌機或其它類似設備將谷物打碎成細顆粒狀；

c)依據(jù)樣品總質(zhì)量加入相應體積的超純水或去離子水，其中水的體積(毫升)為樣品總質(zhì)量(克)的4～6倍；

d)擰緊反應容器的蓋子，上下振蕩至少30～60秒，確保樣品與超純水或去離子水充分混勻；

e)靜置至反應容器中固體物質(zhì)沉降；

二、樣本檢測：

a)用吸管吸取反應容器中上清液加入樣品杯，直至樣品杯中上清液加滿至基準線，保證樣品杯中的上清液中沒有顆粒物；

b)靜置30～60秒后，將樣品杯中的上清液滴入快速檢測試紙條的加樣區(qū)，即可開始測試；

三、結(jié)果判斷：

當上清液為陰性(-)時：檢測線(T線)不顯色；當上清液為陽性(+)時：檢測線(T線)顯黑色、肉眼可見；當未出現(xiàn)質(zhì)控線(C線)，可能操作不當或試紙已失效。在此情況下，應再次仔細閱讀說明書，并用新的試紙重新測試。

優(yōu)選的，步驟一c)中加入的超純水或去離子水為樣品總質(zhì)量的5倍。

優(yōu)選的，步驟一d)中振蕩時間為30秒。

優(yōu)選的，步驟二a)進×行之前，將反應器中混合液于離心機(日立離心機，CF16RXII)中1000rpm離心5分鐘。

優(yōu)選的，步驟二b)中靜置時間為30秒。

本發(fā)明CP4-EPSPS快速檢測試紙條的性能評價：

(1)將本發(fā)明所述CP4-EPSPS快速檢測試紙條分別檢測MS8×RF3×GT73雜合油菜籽(圖2，A(100％)、B(5％)、C(1％))及非轉(zhuǎn)基因油菜籽(圖2，D)，可見本發(fā)明可有效區(qū)分轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因油菜籽，且隨著轉(zhuǎn)基因成分的增加，檢測結(jié)果逐漸增強。

將本發(fā)明所述CP4-EPSPS快速檢測試紙條分別檢測RRS抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆(圖3，A(5％)，B(1％))及非轉(zhuǎn)基因大豆(圖3，C)，可見本發(fā)明可有效區(qū)分轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因大豆，且隨著轉(zhuǎn)基因成分的增加，檢測結(jié)果逐漸增強。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。