引言
提供了來(lái)源于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B-raf(其也稱(chēng)作原癌基因B-Raf、p94、v-Raf鼠肉瘤病毒癌基因同系物B1和BRAF，并在本文中稱(chēng)作“BRAF”)的亞序列的特定肽。各種肽的肽序列和碎片/過(guò)渡離子可用于基于質(zhì)譜的選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)測(cè)定中，其也稱(chēng)為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)測(cè)定，且在本文中稱(chēng)作SRM/MRM。描述了用于BRAF蛋白質(zhì)的SRM/MRM定量分析的肽的用途。
可使用該SRM/MRM測(cè)定來(lái)測(cè)量來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的一種或多種特異性肽的相對(duì)或絕對(duì)定量水平，并由此提供通過(guò)質(zhì)譜測(cè)量在從生物樣品中獲得的給定蛋白質(zhì)制備物中BRAF蛋白質(zhì)的總量的方法。
更具體地，該SRM/MRM測(cè)定可直接測(cè)量由從諸如福爾馬林固定的癌癥患者組織的患者組織樣品取得的細(xì)胞制備的復(fù)雜蛋白質(zhì)裂解物樣品中的那些肽。由福爾馬林固定的組織制備蛋白質(zhì)樣品的方法描述在美國(guó)專(zhuān)利第7,473,532號(hào)中，其內(nèi)容通過(guò)引用全文納入本文。該專(zhuān)利描述的方法可使用獲自表達(dá)病理學(xué)公司(Expression Pathology Inc.)(馬里蘭州羅克維爾)的Liquid試劑和方案方便地進(jìn)行。
可最廣泛且有利地獲得的來(lái)自癌癥患者組織的組織形式是福爾馬林固定、石蠟包埋的組織。對(duì)手術(shù)移出的組織進(jìn)行甲醛/福爾馬林固定是迄今為止世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的保存癌癥組織樣品的方法且是標(biāo)準(zhǔn)病理學(xué)實(shí)踐中已經(jīng)接受的常規(guī)方法。甲醛水溶液被稱(chēng)作福爾馬林?！?00％”福爾馬林由甲醛在水中的飽和溶液(約40體積％或37重量％)組成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的穩(wěn)定劑，通常為甲醇。保藏組織的最常用方式是將整個(gè)組織在通常稱(chēng)為10％中性緩沖福爾馬林的甲醛水溶液中長(zhǎng)時(shí)間(8小時(shí)至48小時(shí))浸泡，接著在室溫下將固定的整個(gè)組織包埋在石蠟中以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存。因此，分析福爾馬林固定的癌癥組織的分子分析方法將是用于分析癌癥患者組織的最被接受且大量利用的方法。
SRM/MRM測(cè)定的結(jié)果可用于關(guān)聯(lián)自其中收集并保藏組織(生物樣品)的患者或受試者的具體組織樣品(例如癌癥組織樣品)內(nèi)BRAF蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確且精確的定量水平。這不僅提供關(guān)于癌癥的診斷和預(yù)后信息，而且容許醫(yī)師或其它醫(yī)療專(zhuān)業(yè)人員更精確地確定用于患者的適當(dāng)療法。提供關(guān)于患病組織或其他患者樣品中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的診斷、預(yù)后和治療重要信息的這一測(cè)定稱(chēng)為伴隨診斷測(cè)定。例如，這一測(cè)定可設(shè)計(jì)用于診斷癌癥的階段或程度并確定患者最可能應(yīng)答的治療劑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所述的測(cè)定測(cè)量來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的特定未修飾的肽的相對(duì)或絕對(duì)水平并且可測(cè)量來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的特定修飾的肽的絕對(duì)或相對(duì)水平。修飾的示例包括可能在這些肽上存在的磷酸化氨基酸殘基和糖基化氨基酸殘基。
BRAF蛋白質(zhì)的相對(duì)定量水平通過(guò)SRM/MRM方法來(lái)確定，通過(guò)例如比較不同樣品中單個(gè)BRAF肽的SRM/MRM特征峰面積(signature peak area)(例如，特征峰面積或積分的片段離子強(qiáng)度)來(lái)確定。或者，在各種肽具有其自己的特異性SRM/MRM特征峰的情況下，可以比較多種BRAF特征肽的多個(gè)SRM/MRM特征峰面積，從而確定一種生物樣品中的相對(duì)BRAF蛋白質(zhì)含量并將其與一種或多種額外或不同的生物樣品中的BRAF蛋白質(zhì)含量比較。以此方式，可在相同實(shí)驗(yàn)條件下跨越兩個(gè)或多個(gè)生物樣品，相對(duì)于相同的一種或多種BRAF肽來(lái)確定來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的一種或多種特定肽的含量并從而確定BRAF蛋白質(zhì)的含量。另外，確定單一樣品內(nèi)來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的一種或多種給定肽的相對(duì)定量的方法可以是通過(guò)SRM/MRM方法比較該肽的特征峰面積與同一來(lái)自生物樣品的蛋白質(zhì)制備物中的來(lái)自不同的一種或多種蛋白質(zhì)的其他和不同的一種或多種肽的特征峰面積。以此方式，通過(guò)同一樣品內(nèi)相對(duì)于一種肽的另一種肽來(lái)確定來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的特定肽的含量并從而確定BRAF蛋白質(zhì)的含量。這些方法能夠進(jìn)行樣品之間或樣品內(nèi)單個(gè)或多個(gè)來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的肽相對(duì)于另一個(gè)或多個(gè)肽的定量，其中通過(guò)特征峰測(cè)定的含量彼此相對(duì)，這與來(lái)自生物樣品的蛋白質(zhì)制備物中BRAF肽的絕對(duì)重量：體積或重量：重量含量無(wú)關(guān)。不同樣品之間單個(gè)特征峰面積的相對(duì)定量數(shù)據(jù)可標(biāo)準(zhǔn)化至每個(gè)樣品中所分析的蛋白質(zhì)含量。可跨越來(lái)自單個(gè)樣品中同時(shí)存在的BRAF蛋白質(zhì)和多個(gè)蛋白質(zhì)的許多肽和/或跨越許多樣品來(lái)進(jìn)行相對(duì)定量，從而了解相對(duì)于其他肽/蛋白質(zhì)的一種肽/蛋白質(zhì)的相對(duì)蛋白質(zhì)含量。
BRAF蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量水平通過(guò)例如SRM/MRM方法確定，通過(guò)該方法將來(lái)自在一種生物樣品中的BRAF蛋白質(zhì)的單個(gè)肽的SRM/MRM特征峰面積與摻入的(spiked)內(nèi)標(biāo)物的SRM/MRM特征峰面積相比較。在一個(gè)實(shí)施方式中，該內(nèi)標(biāo)物為合成形式的完全相同的BRAF肽，其含有用一種或多種重同位素標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。合成這類(lèi)同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物，使得通過(guò)質(zhì)譜分析時(shí)其產(chǎn)生可預(yù)測(cè)且一致的SRM/MRM特征峰，其與天然BRAF肽特征峰不同且截然不同并因此可用作比較峰。因此，當(dāng)內(nèi)標(biāo)物以已知含量摻入來(lái)自生物樣品的蛋白質(zhì)或肽制劑中并通過(guò)質(zhì)譜分析時(shí)，將天然肽的SRM/MRM特征峰面積與內(nèi)標(biāo)肽的SRM/MRM特征峰面積相比較，且該數(shù)值比較顯示來(lái)自生物樣品的原始蛋白質(zhì)制劑中存在的天然肽的絕對(duì)摩爾濃度和/或絕對(duì)重量。片段肽的絕對(duì)定量數(shù)據(jù)根據(jù)每種樣品中所分析的蛋白質(zhì)的含量來(lái)顯示。絕對(duì)定量可跨越單個(gè)樣品中同時(shí)存在的許多肽(且因此許多蛋白質(zhì))和/或跨越許多樣品進(jìn)行，從而了解單個(gè)生物樣品中和整個(gè)單個(gè)樣品的組中的絕對(duì)蛋白質(zhì)含量。
該SRM/MRM測(cè)定方法可用于輔助診斷例如直接位于患者來(lái)源的組織如福爾馬林固定的組織中的癌癥的階段和/或患者預(yù)后，并輔助確定哪種治療劑將最有利地用于治療該患者。對(duì)經(jīng)由手術(shù)(如部分或全部腫瘤的治療性移出)或經(jīng)由為了確定疑似疾病的存在與否而進(jìn)行的活檢方法從患者移出的癌癥組織進(jìn)行分析以確定該患者組織中是否存在特定的一種或多種蛋白質(zhì)以及存在何種形式的蛋白質(zhì)。此外，可確定一種蛋白質(zhì)或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平并將其與在健康組織中發(fā)現(xiàn)的“正常”或參考水平相比較。在健康組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的正?；騾⒖妓娇蓙?lái)源于例如沒(méi)有癌癥的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體的相關(guān)組織?；蛘撸赏ㄟ^(guò)分析未受癌癥影響的相關(guān)組織來(lái)獲得具有癌癥的個(gè)體的正?；騾⒖妓健?/p>
蛋白質(zhì)水平(例如BRAF水平)的測(cè)定還可用于通過(guò)BRAF水平診斷具有癌癥的患者或受試者中癌癥的階段和提供相關(guān)預(yù)后信息。單個(gè)BRAF肽的水平定義為單位的所分析蛋白質(zhì)裂解物總量中通過(guò)SRM/MRM測(cè)定確定的肽的摩爾含量?？赏ㄟ^(guò)關(guān)聯(lián)BRAF蛋白質(zhì)(或BRAF蛋白質(zhì)的片段肽)的水平與正常組織中觀察到的水平來(lái)使用BRAF相關(guān)的信息幫助確定癌癥的階段或等級(jí)和/或患者預(yù)后。一旦確定了癌癥的階段和/或等級(jí)和/或BRAF蛋白質(zhì)表達(dá)特性，則可將該信息與經(jīng)開(kāi)發(fā)以特異性治療癌癥組織的治療劑(化學(xué)和生物的)的列表相匹配，該癌癥組織的特征是例如所測(cè)定的一種或多種蛋白質(zhì)(例如BRAF)的異常表達(dá)。治療劑維羅非尼(Vemurafenib)和索拉非尼(Sorafenib)可具體用于靶向表達(dá)BRAF的癌細(xì)胞。其他BRAF抑制劑包括GDC-0879、PLX-4720、達(dá)拉菲尼(dabrafenib)和LGX818。匹配來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)測(cè)定的信息與特異性靶向例如BRAF蛋白質(zhì)或表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞/組織的治療劑列表定義了治療疾病的所謂個(gè)性化用藥方法。本發(fā)明所述的測(cè)定方法使用來(lái)自患者自身組織的蛋白質(zhì)的分析作為診斷和治療決定的來(lái)源，從而形成個(gè)性化用藥方法的基礎(chǔ)。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
圖1(A至C部分)顯示來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的單個(gè)肽的SRM/MRM測(cè)定的示例，其在來(lái)自福爾馬林固定的生物樣品的Liquid Tissue裂解物上進(jìn)行，且BRAF肽的定量在三重四極質(zhì)譜上進(jìn)行。顯示了如何測(cè)量已在福爾馬林中固定的生物樣品中該肽的具體特性。
發(fā)明詳述
原則上，例如通過(guò)使用特異性已知的蛋白酶(例如胰蛋白酶)消化來(lái)制備的來(lái)源于BRAF蛋白質(zhì)的任何預(yù)測(cè)的肽均可用作替代性報(bào)告子以使用基于質(zhì)譜的SRM/MRM測(cè)定確定樣品中BRAF蛋白質(zhì)的豐度。類(lèi)似地，也可潛在地使用已知在BRAF蛋白質(zhì)中潛在被修飾的位點(diǎn)處含有一個(gè)氨基酸殘基的任何預(yù)測(cè)的肽序列來(lái)測(cè)定樣品中BRAF蛋白質(zhì)的修飾程度。
BRAF片段肽可通過(guò)多種方法來(lái)產(chǎn)生，包括使用在美國(guó)專(zhuān)利7,473,532中提供的Liquid Tissue方案。Liquid Tissue方案和試劑能夠通過(guò)對(duì)組織/生物樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白水解消化來(lái)由福爾馬林固定的石蠟包埋組織生成適用于質(zhì)譜分析的肽樣品。在Liquid Tissue方案中，將組織/生物制備物在緩沖液中加熱延長(zhǎng)的一段時(shí)間(例如，約80℃至約100℃，持續(xù)約10分鐘至約4小時(shí)的時(shí)間)以逆轉(zhuǎn)或釋放蛋白質(zhì)交聯(lián)。所采用的緩沖液為中性緩沖液(例如，基于Tris的緩沖液或含有去垢劑的緩沖液)。熱處理后，將組織/生物樣品用包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞內(nèi)蛋白酶Lys-C的一種或多種蛋白酶處理足以破壞所述生物樣品的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)并使該樣品液化的時(shí)間(例如，在37℃至65℃的溫度下持續(xù)30分鐘至24小時(shí)的時(shí)間)。加熱和蛋白水解的結(jié)果為液態(tài)可溶性可稀釋的生物分子裂解物。
令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的許多潛在肽序列并不適合在基于質(zhì)譜的SRM/MRM測(cè)定中使用或者在基于質(zhì)譜的SRM/MRM測(cè)定中使用時(shí)是失效的，其原因目前不明。對(duì)于來(lái)源于福爾馬林固定的組織的肽而言尤其如此。由于不可能預(yù)測(cè)最適合MRM/SRM測(cè)定的肽，因此必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)在實(shí)際的Liquid Tissue裂解物中鑒定修飾的和未修飾的肽以開(kāi)發(fā)針對(duì)BRAF蛋白質(zhì)的可靠且準(zhǔn)確的SRM/MRM測(cè)定。不希望受任何理論約束，但認(rèn)為一些肽可能例如難以通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)良好地電離或生成與其它蛋白質(zhì)不同的片段。肽也可能無(wú)法在分離(例如，液相色譜)中良好地解析，或者附著到玻璃或塑料器具上。
在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式中發(fā)現(xiàn)的BRAF肽(例如，表1和/或表2)通過(guò)蛋白酶消化復(fù)雜的Liquid Tissue裂解物內(nèi)的所有蛋白質(zhì)而來(lái)源于BRAF蛋白質(zhì)，該裂解物由從福爾馬林固定的癌癥組織中取得的細(xì)胞制備。除非另外指出，否則在各種情況下，該蛋白酶都為胰蛋白酶。Liquid Tissue裂解物隨后通過(guò)質(zhì)譜分析以確定通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)并分析的來(lái)源于BRAF蛋白質(zhì)的那些肽。用于質(zhì)譜分析的具體優(yōu)選的肽亞組的鑒定基于：1)在Liquid Tissue裂解物的質(zhì)譜分析中電離的來(lái)自蛋白質(zhì)的一種或多種肽的實(shí)驗(yàn)確定，和2)肽在制備Liquid Tissue裂解物中使用的方案和實(shí)驗(yàn)條件下繼續(xù)存在的能力。后一性質(zhì)的范圍不僅是肽的氨基酸序列，而且是肽內(nèi)的修飾的氨基酸殘基在樣品制備期間以修飾的形式繼續(xù)存在的能力。
從福爾馬林(甲醛)固定的組織中直接取得的細(xì)胞的蛋白質(zhì)裂解物使用Liquid Tissue試劑和方案制備，Liquid Tissue試劑和方案要求經(jīng)由組織顯微解剖將細(xì)胞收集到樣品管中，接著在Liquid Tissue緩沖液中對(duì)細(xì)胞加熱延長(zhǎng)的一段時(shí)間。一旦負(fù)面地影響到福爾馬林誘導(dǎo)的交聯(lián)，則使用蛋白酶(例如胰蛋白酶，但也可使用其他蛋白酶)以可預(yù)測(cè)的形式消化組織/細(xì)胞至完全消化。通過(guò)用蛋白酶消化完整的多肽將各蛋白質(zhì)裂解物而轉(zhuǎn)化成肽的集合。分析(例如，通過(guò)離子阱質(zhì)譜)各Liquid Tissue裂解物以對(duì)肽進(jìn)行多重全局性蛋白組學(xué)研究，其中數(shù)據(jù)表示為來(lái)自各蛋白質(zhì)裂解物中存在的所有細(xì)胞蛋白質(zhì)的可通過(guò)質(zhì)譜鑒定的盡可能多的肽的鑒定結(jié)果。通常采用離子阱質(zhì)譜或能夠進(jìn)行全局性概要分析的另一形式的質(zhì)譜來(lái)鑒定來(lái)自單一復(fù)雜蛋白質(zhì)/肽裂解物的盡可能多的肽。但可優(yōu)選使用離子阱質(zhì)譜對(duì)肽進(jìn)行全局性概要分析(global profiling)的最佳的質(zhì)譜形式。盡管可在包括MALDI、離子阱或三重四極質(zhì)譜的任何類(lèi)型的質(zhì)譜上開(kāi)發(fā)并進(jìn)行SRM/MRM測(cè)定，但優(yōu)選使用三重四極儀器平臺(tái)進(jìn)行SRM/MRM測(cè)定。該類(lèi)型的質(zhì)譜是用于分析非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)裂解物中單個(gè)分離的靶標(biāo)肽的合適儀器，上述非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)裂解物由來(lái)自一個(gè)細(xì)胞內(nèi)含有的所有蛋白質(zhì)的數(shù)十萬(wàn)至數(shù)百萬(wàn)種單個(gè)肽組成。
一旦在所采用的條件下在單一裂解物的單一MS分析中鑒定出盡可能多的肽，則整理肽的列表并將其用于確定在該裂解物中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)。對(duì)于多種Liquid Tissue裂解物重復(fù)該過(guò)程，并將非常大的肽列表整理成單一數(shù)據(jù)集?？蓪⒃擃?lèi)型的數(shù)據(jù)集視為代表可在分析的生物樣品類(lèi)型中(蛋白酶消化之后)、特別是在生物樣品的Liquid Tissue裂解物中檢測(cè)到的肽，且因此包括諸如BRAF蛋白質(zhì)的具體蛋白質(zhì)的肽。
在一個(gè)實(shí)施方式中，鑒定為可用于確定BRAF蛋白質(zhì)的絕對(duì)或相對(duì)含量的BRAF胰蛋白酶肽包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，其全部列于表1。那些肽各自在由福爾馬林固定的石蠟包埋組織制備的Liquid Tissue裂解物中通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)。因此，各肽均為用于開(kāi)發(fā)人生物樣品中BRAF蛋白質(zhì)的定量SRM/MRM測(cè)定的候選物，該BRAF蛋白質(zhì)包括直接在福爾馬林中固定的患者組織中的BRAF蛋白質(zhì)。
表1
表1中列出的BRAF胰蛋白酶肽是從包括前列腺、結(jié)腸和乳腺的不同人類(lèi)器官的多種不同福爾馬林固定的組織的多種Liquid Tissue裂解物中檢測(cè)到的。那些肽各自被視為可用于福爾馬林固定的組織中的BRAF蛋白質(zhì)的定量SRM/MRM測(cè)定。這些實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析表明，并沒(méi)有優(yōu)先觀察到來(lái)自任何特定器官位點(diǎn)的任何特定肽。因此，這些肽可用于對(duì)來(lái)自來(lái)源于任何生物樣品或體內(nèi)的任何器官位點(diǎn)的任何福爾馬林固定的組織的Liquid Tissue裂解物進(jìn)行BRAF蛋白質(zhì)的SRM/MRM測(cè)定。
為了對(duì)來(lái)源于BRAF蛋白質(zhì)的各種肽最有效地實(shí)施SRM/MRM測(cè)定，需要在分析中利用除了肽序列之外的信息。該額外信息可用于引導(dǎo)并指導(dǎo)質(zhì)譜(例如，三重四極質(zhì)譜)對(duì)特異性靶標(biāo)肽進(jìn)行正確且集中的分析，從而可有效地進(jìn)行測(cè)定。
關(guān)于靶標(biāo)肽總體和關(guān)于特定BRAF肽的額外信息可包括該肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、m/z過(guò)渡離子和各過(guò)渡離子的離子類(lèi)型中的一種或更種。表2顯示對(duì)于表1中列舉的兩(2)種BRAF肽而言可用于開(kāi)發(fā)針對(duì)BRAF蛋白質(zhì)的SRM/MRM測(cè)定的額外肽信息。可制備、獲得針對(duì)表2中作為示例顯示的兩(2)種BRAF肽進(jìn)行描述的類(lèi)似額外信息并將其應(yīng)用到表1中包含的其它肽的分析中。
表2
下文所述的方法用于：1)鑒定可用于BRAF蛋白質(zhì)的基于質(zhì)譜的SRM/MRM測(cè)定的來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的候選肽，2)針對(duì)來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的靶標(biāo)肽開(kāi)發(fā)單個(gè)SRM/MRM測(cè)定或多種SRM/MRM測(cè)定以進(jìn)行匹配，和3)將定量測(cè)定應(yīng)用于癌癥診斷和/或最佳療法的選擇。
測(cè)定方法
1.BRAF蛋白質(zhì)的SRM/MRM候選片段肽的鑒定：
a.使用一種或多種蛋白酶(可能包括或可能不包括胰蛋白酶)消化蛋白質(zhì)，從而由福爾馬林固定的生物樣品制備Liquid Tissue蛋白質(zhì)裂解物
b.在離子阱串聯(lián)質(zhì)譜上分析Liquid Tissue裂解物中的所有蛋白質(zhì)片段并鑒定來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的所有片段肽，其中單個(gè)片段肽不含任何諸如磷酸化或糖基化的肽修飾
c.在離子阱串聯(lián)質(zhì)譜上分析Liquid Tissue裂解物中的所有蛋白質(zhì)片段并鑒定來(lái)自帶有諸如磷酸化或糖基化殘基的肽修飾的BRAF蛋白質(zhì)的所有片段肽
d.可測(cè)量由完整的全長(zhǎng)BRAF蛋白質(zhì)通過(guò)具體消化方法可能產(chǎn)生的所有肽，但用于開(kāi)發(fā)SRM/MRM測(cè)定的優(yōu)選肽為在由福爾馬林固定的生物樣品制備的復(fù)雜Liquid Tissue蛋白質(zhì)裂解物中通過(guò)質(zhì)譜直接鑒定的那些
e.在分析來(lái)自福爾馬林固定的生物樣品的Liquid Tissue裂解物時(shí)將在患者組織中特異性修飾(磷酸化、糖基化等)并在質(zhì)譜中電離化且因此被檢測(cè)的肽鑒定為用于測(cè)定BRAF蛋白質(zhì)的肽修飾的候選肽
2.來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的片段肽的質(zhì)譜測(cè)定
a.將針對(duì)Liquid Tissue裂解物中鑒定的單個(gè)片段肽的三重四極質(zhì)譜上的SRM/MRM測(cè)定應(yīng)用于來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的肽
i.針對(duì)包括但不限于以下實(shí)驗(yàn)的最佳色譜條件確定片段肽的最佳保留時(shí)間：凝膠電泳、液相色譜、毛細(xì)管電泳、納米反向液相色譜、高效液相色譜或反向高效液相色譜
ii.確定肽的單同位素質(zhì)量、各肽的前體電荷狀態(tài)、各肽的前體m/z值、各肽的m/z過(guò)渡離子和各片段肽的各過(guò)渡離子的離子類(lèi)型以開(kāi)發(fā)用于各肽的SRM/MRM測(cè)定。
iii.隨后可使用來(lái)自(i)和(ii)的信息在三重四極質(zhì)譜上進(jìn)行SRM/MRM測(cè)定，其中各肽均具有特征性且獨(dú)特的SRM/MRM特征峰，該特征峰精確地限定在三重四極質(zhì)譜上進(jìn)行的獨(dú)特的SRM/MRM測(cè)定
b.進(jìn)行SRM/MRM分析使得來(lái)自SRM/MRM質(zhì)譜分析的獨(dú)特SRM/MRM特征峰面積的函數(shù)形式的所檢測(cè)的BRAF蛋白質(zhì)的片段肽的含量可指示特定蛋白質(zhì)裂解物中BRAF蛋白質(zhì)的相對(duì)含量和絕對(duì)含量。
i.相對(duì)定量可通過(guò)以下實(shí)現(xiàn)：
1.通過(guò)比較以下數(shù)值來(lái)確定BRAF蛋白質(zhì)的增加或減少的存在量：來(lái)自一種福爾馬林固定的生物樣品的Liquid Tissue裂解物中檢測(cè)到的給定BRAF肽的SRM/MRM特征峰面積與來(lái)自至少第二、第三、第四或更多的福爾馬林固定的生物樣品的至少第二、第三、第四或更多的Liquid Tissue裂解物中相同BRAF片段肽的相同SRM/MRM特征峰面積
2.通過(guò)比較以下數(shù)值來(lái)確定BRAF蛋白質(zhì)的增加或減少的存在量：來(lái)自一種福爾馬林固定的生物樣品的Liquid Tissue裂解物中檢測(cè)到的給定BRAF肽的SRM/MRM特征峰面積與由來(lái)源于不同且單獨(dú)的生物來(lái)源的其它樣品中的其它蛋白質(zhì)的片段肽發(fā)展的SRM/MRM特征峰面積，其中針對(duì)肽片段的兩種樣品之間的SRM/MRM特征峰面積的比較標(biāo)準(zhǔn)化至各樣品中分析的蛋白質(zhì)的含量。
3.通過(guò)比較以下數(shù)值來(lái)確定BRAF蛋白質(zhì)的增加或減少的存在量：給定BRAF肽的SRM/MRM特征峰面積與來(lái)自福爾馬林固定的生物樣品的相同Liquid Tissue裂解物內(nèi)的不同蛋白質(zhì)來(lái)源的其它片段肽的SRM/MRM特征峰面積，從而將BRAF蛋白質(zhì)的變化水平標(biāo)準(zhǔn)化至多種細(xì)胞條件下都不改變其表達(dá)水平的其它蛋白質(zhì)的水平。
4.這些測(cè)定可應(yīng)用于BRAF蛋白質(zhì)的未修飾的片段肽和修飾的片段肽，其中修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中以與確定未修飾的肽的相對(duì)含量相同的方式確定修飾的肽的相對(duì)水平。
ii.給定肽的絕對(duì)定量可通過(guò)比較以下數(shù)值來(lái)實(shí)現(xiàn)：來(lái)自單個(gè)生物樣品中的BRAF蛋白質(zhì)的給定片段肽的SRM/MRM特征峰面積與摻入來(lái)自生物樣品的蛋白質(zhì)裂解物中的內(nèi)部片段肽標(biāo)準(zhǔn)物的SRM/MRM特征峰面積
1.內(nèi)標(biāo)物為測(cè)量中的BRAF蛋白質(zhì)的片段肽的經(jīng)標(biāo)記的合成形式。將該標(biāo)準(zhǔn)物以已知量摻入樣品中，并可單獨(dú)地確定生物樣品中的天然肽片段和內(nèi)部片段肽標(biāo)準(zhǔn)物的SRM/MRM特征峰面積，接著比較兩個(gè)峰面積
2.這可應(yīng)用于未修飾的片段肽和修飾的片段肽，其中這些修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中可以與確定未修飾的肽的絕對(duì)水平相同的方式來(lái)確定修飾的肽的絕對(duì)水平。
3.將片段肽定量應(yīng)用于癌癥診斷和治療
a.進(jìn)行BRAF蛋白質(zhì)的片段肽水平的相對(duì)和/或絕對(duì)定量并說(shuō)明證實(shí)了患者腫瘤組織中的BRAF蛋白質(zhì)表達(dá)與階段/等級(jí)/狀況的先前確定的關(guān)聯(lián)性，如同在癌癥領(lǐng)域中充分理解的那樣
b.進(jìn)行BRAF蛋白質(zhì)的片段肽水平的相對(duì)和/或絕對(duì)定量并說(shuō)明與來(lái)自不同治療策略的臨床結(jié)果的關(guān)聯(lián)性，其中該關(guān)聯(lián)性已經(jīng)在該領(lǐng)域中說(shuō)明或可在將來(lái)說(shuō)明(通過(guò)針對(duì)患者群或來(lái)自那些患者的組織的關(guān)聯(lián)性研究)。一旦通過(guò)該測(cè)定證實(shí)了先前確立的關(guān)聯(lián)性或?qū)?lái)得出的關(guān)聯(lián)性，則該測(cè)定方法可用于確定最佳治療策略
圖1顯示在來(lái)自福爾馬林固定的生物樣品的Liquid Tissue裂解物上進(jìn)行的單一SRM/MRM測(cè)定的示例。開(kāi)發(fā)針對(duì)單一肽的SRM/MRM測(cè)定以進(jìn)行三重四極質(zhì)譜上BRAF蛋白質(zhì)的定量。通過(guò)在離子阱和三重四極質(zhì)譜上分析所有BRAF肽來(lái)開(kāi)發(fā)該BRAF肽(序列LLFQGFR)相關(guān)的特定且獨(dú)特的特性并示于圖1A。信息包括該肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、該前體的過(guò)渡m/z值和各鑒定的過(guò)渡離子的離子類(lèi)型。該信息必須針對(duì)在來(lái)自福爾馬林固定的樣品/組織的Liquid Tissue裂解物中直接存在的每個(gè)和每一個(gè)候選SRM/MRM肽通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定；原因在于，有趣的是，并非所有來(lái)自BRAF蛋白質(zhì)的肽都可使用本發(fā)明所述的SRM/MRM在這里裂解物中檢測(cè)，表明未被檢測(cè)到的BRAF肽無(wú)法被視為開(kāi)發(fā)用于定量來(lái)自福爾馬林固定的樣品/組織的Liquid Tissue裂解物中直接存在的肽/蛋白質(zhì)的SRM/MRM測(cè)定的候選肽。
如圖1B所示，在三重四極質(zhì)譜上進(jìn)行這一具體的SRM/MRM測(cè)定。該實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)樣品是從經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋以作為組織替代品的細(xì)胞系中制備的Liquid Tissue蛋白質(zhì)裂解物。來(lái)自該測(cè)定的數(shù)據(jù)顯示存在針對(duì)福爾馬林固定的樣品中該BRAF肽的獨(dú)特SRM/MRM特征峰。
圖1C顯示針對(duì)該肽的特定的過(guò)渡離子特性，其用于定量測(cè)量福爾馬林固定的生物樣品中的上述肽。這些數(shù)據(jù)顯示該BRAF肽的絕對(duì)含量，其是每毫克分析的蛋白質(zhì)裂解物中該肽摩爾含量的函數(shù)形式?；诟栺R林固定的患者來(lái)源的組織的分析對(duì)組織中BRAF蛋白質(zhì)水平的評(píng)價(jià)可提供關(guān)于各特定患者的診斷、預(yù)后和治療有關(guān)的信息。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明描述了一種測(cè)量生物樣品中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)蛋白質(zhì)水平的方法，其包括使用質(zhì)譜檢測(cè)和/或定量由所述生物樣品制備的蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾和/或未修飾的BRAF片段肽的含量；和計(jì)算所述樣品中修飾的或未修飾的BRAF蛋白質(zhì)的水平；且其中該水平為相對(duì)水平或絕對(duì)水平。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，定量一種或多種BRAF片段肽包括通過(guò)與添加的已知含量的內(nèi)標(biāo)肽比較來(lái)確定生物樣品中各BRAF片段肽的含量，其中該生物樣品中的各BRAF片段肽均與添加的具有相同氨基酸序列的內(nèi)標(biāo)肽相比較。在一些實(shí)施方式中，該內(nèi)標(biāo)物為同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽，其包含選自18O、17O、34S、15N、13C、2H或其組合的一種或多種重穩(wěn)定同位素。
本發(fā)明所述的測(cè)量生物樣品中BRAF蛋白質(zhì)(或作為其替代的片段肽)的水平的方法可用作患者或受試者中癌癥的診斷和/或預(yù)后指標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過(guò)關(guān)聯(lián)(例如比較)組織中發(fā)現(xiàn)的BRAF蛋白質(zhì)的水平與正常和/或癌性或癌前期組織中發(fā)現(xiàn)的BRAF蛋白質(zhì)的水平來(lái)將該蛋白質(zhì)水平的測(cè)量結(jié)果用于確定癌癥的診斷階段/等級(jí)/狀況和/或預(yù)后狀態(tài)。
因?yàn)楹怂岷偷鞍踪|(zhì)兩者都可由相同的Liquid TissueTM生物分子制備物分析，所以可以由用于蛋白質(zhì)分析的相同樣品中的核酸生成關(guān)于疾病診斷和藥物治療判斷的額外信息。例如，如果BRAF蛋白質(zhì)由某些細(xì)胞以增加的水平表達(dá)，當(dāng)通過(guò)SRM測(cè)定時(shí)，數(shù)據(jù)可提供關(guān)于細(xì)胞的狀態(tài)及其不受控制地生長(zhǎng)的潛在性、潛在的抗藥性和癌癥發(fā)展的信息。同時(shí)，可從相同的Liquid TissueTM生物分子制備物中存在的核酸中獲得關(guān)于BRAF基因和/或核酸及其編碼的蛋白質(zhì)的狀況的信息(例如，mRNA分子及其表達(dá)水平或剪接變化)，可在BRAF蛋白質(zhì)的SRM分析的同時(shí)對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。可在BRAF蛋白質(zhì)的SRM分析的同時(shí)對(duì)不來(lái)自BRAF且存在于相同生物分子制備物中的任何基因和/或核酸進(jìn)行評(píng)價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方式中，關(guān)于BRAF蛋白質(zhì)和/或一種、兩種、三種、四種或更多種額外的蛋白質(zhì)的信息可通過(guò)檢查編碼那些蛋白質(zhì)的核酸來(lái)評(píng)價(jià)。那些核酸可例如通過(guò)以下方法中的一種或多種、兩種或更多種或三種或更多種檢查：測(cè)序方法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法、限制性片段多態(tài)性分析、插入、缺失的鑒定，和/或是否存在突變的確定，包括但不限于單堿基對(duì)多態(tài)性、轉(zhuǎn)換、顛換或其組合。
序列表
<110> 愛(ài)科譜迅病理研究公司 (Expression Pathology Inc)
<120> 針對(duì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B-raf (BRAF) 的SRM/MRM測(cè)定
<130> 001152-8038.WO00
<150> 62/023,615
<151> 2014-07-11
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 1
Leu Thr Gln Glu His Ile Glu Ala Leu Leu Asp Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Thr Val Val Pro Ala Arg
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Ile Gln Asp Gly Glu Lys
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Leu Leu Phe Gln Gly Phe Arg
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Asn Gln Phe Gly Gln Arg
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Asn Glu Val Gly Val Leu Arg
1 5
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Asp Leu Thr Val Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Ser Ala Ser Glu Pro Ser Leu Asn Arg
1 5
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Phe Gly Gly Glu His Asn Pro Pro Ser Ile Tyr Leu Glu Ala Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Thr Ser Lys
20
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Arg
1 5
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Thr Pro Ile Gln Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Phe Pro Val His
1 5 10