本發(fā)明涉及中藥質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及含有黃芪和莪術(shù)藥材的復(fù)方藥物制劑中的黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

黃莪膠囊是浙江康恩貝制藥股份有限公司、浙江現(xiàn)代中藥與天然藥物研究院有限公司聯(lián)合中國(guó)中醫(yī)研究院廣安門(mén)醫(yī)院研制的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，其組方由黃芪、桃仁、莪術(shù)、大黃、土茯苓、薏苡仁、益母草、夏枯草、肉桂、北豆根、桔梗、川牛膝共12味中藥組成，具有益氣活血、清熱利濕功能，主治前列腺增生氣虛血瘀、濕熱阻滯證。黃莪膠囊已于2011年獲國(guó)家新藥證書(shū)，并經(jīng)SFDA批準(zhǔn)上市。

黃莪膠囊是依據(jù)中醫(yī)理論和臨床實(shí)踐配制而成的治療前列腺增生藥物，其組方多 達(dá)十二味中藥材，制備工藝復(fù)雜。中國(guó)專利ZL200510060631.3公開(kāi)了黃莪膠囊治療前列腺增生癥的相關(guān)研究結(jié)果及其制備方法，其制備方法是取肉桂、大黃、薏苡仁、桃仁碎成細(xì)粉；莪術(shù)飲片提揮發(fā)油；黃芪水提醇沉；桃仁、薏苡仁、土茯苓、北豆根、夏枯草、益母草、桔梗、川牛膝的飲片、莪術(shù)藥渣，水提濾液與黃芪乙醇液合并濃縮制干膏，粉碎，過(guò)篩，加入莪術(shù)揮發(fā)油及肉桂等藥物的細(xì)粉，配以藥用輔料制成膠囊。黃芪是黃莪膠囊組方的君藥，益氣、推動(dòng)血行，可消散血瘀，是黃莪膠囊的主要藥效成分之一，文獻(xiàn)“HPLC-ELSD測(cè)定黃莪通閉膠囊中黃芪甲苷的含量”和藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)都采用HPLC-ELSD法測(cè)定了黃莪膠囊中黃芪甲苷的含量，雖然后者還采用薄層色譜法鑒別莪術(shù)、大黃、熊果酸和桂皮醛，但這些已公開(kāi)資料都僅對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行定量分析，缺乏對(duì)其他組分的測(cè)定分析，有可能導(dǎo)致其它組分含量的不穩(wěn)定甚至缺乏，這將使黃莪膠囊的質(zhì)量難以得到全面控制。

尤其是，中藥材莪術(shù)在黃莪膠囊組方中為臣藥，具有行氣活血功效，但其主要的有效成分是一種易揮發(fā)性油，其在制備和儲(chǔ)藏過(guò)程中都容易因?yàn)閾]發(fā)而含量損失；而且，莪術(shù)油的生物利用度較低。因此，如何有效減少莪術(shù)油在生產(chǎn)、儲(chǔ)存過(guò)程中的揮發(fā)、提高其生物利用度,達(dá)到安全有效、質(zhì)量可控的目標(biāo)，是黃莪膠囊在技術(shù)研究中要重點(diǎn)解決的問(wèn)題。研究人員在黃莪膠囊制備過(guò)程中采用β-環(huán)糊精包結(jié)莪術(shù)油的辦法解決了這個(gè)難題。而有關(guān)研究也表明，莪術(shù)油包結(jié)率的高低影響著黃莪膠囊治療前列腺增生癥的療效。但是莪術(shù)油的成分較為復(fù)雜且含量較低，國(guó)內(nèi)外常用牻牛兒酮、莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮等為莪術(shù)油質(zhì)量的檢測(cè)指標(biāo)；而牻牛兒酮的含量最為豐富且最穩(wěn)定，因此，以牻牛兒酮為莪術(shù)油的質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)是一種較受推薦的方法。所以，為了保證黃莪膠囊組方中各味藥材的協(xié)同作用，為了保證黃莪膠囊質(zhì)量的穩(wěn)定性和療效的有效性，在黃莪膠囊的質(zhì)量控制方法中，不僅要檢測(cè)黃芪甲苷的含量，而且有必要同時(shí)測(cè)定其牻牛兒酮的含量。

黃芪甲苷通常作為評(píng)價(jià)黃芪藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)，目前含有黃芪甲苷的中藥有黃 芪藥材和含有黃芪的膠囊、顆粒、散劑等中藥復(fù)方制劑。而黃芪甲苷為環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物，易溶于甲醇、乙醇、丙酮，難溶于氯仿、乙酸乙酯等弱酸性有機(jī)溶劑。其早期的含量測(cè)定主要使用薄層掃描法，如張怡等(中國(guó)醫(yī)藥雜志2004.1(5):185-186)采用雙波長(zhǎng)-薄層色譜法測(cè)定康胃泰膠囊中黃芪甲苷的含量，樣品平均回收率為98.27%；但該方法重復(fù)性較差。隨著應(yīng)用研究的不斷深入，逐漸發(fā)展出采用HPLC法分離測(cè)定黃芪甲苷的含量，該方法也先后經(jīng)歷HPLC-UV法和HPLC-ELSD法的演變，ELSD法具有靈敏度高、適用性廣的優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于在近紫外區(qū)無(wú)紫外吸收或紫外吸收較弱的物質(zhì)，如黃芪甲苷等。李毅等(時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥2011.22(3):768-769)先采用石油醚溶解活血散結(jié)合劑（組方為當(dāng)歸、黃芪、莪術(shù)、川芎、昆布等藥材），水層多步正丁醇提取，然后用氨試液洗滌，再將正丁醇溶液于水浴中蒸干，最后加甲醇溶解得供試品溶液，用shim-pack C18-ODS(150mm×4.6mm，5μm)色譜柱，以乙腈-水（32∶68）流動(dòng)相測(cè)定活血散結(jié)合劑中黃芪甲苷的含量，結(jié)果表明HPLC-ELSD法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，靈敏度高，專屬性強(qiáng)。

《中國(guó)藥典》2010版以牻牛兒酮為指標(biāo)，采用薄層色譜法鑒別莪術(shù)藥材；且莪術(shù)藥 材的含量測(cè)定規(guī)定莪術(shù)揮發(fā)油的含量不得少于1.5%（mg/g）。牻牛兒酮作為莪術(shù)藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)已得到普遍認(rèn)可，其為倍半萜類化合物，其能溶于甲醇、乙醇、石油醚等有機(jī)溶劑中，不溶于水。莪術(shù)等含有牻牛兒酮的藥材和注射劑、膠囊等復(fù)方制劑中牻牛兒酮含量測(cè)定早期曾經(jīng)采用比色法，但精密度、重復(fù)性和適用性存在局限，后來(lái)多采用HPLC法和GC法，HPLC法是牻牛兒酮含量測(cè)定最常使用的檢測(cè)方法。梁小潔等(貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版2011.29(1):92-94)直接用甲醇溶解保婦康泡沫劑制得供試品溶液，用SpherisorbC18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，以乙腈-甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶25∶25）為流動(dòng)相測(cè)定牻牛兒酮的含量。結(jié)果表明，HPLC法測(cè)定牻牛兒酮含量操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。

已有上百種同時(shí)含有黃芪和莪術(shù)的中藥復(fù)方制劑被批準(zhǔn)上市，但目前對(duì)這類復(fù)方 制劑的質(zhì)量控制大部分仍采用以黃芪甲苷為單一的質(zhì)量控制指標(biāo)，也尚未見(jiàn)一次性同時(shí)測(cè)定黃芪甲苷和牻牛兒酮含量的報(bào)道。這是由于在提取黃芪甲苷時(shí)，多采用水溶解后多步醇提堿洗，這是公認(rèn)的提取黃芪甲苷的方法，但是牻牛兒酮不溶于水，采用該傳統(tǒng)提取方法無(wú)法同時(shí)提取黃芪甲苷和牻牛兒酮，高效液相色譜難以測(cè)到黃莪膠囊中的牻牛兒酮。因此，同時(shí)提取黃芪甲苷和牻牛兒酮是采用高效液相色譜法檢測(cè)黃莪膠囊質(zhì)量的前提，也是目前研究的難點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)測(cè)定含有黃芪和莪術(shù)藥材的復(fù)方藥物制劑中的黃芪甲苷和牻牛兒酮含量的高效液相色譜測(cè)定方法。該方法可同時(shí)測(cè)定此類復(fù)方藥物制劑中黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量，具有良好的精密度、重現(xiàn)性和可靠性，可用于包括已上市的黃莪膠囊在內(nèi)的含有黃芪和莪術(shù)的復(fù)方藥物制劑的質(zhì)量控制。

本發(fā)明運(yùn)用循證醫(yī)學(xué)研究方法對(duì)黃莪膠囊治療前列腺增生癥的中醫(yī)理論進(jìn)行分 析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪益氣、推動(dòng)血行，可消散血瘀，莪術(shù)行氣活血，兩者是黃莪膠囊的主要藥效成分；有關(guān)臨床研究證實(shí)，缺乏黃芪和莪術(shù)的黃莪膠囊在治療前列腺增生癥上效果微弱，黃芪和莪術(shù)是黃莪膠囊組方中相當(dāng)重要的組分。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究分別將黃芪甲苷、牻牛兒酮作為黃芪和莪術(shù)的質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)，但是黃芪甲苷傳統(tǒng)的水提醇沉法無(wú)法同時(shí)提取牻牛兒酮，因此目前采用高效液相色譜法一次性同時(shí)檢測(cè)黃芪甲苷和牻牛兒酮含量仍有一定的困難。本發(fā)明針對(duì)黃芪甲苷和牻牛兒酮不同的化學(xué)性質(zhì)，首先對(duì)黃莪膠囊進(jìn)行前處理，然后直接進(jìn)樣檢測(cè)黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：

含有黃芪和莪術(shù)藥材的復(fù)方黃莪膠囊制劑的測(cè)定方法，

（1）供試品溶液的制備：取黃莪膠囊制劑，傾出內(nèi)容物，混勻，精密稱定10g置250ml容量瓶中，精密加甲醇100ml，搖勻稱定重量；超聲處理（功率150W，頻率50Hz）30min，放置24h，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻；靜置12h，轉(zhuǎn)速2000r/min離心5min，吸取上清液，過(guò)45μm濾紙，收集濾液；

濾液直接過(guò)中性硅膠氧化鋁柱，用甲醇洗脫，洗脫液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液；

對(duì)照品溶液的制備：取黃芪甲苷和牻牛兒酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含黃芪甲苷0.5mg、牻牛兒酮0.10mg的溶液，即得對(duì)照品溶液；

（2）高效液相色譜條件：采用Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱；以乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫：0-20min，30%A→40%A；20-30min,40%A→60%A；

30-50min，60%A→70%A，流速為1.0ml/min，柱溫25～40℃；AllerchELSD2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，檢測(cè)參數(shù)：漂移管溫度101℃，氮?dú)饬魉?.7L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為200～215nm；

（3）檢測(cè)方法，按照《中國(guó)藥典》2010年版1部附錄ⅥD高效液相色譜法測(cè)定黃莪膠囊中黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量：精密吸取供試品溶液10μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算，即得。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于：

（1）采用甲醇溶解黃莪膠囊粉末代替?zhèn)鹘y(tǒng)的水溶解，解決了無(wú)法采用黃芪甲苷傳統(tǒng)的提取方法同時(shí)提取黃芪甲苷和牻牛兒酮的問(wèn)題，使得采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定黃莪膠囊中黃芪甲苷和牻牛兒酮這兩種主要成分的含量成為可能。

（2）采用甲醇過(guò)濾后直接過(guò)中性硅膠氧化鋁柱代替多次醇提堿洗，不但有效去除了供試品溶液中的磷脂、色素等雜質(zhì)，而且減少了提取中黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量損失，提高了含量測(cè)定的準(zhǔn)確度。

（3）采用HPLC-ELSD法一次性同時(shí)測(cè)定了黃莪膠囊中黃芪甲苷和牻牛兒酮的含 量，并對(duì)其測(cè)定波長(zhǎng)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷和牻牛兒酮在208nm處吸收良好。

通過(guò)本發(fā)明黃莪膠囊質(zhì)量檢測(cè)方法，可以一次性同時(shí)有效地測(cè)定黃莪復(fù)方制劑中 黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量，提高了黃莪膠囊質(zhì)量測(cè)定的準(zhǔn)確性和產(chǎn)品的穩(wěn)定性，有利于提高工業(yè)化生產(chǎn)的質(zhì)量控制。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明如下。

實(shí)施例1

1、儀器：

Agilent 1100高效液色譜儀；Allerch ELSD-2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；中性氧化鋁柱4g/12ml；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器；METTLER AE240電子天平。

2、試藥：

采用黃莪膠囊（浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號(hào)：091207）；不含黃芪和莪術(shù)的黃莪膠囊（浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號(hào):100824）；黃芪甲苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110781-200613，含量測(cè)定用）；牻牛兒酮（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111665-200902，98.8%，含量測(cè)定用）；甲醇和乙腈（色譜純）；其他試劑都為分析純。

3、色譜條件：

Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱；以乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0-20min，30%A→40%A；20-30min，40%A→60%A；30-50min，60%A→70%A），流速為1.0ml/min，柱溫30℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)：漂移管溫度101℃，氮?dú)饬魉?.7L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為208nm。

4、試驗(yàn)方法：

4.1對(duì)照品溶液的制備

取黃芪甲苷和牻牛兒酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含黃芪甲苷0.5mg、牻牛兒酮0.10mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

4.2供試品溶液的制備

取黃莪膠囊制劑，傾出內(nèi)容物，混勻，精密稱定10g置250ml容量瓶中，精密加甲醇100ml，搖勻稱定重量；超聲處理（功率150W，頻率50Hz）30min，放置24h，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻；再靜置12h，轉(zhuǎn)速2000r/min離心5min，吸取上清液過(guò)45μm濾紙，收集濾液；濾液過(guò)中性硅膠氧化鋁柱，用甲醇洗脫；將洗脫液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

4.3不含黃芪和莪術(shù)的黃莪膠囊的陰性溶液的制備

取不含黃芪和莪術(shù)的黃莪膠囊，按4.2供試品溶液的制備方法制備陰性溶液。

4.4含量測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，分析（其中，A為黃芪甲苷，B為牻牛兒酮）。

5、結(jié)果表明：

陰性溶液對(duì)測(cè)定基本無(wú)干擾，供試品溶液中黃芪甲苷、牻牛兒酮與雜質(zhì)峰分離良好，不干擾測(cè)定。

綜上，本發(fā)明所建立的高效液相色譜法（HPLC-ELSD）同時(shí)測(cè)定含黃芪和莪術(shù)藥材的復(fù)方藥物制劑黃莪膠囊中黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量，（該方法）具有操作簡(jiǎn)便、精密度好、重復(fù)性高的特點(diǎn)，可更全面、更有效地控制含黃芪和莪術(shù)藥材的復(fù)方藥物制劑黃莪膠囊質(zhì)量。