本申請要求2014年05月15日提交的美國臨時申請?zhí)?1/993,581；2014年06月18日提交的62/013,823；2014年09月10日提交的62/048,489；2014年09月12日提交的62/049,520；和2014年09月25日提交的62/055,093的權益，其全部內容通過引用并入本文。還對USSN14/206,284(公開號US-2014/0272939)；USSN14/208,040(公開號US-2014/0274775)；和USSN14/203,638(公開號US-2014/0256588)進行了引用，其公開也通過引用并入本文。發(fā)明領域本發(fā)明涉及用于進行免疫測定的改進的方法。所述方法經設計以在免疫測定中放大信號并錨定其中采用的免疫測定復合物。發(fā)明背景已經開發(fā)了大量關于采用結合反應(例如抗原抗體反應，核酸雜交和受體配體反應)的技術的文獻，用于對樣品中感興趣的分析物的靈敏測量。許多生物化學結合系統(tǒng)的高度特異性導致了在各種市場中許多有價值的分析方法和系統(tǒng)，包括基礎研究，人用和獸用診斷，環(huán)境監(jiān)控以及工業(yè)測試?？梢酝ㄟ^在結合反應中直接測量分析物的參與來測量感興趣的分析物的存在。在一些方法中，可以通過測量附接到一種或多種結合材料的可觀察標記物來指示該參與。雖然夾心法免疫測定形式在許多應用中提供了極好的靈敏度和特異性，一些分析物以過低的濃度存在而無法通過傳統(tǒng)的免疫測定技術檢測。夾心法免疫分析的性能也可能因為檢測抗體的非特異性結合以及包含高解離率抗體的夾心法混合物的不穩(wěn)定性而被限制。然而，修改傳統(tǒng)方法來改進靈敏度和特異性的努力通常導致更加復雜，勞動密集的方案，其可能由每一步的低效率而被阻礙，可能極大的影響分析的靈敏度和特異性。例如，在要求多個結合事件和/或反應的復雜分析中，如果任意一個事件或反應不太理想，整體分析的靈敏度和特異性可能受到影響。對于通過改進靈敏度，減少非特異性結合和改進夾心法復合物的穩(wěn)定性改進夾心法免疫分析表現(xiàn)的新技術有需要。發(fā)明概述本發(fā)明考慮以下的具體實施方案。本領域的技術人員可以對本文所述的實施方案進行多種修改，增加和改變而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這些修改，增加和改變意在落入權利要求的范圍內。實施方案(1)：檢測樣品中感興趣分析物的方法，包含：使分析物結合到：(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于所述分析物的捕獲試劑，和錨定試劑；和(ii)與核酸探針連接的用于所述分析物的檢測試劑；從而在所述表面上形成包含所述捕獲試劑、分析物和檢測試劑的復合物；延伸所述探針以形成包含結合到錨定試劑的錨定區(qū)的延伸序列；使所述延伸序列結合到錨定試劑上；以及測量結合到所述表面上的延伸序列的量。在實施方案(1)中，所述捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體(aptamer)。在一個具體的實施方案中，捕獲試劑是抗體。檢測試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在一個具體的實施方案中，所述檢測試劑是抗體。在實施方案(1)的一個具體的實例中，捕獲和檢測試劑是針對分析物的抗體。錨定試劑可以包括寡核苷酸序列、適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位；以及任選地，所述錨定區(qū)可以包括適體，且所述錨定試劑可包括適體配體。所述錨定區(qū)可包含核酸序列，且錨定試劑可包括DNA-結合蛋白。所述錨定試劑可以包含寡核苷酸序列，且錨定序列可以包括互補寡核苷酸序列。所述錨定區(qū)可以包括單鏈寡核苷酸序列或雙鏈寡核苷酸序列。實施方案(1)的結合步驟可進一步包括在錨定區(qū)和錨定試劑間形成三螺旋。所述方法可進一步包含在結合步驟之前變性錨定區(qū)以暴露單鏈序列；在結合步驟前將錨定區(qū)暴露于解旋酶活性；和/或在結合步驟之前將所述錨定區(qū)暴露于核酸酶處理。在這一實施方案中，所述錨定區(qū)可包含一個或多個半抗原修飾的堿基，且錨定試劑可包括一個或多個對所述半抗原特異的抗體；和/或錨定區(qū)可以包括一個或多個配體修飾的堿基，且錨定試劑可以包括一個或多個對所述配體特異的受體。所述延伸序列可進一步包含一個或多個檢序列，且測量步驟還包括將所述延伸序列與互補于所述一種或多種檢測序列的多種標記的探針接觸；延伸序列可包括一個或多個修飾的堿基，且測量步驟可包括將延伸序列于多個能夠結合一個或多個修飾的堿基的檢測部分(moieties)接觸；和/或所述延伸序列可包含一個或多個標記的堿基，且所述測量步驟可進一步包括檢測一個或多個標記的堿基的存在。在該實施方案中，一個或多個修飾的堿基包含適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位，并且多個可檢測部分各自包含一個或多個修飾的堿基的結合伴侶和可檢測標記。所述一個或多個修飾的堿基可以包含鏈霉親和素，并且多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記；和/或所述一個或多個修飾的堿基可以包含生物素，并且所述多個可檢測部分各自包含鏈霉親和素和可檢測標記；和/或一個或多個修飾的堿基可以包含親和素，并且多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記；和/或所述一個或多個修飾的堿基可以包含生物素，并且所述多個可檢測部分各自包含親和素和可檢測標記。實施方案(1)的第一步可以包含使分析物以以下順序結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于所述分析物的檢測試劑；或實施方案(1)的第一步可以包含使分析物以以下順序結合到以下種類：(i)用于所述分析物的檢測試劑；和(ii)在所述表面上的捕獲試劑；和/或第一個步驟可以包含使分析物同時或基本同時結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于所述分析物的檢測試劑。實施方案(1)的延伸步驟可包含將探針結合到模板核酸序列并通過聚合酶鏈式反應延伸所述探針；和/或將所述探針結合到模板核酸序列，形成環(huán)形核酸模板，并通過滾環(huán)擴增延伸所述環(huán)形模板。在這一實施方案中，延伸的探針可以在探針延伸之后仍位于表面上。因此，復合物可以在延伸步驟之后仍結合到表面上，例如，延伸的探針在所述表面上的復合物位置的10-100μm以內的位置處結合到所述錨定試劑。在一個具體實施方案中，述延伸的探針在所述表面上的復合物位置的小于100μm、小于50μm，或更特別地小于10μm的位置處結合到所述錨定試劑。實施方案(1)的延伸步驟可以包含PCR(聚合酶鏈式反應)、LCR(連接酶鏈式反應)、SDA(鏈置換擴增)、3SR(自動維持合成反應)，或等溫擴增方法。在一個實施方案中，延伸步驟可包括等溫擴增方法，例如解旋酶依賴性擴增或滾環(huán)擴增(RCA)。在實施方案(1)中所指的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑定位在表面上的兩個不同的結合域上。如果所述表面是板的孔，則所述孔可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的兩個不同的結合域上；和/或所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的相同的結合域上。在一個實施方案中，孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的相同結合域上。捕獲試劑和錨定試劑可以在表面上的10-100nm內。所述表面可以包括電極而測量步驟可以進一步包括向所述電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號，以及任選地，所述方法包括收集電極上的顆粒并向所述電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號。實施方案(1)的測量步驟可以進一步包含使延伸的序列結合到具有可檢測標記物的檢測探針，測量所述可檢測標記物，并將所述測量與樣品中分析物的量關聯(lián)，其中所述檢測探針包含與延伸序列的區(qū)域互補的核酸序列?？梢酝ㄟ^測量光散射，光吸收，熒光，化學發(fā)光，電化學發(fā)光，生物發(fā)光，磷光，放射性，磁場，或其組合測量所述可檢測標記物。在實施方案(1)的具體實施例中，所述可檢測標記物是ECL標記物而測量步驟可以包括測量ECL信號。實施方案(2)：用于檢測樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個或多個小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)錨定試劑；和(b)用于分析物的與核酸探針連接的檢測試劑。實施方案(2)的錨定試劑可以包含寡核苷酸序列、適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位，并且捕獲試劑可包含抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體。在一個具體實施方案中，所述捕獲試劑可包括抗體，和/或所述檢測試劑可包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體。在試劑盒的一個具體的實施方案中，所述檢測試劑是抗體。實施方案(2)的試劑盒的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。表面可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個不同的結合域上。如果試劑盒表面是板的孔，則表面可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的兩個不同的結合域上；和/或所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的相同的結合域上。在試劑盒的具體的實施例中，所述表面是孔，并且所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的相同結合域上。捕獲試劑和錨定試劑可以在所述表面上的10-100nm內。此外，所述試劑盒的表面可以包含電極。實施方案(3)：檢測樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)使分析物結合到：(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于分析物的捕獲試劑，以及包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；和(ii)與核酸探針連接的用于分析物的檢測試劑；從而在所述表面上形成包含所述捕獲試劑、分析物和檢測試劑的復合物；(b)延伸探針以形成包含與錨定序列互補的錨定序列互補體(complement)的延伸序列；(c)將錨定序列與錨定序列互補體雜交；和(d)測量結合到表面的延伸序列的量。在實施方案(3)中，所述捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在具體實施例中，所述捕獲試劑是抗體。同樣，所述檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在實施方案(3)的具體實施例中，所述檢測試劑是抗體。在實施方案(3)的一個實例中，所述捕獲試劑和檢測試劑是針對分析物的抗體。所述錨定寡核苷酸序列可以包含單鏈寡核苷酸序列或雙鏈寡核苷酸序列。所述延伸序列可以進一步包括一個或多個檢測序列，且所述測量步驟還包括將所述延伸序列與互補于所述一個或多個檢測序列的多種經標記探針接觸；或者或另外，所述延伸序列還可以包括一個或多個修飾的堿基，并且所述測量步驟還可以包括使延伸序列與能夠結合一個或多個修飾的堿基的多個可檢測部分接觸。在一個具體的實施例中，延伸序列還可以包括一個或多個標記的堿基，并且測量步驟還可以包括檢測一個或多個標記的堿基的存在。所述一個或多個修飾的堿基包括適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位，并且多個可檢測部分各自包含一個或多個修飾的堿基的結合伴侶和可檢測標記。所述一個或多個修飾的堿基可以包含鏈霉親和素，并且多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記；所述一個或多個經修飾的堿基包含生物素，且所述多個可檢測部分各自包含鏈霉親和素和可檢測標記；所述一個或多個修飾的堿基包含親和素，并且所述多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記；和/或所述一個或多個修飾的堿基包含生物素，并且所述多個可檢測部分各自包含親和素和可檢測標記。實施方案(3)的步驟(a)可以包括以下列順序將分析物結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的檢測試劑。或者，步驟(a)可包括以下列順序將分析物結合到以下種類：(i)用于分析物的檢測試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑。在另一個實施例中，步驟(a)可以包含同時或基本上同時將分析物結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的檢測試劑。實施方案(3)的延伸步驟可以包括將探針結合到模板核酸序列并通過聚合酶鏈式反應延伸探針?；蛘?，延伸步驟可以包括將探針結合到模板核酸序列，形成環(huán)形核酸模板，并通過滾環(huán)擴增延伸環(huán)形模板。延伸的探針可以在探針延伸之后仍定位于表面上。例如，在延伸步驟后，復合物仍結合到表面上。在一個實施例中，延伸的探針在所述表面上的復合物位置的10-100um內的位置處結合到所述錨定試劑。在一個具體實施方案中，述延伸的探針在所述表面上的復合物位置的小于100um、小于50um，或更特別地小于10um的位置處結合到所述錨定試劑。在這一特定實施方案中，所述延伸步驟可包括PCR(聚合酶鏈式反應)、LCR(連接酶鏈式反應)、SDA(單鏈置換擴增)、3SR(自動維持合成反應)，或等溫擴增方法。例如，所述延伸步驟可包括等溫擴增方法，如解旋酶依賴性擴增或滾環(huán)擴增(RCA)。實施方案(3)的表面可以包含顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個不同的結合域上。如果所述表面是板的孔，則其可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的兩個不同的結合域上。所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的相同的結合域上。如果所述表面是孔，則其可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的相同的結合域上。捕獲試劑和錨定試劑可以在表面上的10-100nm內。在具體的實施例中，表面可以包括電極，并且測量步驟還可以包括向電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號。所述方法還可以包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號。測量步驟還可包括將延伸序列結合到具有可檢測標記的檢測探針，測量可檢測標記，并將測量與樣品中分析物的量相關聯(lián)，其中檢測探針包含與延伸序列的區(qū)域互補的核酸序列。在該實施方案中，通過光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場或其組合的測量來測量可檢測標記。例如，可檢測標記是ECL標記，且測量步驟可以包括測量ECL信號。實施方案(4)：用于檢測樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個或多個小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；和(b)連接到核酸探針的用于分析物的檢測試劑。實施方案(4)的試劑盒包括包含抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體的捕獲試劑。在具體的實施例中，所述捕獲試劑可以包括抗體。同樣，檢測試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，并且具體地，所述檢測試劑可以包括抗體。實施方案(4)的試劑盒包括表面，其可以包含顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個不同的結合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的兩個不同的結合域上。所述表面可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結合域上，例如，如果表面是孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的相同結合域上。例如，所述捕獲試劑和錨定試劑可以在所述表面上的10-100nm內。實施方案(4)的表面可以包括電極。實施方案(5)：檢測樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)將分析物結合到：(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于分析物的捕獲試劑，和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(ii)連接到第一核酸探針的用于分析物的第一檢測試劑；和(iii)連接到第二核酸探針的用于分析物的第二檢測試劑；從而在表面上形成復合物，所述表面包含結合試劑、分析物以及第一和第二檢測試劑；(b)使用需要第一和第二近端探針接近的延伸過程，延伸第二探針以形成包含與錨定序列互補的錨定序列互補體的延伸序列；(c)將錨定序列與錨定序列互補體雜交；和(d)測量結合到表面的延伸序列的量。實施方案(5)的捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體。在一個具體的實施例中，捕獲試劑是抗體。同樣，第一檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在一個具體的實施例中，第一檢測試劑是抗體。第二檢測試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在一個具體實施例中，第二檢測試劑是抗體。更具體地，捕獲試劑以及第一和第二檢測試劑是對分析物的抗體。在實施方案(5)中，錨定寡核苷酸序列可以包括單鏈寡核苷酸序列或雙鏈寡核苷酸序列。在這一實施方案中，延伸序列進一步可以包括一個或多個檢測序列，并且測量步驟還可以包括使延伸序列與多個與一個或多個檢測序列互補的標記探針接觸。延伸序列還可以包括一個或多個修飾堿基，且所述測量步驟還包括將所述延伸序列與多個能夠與所述一個或多個修飾的堿基結合的可檢測部分。延伸序列可以進一步包含一個或多個標記的堿基，并且測量步驟還可以包括檢測一個或多個標記的堿基的存在。一個或多個修飾的堿基可以包括適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位，或模擬表位，并且所述多個可檢測的部分每一個包含所述一個或多個修飾的堿基的結合伴侶以及可檢測標記物。例如，一個或多個修飾的堿基包含鏈霉親和素，并且多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記；所述一個或多個修飾的堿基包含生物素，且所述多個可檢測部分各自包含鏈霉親和素和可檢測標記；所述一個或多個修飾的堿基包含親和素，并且所述多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記；和/或所述一個或多個修飾的堿基包含生物素，并且所述多個可檢測部分各自包含親和素和可檢測標記。實施方案(5)的步驟(a)可以包括以下列順序將分析物結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的檢測試劑?；蛘撸襟E(a)可包括以下列順序將分析物結合到以下種類：(i)用于分析物的檢測試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑；或步驟(a)可以包括同時或基本上同時將分析物結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的檢測試劑。實施方案(5)的延伸步驟可以包括將探針結合到模板核酸序列并通過聚合酶鏈式反應延伸探針。延伸步驟還可以包括將探針結合到模板核酸序列，形成環(huán)形核酸模板，并通過滾環(huán)擴增延伸環(huán)形模板。所述延伸的探針可以在探針延伸之后仍定位于表面上，例如，在延伸步驟后復合物仍結合到表面上。所述延伸的探針在所述表面上的復合物位置的10-100um內的位置處結合到所述錨定試劑。在一個具體實施方案中，所述延伸的探針在所述表面上的復合物位置的小于100um、小于50um，或更特別地小于10um的位置處結合到所述錨定試劑。延伸步驟可包括PCR(聚合酶鏈式反應)、LCR(連接酶鏈式反應)、SDA(單鏈置換擴增)、3SR(自動維持合成反應)，或等溫擴增方法。在一個具體的實施例中，所述延伸步驟可包括等溫擴增方法，例如為解旋酶依賴性擴增或滾環(huán)擴增(RCA)。實施方案(5)的延伸過程可包括使步驟(a)中形成的復合物與連接子(connector)序列接觸，所述連接子序列包含(i)與第二探針互補的內部序列和(ii)與第一探針的非重疊區(qū)互補的雙末端序列。所述方法還可以包括連接所述連接子寡核苷酸的雙末端序列以形成與第一和第二探針兩者雜交的環(huán)形靶序列?；蛘撸由爝^程可包括將實施方案(5)的步驟(a)中形成的復合物與第一連接子寡核苷酸序列和第二連接子寡核苷酸序列接觸，所述第一連接寡核苷酸序列包含互補于所述第一探針的第一區(qū)域和所述第二探針上的第一區(qū)域的第一連接探針序列，所述第二連接寡核苷酸包含互補于所述第一探針的第二非重疊性區(qū)域和所述第二探針的第二非重疊性區(qū)域的第二探針序列；并且任選地，連接第一和第二連接子寡核苷酸以形成與第一和第二探針兩者雜交的環(huán)形靶序列。實施方案(5)的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個不同的結合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的兩個不同的結合域上。所述表面還可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的相同結合域上。捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內。在一個具體的實施例中，所述表面可以包括電極，且所述測量步驟還可包括向電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號，并且任選地，實施方式(5)的方法還包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號。實施方案(5)的測量步驟還可包括將延伸序列與具有可檢測標記的檢測探針結合，測量可檢測標記，并將測量與樣品中分析物的量相關聯(lián)，其中檢測探針包含與延伸序列的區(qū)域互補的核酸序列?？赏ㄟ^光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場或其組合的測量來測量可檢測標記。在一個具體的實施例中，所述可檢測標記是ECL標記，且測量步驟可以包括測量ECL信號。實施方案(6)：用于檢測樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個或多個小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(b)連接到第一核酸探針的用于分析物的第一檢測試劑；和(c)連接到第二核酸探針的用于分析物的第二檢測試劑。實施方案(6)的捕獲試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在具體的實施例中，捕獲試劑可以包括抗體。同樣，第一檢測試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，在具體的實施例中，第一檢測試劑可以包括抗體。類似地，第二檢測試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在具體的實施例中，第二檢測試劑可以包括抗體。實施方案(6)的表面可以包含顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個不同的結合域上。如果所述表面是孔，則該孔可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的兩個不同的結合域上。所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的相同的結合域上；和/或如果所述表面是孔，則該孔可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的相同的結合域上。捕獲試劑和錨定試劑可以在表面上的10-100nm內。在具體的實施例中，表面可以包括電極。實施方案(7)：檢測樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)將分析物結合到：(i)表面上的用于分析物的捕獲試劑，所述表面包含捕獲試劑和錨定試劑；(ii)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測試劑，和(iii)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測試劑；從而在表面上形成檢測復合物，所述檢測復合物包含捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測試劑；(b)將在(c)中形成的檢測復合物與連接子序列接觸，所述連接子序列包含(i)與第二近端探針互補的內部序列和(ii)與第一近端探針的非重疊區(qū)域互補的雙末端序列；(c)將連接子序列與第一和第二近端探針雜交；(d)連接連接子寡核苷酸的雙末端序列以形成與第一和第二近端探針的兩者雜交的環(huán)形靶序列；(e)通過靶序列的滾環(huán)擴增來延伸第二近端探針以產生包含結合錨定試劑的結合域的擴增子；(f)將擴增子結合到錨定試劑；和(g)測量表面上的擴增子的量。實施方案(8)：檢測樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)將分析物結合到：(i)表面上的用于分析物的捕獲試劑，所述表面包含捕獲試劑和錨定試劑；(ii)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測試劑，和(iii)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測試劑；從而在表面上形成檢測復合物，所述檢測復合物包含捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測試劑；(b)將在(c)中形成的檢測復合物與第一連接子寡核苷酸和第二連接子寡核苷酸接觸，其中(i)第一連接子的第一末端和第二連接子的第一末端與第一近端探針的兩個非重疊區(qū)域互補，且(ii)第一連接子的第二末端和第二連接子的第二末端與第一近端探針的兩個非重疊區(qū)域互補；(c)將第一和第二連接子寡核苷酸與第一和第二近端探針雜交；(d)連接第一和第二連接子寡核苷酸以形成與第一和第二近端探針兩者雜交的環(huán)形靶序列；(e)通過靶序列的滾環(huán)擴增來延伸第二近端探針以產生包含結合錨定試劑的結合域的擴增子；(f)將擴增子結合到錨定試劑；和(g)測量表面上的擴增子的量。實施方案(7)和(8)的捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在一個具體實施例中，捕獲試劑是抗體。相似地，第一檢測試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，第一檢測試劑是抗體。另外，第二檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，第二檢測試劑是抗體。在實施方案(7)和(8)的一個具體的實施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測試劑是對分析物的抗體。實施方案(7)和(8)的錨定試劑可以包括寡核苷酸序列、適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位。在一個實施例中，結合域可以包括適體，且錨定試劑可以包括適體配體。結合域可以包括核酸序列，且錨定試劑可以包括DNA結合蛋白；和/或錨定試劑可以包括寡核苷酸序列，且擴增子可以包括互補寡核苷酸序列。實施方案(7)和(8)的擴增子可進一步包含一個或多個檢測序列，且所述測量步驟可以進一步包括將所述延伸序列與互補于所述一個或多個檢測序列的多種經標記探針接觸。此外，擴增子可以進一步包含一個或多個修飾的堿基，并且測量步驟還可以包括使延伸序列與能夠結合一個或多個修飾的堿基的多個可檢測部分接觸。另外，擴增子可以進一步包括一個或多個標記的堿基，并且測量步驟還可以包括檢測一個或多個標記的堿基的存在。所述一個或多個修飾的堿基可以包含適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位且多個可檢測部分各自包含一個或多個修飾的堿基的結合伴侶和可檢測的標記。所述一個或多個修飾的堿基可以包含鏈霉親和素，并且多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測的標記；所述一個或多個修飾的堿基可以包含生物素，并且所述多個可檢測部分各自包含鏈霉親和素和可檢測標記；所述一個或多個修飾的堿基可以包含親和素，并且所述多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記；和/或所述一個或多個修飾的堿基可以包含生物素，并且所述多個可檢測部分各自包含親和素和可檢測標記。實施方案(7)和(8)的步驟(a)可包括以下列順序將分析物結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的第一和第二檢測試劑?；蛘撸襟E(a)可包括以下列順序將分析物結合到以下種類：(i)用于分析物的第一和第二檢測試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑。另外，步驟(a)可以包括同時或基本上同時將分析物結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的第一和第二檢測試劑。實施方案(7)和(8)的擴增子可以在探針延伸之后仍定位于表面上。復合物可以在延伸步驟后仍結合在表面上。例如，所述延伸的探針在所述表面上的復合物位置的10-100um內的位置處結合到所述錨定試劑。在一個具體實施方案中，所述延伸的探針在距離位于表面上復合物位置小于100um、小于50um，或更特別地小于10um的位置處結合至錨定試劑。實施方案(7)和(8)的表面可以包含顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個不同的結合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的兩個不同的結合域上。所述表面可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的相同結合域上。在一個具體的實施例中，捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內。另外，表面可以包括電極，并且測量步驟可以包括將電壓波形施加到電極以產生電化學發(fā)光信號。在這些實施方案((7)和(8))中，該方法還可以包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號。測量步驟可以包括將擴增子結合到具有可檢測標記的檢測探針，測量可檢測標記，并將測量與樣品中分析物的量相關聯(lián)，其中檢測探針包含與擴增子區(qū)域互補的核酸序列。通過光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場，或其組合的測量來測量可檢測標記。例如，可檢測標記是ECL標記，且測量步驟可以包括測量ECL信號。實施方案(9)：用于檢測樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個或多個小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)錨定試劑；(b)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測試劑；(c)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測試劑；和(d)連接子序列，包含(i)與第二近端探針互補的內部序列和(ii)與第一近端探針的非重疊區(qū)域互補的雙末端序列。實施方案(10)：用于檢測樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個或多個小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)錨定試劑；和(b)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測試劑；(c)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測試劑；和(d)(i)第一連接子寡核苷酸和(ii)第二連接子寡核苷酸，其中(x)第一連接子的第一末端和第二連接子的第一末端與第一近端探針的兩個非重疊區(qū)域互補，和(y)第一連接子的第二末端和第二連接子的第二末端與第一近端探針的兩個非重疊區(qū)域互補。實施方案(9)和(10)的捕獲試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體。在一個具體的實施例中，捕獲試劑可以包括抗體。第一檢測試劑可包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在一個具體的實施例中，第一檢測試劑可包括抗體。第二檢測試劑可包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且在一個具體的實施例中，第二檢測試劑可包括抗體。實施方案(9)和(10)的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個不同的結合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的兩個不同的結合域上。所述表面可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的相同結合域上。在一個特定的實施例中，捕獲試劑和錨定試劑可以在所述表面上的10-100nm內。實施方案(9)和(10)的表面可以包括電極。實施方案(11)：檢測樣品中感興趣分析物的方法，包括：(a)將分析物結合到：(i)表面上的用于分析物的捕獲試劑，所述表面包含捕獲試劑和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(ii)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測試劑；和(iii)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測試劑；從而在表面上形成檢測復合物，所述檢測復合物包含捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測試劑；(b)將在(c)中形成的檢測復合物與連接子序列相接觸，所述連接子序列包含(i)與第二近端探針互補的內部序列，(ii)與第一近端探針的非重疊區(qū)互補的雙末端序列，和(iii)與錨定序列配對的序列；(c)將連接子序列與第一和第二近端探針雜交；(d)連接所述連接子寡核苷酸的雙末端序列以形成與第一和第二近端探針的兩者雜交的環(huán)形靶序列；(e)通過靶序列的滾環(huán)擴增來延伸第二近端探針以產生包含與錨定序列互補的多個錨定序列互補體的擴增子；(f)將所述錨定序列與所述錨定序列互補體之一雜交；和(g)測量表面上的擴增子的量。實施方案(12)：檢測樣品中感興趣分析物的方法，包括：(a)將分析物結合到：(i)表面上的用于分析物的捕獲試劑，所述表面包含捕獲試劑和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(ii)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測試劑；和(iii)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測試劑；從而在表面上形成檢測復合物，所述檢測復合物包含捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測試劑；(b)將在(a)中形成的檢測復合物與第一連接子寡核苷酸和第二連接子寡核苷酸接觸，其中(i)第一連接子的第一末端和第二連接子的第一末端與第一近端探針的兩個非重疊區(qū)域互補，(ii)第一連接子的第二末端和第二連接子的第二末端與第一近端探針的兩個非重疊區(qū)域互補，且(iii)第一和/或第二連接子還包含與錨定序列配對的序列；(c)將第一和第二連接子寡核苷酸與第一和第二近端探針雜交；(d)連接第一和第二連接子寡核苷酸以形成與第一和第二近端探針的兩者雜交的環(huán)形靶序列；(e)通過靶序列的滾環(huán)擴增來延伸第二近端探針以產生包含多個與錨定序列互補錨定序列互補體的擴增子；(f)將錨定序列與錨定序列互補體之一雜交；和(g)測量表面上的擴增子的量。實施方案(11)和(12)的捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體。在一個具體的實施例中，捕獲試劑是抗體。第一檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，并且在一個具體的實施例中，第一檢測試劑是抗體。同樣，第二檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，在一個具體的實施例中，第二檢測試劑是抗體。在一個實施例中，第一和第二檢測試劑是對分析物的抗體。實施方案(11)和(12)的擴增子可以進一步包含一個或多個檢測序列，且所述測量步驟可以進一步包括將所述延伸序列與互補于所述一個或多個檢測序列的多種經標記探針接觸。此外，擴增子還可以包含一個或多個修飾的堿基，并且測量步驟可以包括將延伸序列與能夠結合一個或多個修飾的堿基的多個可檢測部分接觸。擴增子另外包括一個或多個標記的堿基，并且測量步驟可以包括檢測一個或多個標記的堿基的存在。所述一個或多個修飾的堿基包含適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位，并且多個可檢測部分各自包含一個或多個修飾的堿基的結合伴侶和可檢測標記。所述一種或多種修飾的堿基可以包含鏈霉親和素，并且所述多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記；所述一種或多種修飾的堿基可以包含生物素，并且所述多個可檢測部分各自包含鏈霉親和素和可檢測標記；所述一個或多個修飾的堿基可以包含親和素，并且所述多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記；和/或一個或多個修飾的堿基可以包括生物素，并且多個可檢測部分各自包含親和素和可檢測標記。實施方案(11)和(12)的步驟(a)可包括以下列順序將分析物結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的第一和第二檢測試劑。或者，步驟(a)可包括以下列順序將分析物結合到以下種類：(i)用于分析物的第一和第二檢測試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑。另外，步驟(a)可以包括同時或基本上同時將分析物結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的第一和第二檢測試劑。實施方案(11)和(12)的擴增子可以在探針延伸之后仍定位于表面上，且任選地，復合物在延伸步驟后仍結合在表面上。例如，擴增子在所述表面上的復合物位置的10-100um內的位置處結合到所述錨定試劑。在一個具體實施方案中，所述延伸的探針在所述表面上的復合物位置的小于100um、小于50um，或更特別地小于10um的位置處結合到所述錨定試劑。實施方案(11)和(12)的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。任選地，所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個不同的結合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的兩個不同的結合域上。所述表面可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的相同結合域上。捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內。實施方案(11)和(12)的表面可以包括電極，并且測量步驟還可以包括向電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號，任選地，實施方案(11)和(12)進一步包含收集電極上的顆粒并且向電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號。測量步驟還可以包括將擴增子與具有可檢測標記的檢測探針結合，測量可檢測標記，并將測量與樣品中分析物的量相關聯(lián)，其中檢測探針包含與擴增子的區(qū)域互補的核酸序列。可通過光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場，或其組合的測量來測量可檢測標記。在一個實施例中，可檢測標記是ECL標記，且測量步驟可以包括測量ECL信號。實施方案(11)和(12)的樣品可以包含一種或多種分析物分子，并且表面可以包括用于一種或多種分析物分子的多種捕獲試劑，所述捕獲試劑分布在位于表面上的多個可分辨的結合區(qū)域上，且所述方法可以包括：(x)將所述一種或多種分析物分子結合到所述表面上的一種或多種捕獲試劑；(y)確定每個結合區(qū)域中分析物分子的存在或不存在；和(z)鑒定含有分析物分子的結合區(qū)域的數(shù)目和/或不含分析物分子的分析物結合域的數(shù)目。測量步驟可以包括對來自表面的光信號成像以生成包括多個像素的圖像，并且每個可分辨的結合區(qū)域映射(map)到圖像中的一個或多個像素上?？煞直娴慕Y合區(qū)域可以是陣列的元件和/或可分辨的結合區(qū)域被配置為分離單個顆粒。每個可分辨的結合區(qū)域可以是具有體積＜100nL的單個納米孔，如，其中至少99％的結合區(qū)域含有零個或一個分析物分子，其中至少約95％的結合區(qū)域包含零個或一個分析物分子，其中至少約80％的結合區(qū)域包含零個或一個分析物分子，和/或其中至少約50％的結合區(qū)域包含零個或一個分析物分子?？梢灾辽俨糠值厥褂眯Ｕ€、泊松分布分析和/或包含至少一個或一個分析物分子的結合區(qū)域數(shù)目的高斯分布分析來確定實施方案(11)和(12)中樣品中分析物分子的濃度。在實施方案(11)和(12)中，樣品可以包含一種或多種分析物分子，表面可以包括多個顆粒，每個顆粒包括用于分析物分子的多種結合試劑，其中多個顆粒分布在多個可分辨結合區(qū)中，并且所述方法可以包括：(i)將一種或多種分析物分子結合到所述表面上的一種或多種結合試劑，和(ii)將所述多種顆粒分布在可分辨結合區(qū)域陣列上；和(iii)確定每個可分辨結合區(qū)域中分析物分子的存在或不存在，以便鑒定含有分析物分子的結合區(qū)域的數(shù)目和/或鑒定不含分析物分子的結合區(qū)域的數(shù)目。實施方案(13)：用于檢測樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個或多個小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；和(b)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測試劑；(c)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測試劑；和(d)連接子序列，包含(i)與第二近端探針互補的內部序列和(ii)與第一近端探針的非重疊區(qū)域互補的雙末端序列。實施方案(14)：用于檢測樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個或多個小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；和(b)包含第一近端探針的用于分析物的第一檢測試劑；(c)包含第二近端探針的用于分析物的第二檢測試劑；和(d)(i)第一連接子寡核苷酸和(ii)第二連接寡核苷酸，其中(x)第一連接子的第一末端和第二連接子的第一末端與第一近端探針的兩個非重疊區(qū)域互補，且(y)第一連接子的第二末端和第二連接子的第二末端與第一近端探針的兩個非重疊區(qū)域互補。實施方案(13)和(14)的捕獲試劑可以包含抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑可以包括抗體。同樣，第一檢測試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，例如，第一檢測試劑可以包括抗體。類似地，第二檢測試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，例如，第二檢測試劑可以包括抗體。實施方案(13)和(14)的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個不同的結合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的兩個不同的結合域上。所述表面可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的相同結合域上。捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內，且任選地，所述表面可以包括電極。實施方案(15)：檢測樣品中分析物的方法，其中所述方法可包括：(a)將分析物結合到第一和第二檢測試劑以形成檢測復合物，每個檢測復合物包含分析物、第一檢測試劑和第二檢測試劑，其中第一檢測試劑具有第一可檢測標記，且第二檢測試劑具有第二可檢測標記，(b)在多個反應容器間分隔分析物，使得大多數(shù)反應容器包含一個或更少的分析物；和(c)通過計數(shù)含有第一和第二可檢測標記的反應容器的數(shù)量來檢測分析物分子的數(shù)量。在該實施方案(15)中，所述第一檢測試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第一檢測試劑是抗體。同樣，第二檢測試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或配體，例如第二檢測試劑是抗體。在一個具體的實施例中，第一和第二檢測試劑是對分析物的抗體。實施方案(15)的步驟(a)可以進一步包含形成包含所述分析物和所述檢測試劑的溶液，并且步驟(b)可以包含在多個反應容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結合的第一檢測試劑和未結合的第二檢測試劑的可能性小于10分之1?；蛘?，實施方案(15)的步驟(a)可以進一步包括形成包含所述分析物和所述檢測試劑的溶液，并且步驟(b)可以包含在多個反應容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結合的第一檢測試劑和未結合的第二檢測試劑的可能性小于100分之1。此外，實施方案(15)的步驟(a)可以進一步包括形成包含所述分析物和所述檢測試劑的溶液，并且步驟(b)可以包含在多個反應容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結合的第一檢測試劑和未結合的第二檢測試劑的可能性小于1000分之1。此外，實施方案(15)的步驟(a)可以進一步包括形成包含所述分析物和所述檢測試劑的溶液，并且步驟(b)可以包含在多個反應容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結合的第一檢測試劑和未結合的第二檢測試劑的可能性小于10000之1。實施方案(16)：檢測樣品中分析物的方法，所述方法包括：(a)將分析物結合到捕獲試劑以及第一和第二檢測試劑以形成檢測復合物，每個檢測復合物包含捕獲試劑、分析物、第一檢測試劑和第二檢測試劑，其中(i)第一檢測試劑具有第一可檢測標記，且第二檢測試劑具有第二可檢測標記，(ii)捕獲試劑在表面上；(b)在多個反應容器間分隔分析物，使得多個反應容器包含一個或更少的分析物；和(c)通過計數(shù)含有第一和第二可檢測標記的反應容器的數(shù)量來檢測分析物分子的數(shù)量。在該實施方案中，捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑是抗體。同樣，第一檢測試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，第一檢測試劑是抗體。此外，第二檢測試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，第二檢測試劑是抗體。例如，捕獲試劑、第一和第二檢測試劑是對分析物的抗體。實施方案(16)的步驟(b)可以進一步包括在多個反應容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結合的第一檢測試劑和未結合的第二檢測試劑的可能性小于10分之1。此外，實施方案(16)的步驟(b)可以進一步包括在多個反應容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結合的第一檢測試劑和未結合的第二檢測試劑的可能性小于100之1。實施方案(16)的步驟(b)可以進一步包括在多個反應容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結合的第一檢測試劑和未結合的第二檢測試劑的可能性小于1000之1。此外，實施方案(16)的步驟(b)可以進一步包括在多個反應容器間分隔溶液，從而在同一容器中找到未結合的第一檢測試劑和未結合的第二檢測試劑的可能性小于10000分之1。實施方案(16)的檢測復合物中的捕獲試劑可以在將捕獲試劑結合到分析物之前在表面上；或者在將捕獲試劑固定在表面上之前，將檢測復合物中的捕獲試劑結合到分析物。在一個實施例中，檢測試劑可以包括靶向部分，而且所述表面可以包括靶向部分互補體。靶向部分和靶向劑結合伴侶選自以下的結合對：親和素-生物素、鏈霉親和素-生物素、受體-配體、抗體-抗原、核酸-核酸互補體。實施方案(16)的表面是顆粒，并且任選地，捕獲試劑被固定在多個顆粒上，并且通過將分析物結合到捕獲試劑并將顆粒分配到多個反應容器中來實現(xiàn)分析物的分配。捕獲試劑可以被固定在多個顆粒上，并且通過將顆粒分配到多個反應容器中然后將分析物結合到捕獲試劑來實現(xiàn)分析物的分配。實施方案(16)可以進一步包括將多個顆粒分隔到多個反應容器中，其中多個顆粒包含靶向部分，捕獲試劑包括靶向部分互補體，并且通過使靶向模塊互補體結合靶向部分實現(xiàn)分析物的分隔。實施方案(16)還可以包括在分隔步驟之前和/或分隔步驟之后洗滌顆粒。實施方案(16)的表面可以是反應容器之一內的位置。在該實施方案中，捕獲試劑可以被固定在多個反應容器的表面，并且通過將分析物結合到捕獲試劑來實現(xiàn)分析物的分隔。任選地，反應容器具有其上固定有靶向部分的表面，捕獲試劑包括靶向部分互補體，并且通過將靶向部分互補體結合到靶向部分來實現(xiàn)分析物的分配。在該具體的實施例中，該方法可以進一步包括在檢測步驟之前洗滌反應容器。實施方案(16)的多個反應容器可以包括納米孔陣列。多個反應容器可以包括至少10,000個反應容器。在一個實施方案中，反應容器具有小于100nL的體積。任選地，在檢測時小于50％的反應容器含有分析物，在檢測時小于10％的反應容器含有分析物，在檢測時小于1％的反應容器含有分析物，和/或在檢測時小于0.1％的反應容器含有分析物。在實施方案(16)的一個方面，第一可檢測標記是偶聯(lián)酶反應系統(tǒng)的第一酶，并且第二可檢測標記是偶聯(lián)酶反應系統(tǒng)的第二酶，并且步驟(d)可以包括添加一個或多個反應系統(tǒng)的底物，產生酶反應系統(tǒng)的產物并計數(shù)含有所述產物的反應容器。在此實施方案中，可以僅在第一酶和第二酶極其接近(例如，第一和第二酶在彼此的200nM內，或者第一和第二酶在彼此的50nM內)時產生產物。例如，第一酶是氧化酶，第二酶是過氧化酶，并且底物包含氧化酶底物和經標記的AmplexRed或魯米諾衍生物。在此實施方案中，氧化酶可以是葡萄糖氧化酶，并且氧化酶底物是葡萄糖。在一個實施方案中，由檢測復合物中的第一和第二酶催化的反應導致經標記的AmplexRed或魯米諾在表面上的固定化，并且任選地，該方法可以包含測量表面上的經標記的AmplexRed或魯米諾。經標記的AmplexRed或魯米諾是任選地生物素-AmplexRed或魯米諾，并且該方法可以包含添加經標記的鏈霉親合素并測量鏈霉親合素上的標記。實施方案(16)的步驟(d)可以包含測量在第一和第二可檢測標記物與相同分析物分子結合時產生的接近依賴性信號(proximitydependentsignal)，并計算產生接近依賴性信號的反應容器的數(shù)目，例如，通過PLA-RCA產生接近依賴性信號。例如，第一可檢測標記物可以是FRET供體，并且可檢測標記物是FRET受體，并且通過激發(fā)FRET供體和測量從FRET受體的發(fā)射測量接近依賴性信號。在一個實例中，可以獨立測量第一和第二可檢測標記物。任選地，第一和第二可檢測標記物是就光譜特性而言彼此不同的發(fā)光標記物。在一個實例中，第一可檢測標記物是與第一底物起反應以產生第一信號的第一酶，并且第二可檢測標記物是與第二底物起反應以產生第二信號的第二酶，并且實施方案(16)的步驟(d)可以包含添加第一酶底物和第二酶底物，并且計算產生第一和第二信號的反應容器的數(shù)目。第一和第二信號可以是具有不同光譜特性的光學吸光度的變化。任選地，第一和第二信號是具有不同光譜特性的發(fā)光信號。第一和第二酶可以是水解酶，例如選自磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、或其組合，并且第一和第二底物選自磷酸鹽、硫酸鹽、半乳糖苷和葡糖苷酸修飾的穩(wěn)定化二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane)、4-甲基傘形基(4-methylumbelliferyl)、熒光素或其組合。在一個具體的例子中，第一和第二酶選自辣根過氧化酶、beta-半乳糖苷酶、和堿性磷酸酶。實施方案(16)的檢測步驟可以包括經由光散射、光吸光度、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、發(fā)光、放射性、磁場或其組合的檢測。實施方案(17)：用于檢測樣品中分析物的試劑盒，所述試劑盒在一個或多個小瓶、容器或隔室中包含：(a)包含第一可檢測標記的第一檢測試劑；(b)包含第二可檢測標記的第二檢測試劑；(c)配置為含有一個或更少的分析物分子的多個反應容器。實施方案(18)：用于檢測樣品中分析物的試劑盒，所述試劑盒在一個或多個小瓶、容器或隔室中包含：(a)包含第一可檢測標記的第一檢測試劑；(b)包含第二可檢測標記的第二檢測試劑；(c)包含捕獲試劑的表面；和(d)配置為含有一個或更少的分析物分子的多個反應容器。實施方案(17)和(18)的第一和第二檢測試劑可以包含抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位、適體，或其組合。在一個實例中，第一和第二檢測試劑包括抗體。捕獲抗體可以包含抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位、或適體，例如，捕獲抗體可以包括抗體。在一個實施例中，捕獲試劑可以包括靶向部分且表面可以包括靶向部分互補體，例如靶向部分和靶向劑結合伴侶選自以下結合對：親和素-生物素、鏈霉親和素-生物素、受體-配體、抗體-抗原、核酸-核酸互補體。實施方案(17)和(18)的表面可以是顆粒，且例如，捕獲試劑固定在多個顆粒上?；蛘撸摫砻媸欠磻萜髦粌鹊奈恢?，例如，捕獲試劑固定在多個反應容器的表面上?；蛘撸砻媸欠磻萜髦粌鹊奈恢?，并且例如，捕獲試劑被固定在多個反應容器的表面上。任選地，反應容器具有其上固定有靶向部分的表面，并且捕獲試劑包含靶向部分互補體。多個反應容器可以包含納米孔陣列或油包水乳劑中分散的水液滴。多個反應容器可以包含至少10,000個反應容器，并且任選地，所述多個中的反應容器具有小于100nL的體積。實施方案(17)和(18)的試劑盒中，第一可檢測標記可以是偶聯(lián)酶反應系統(tǒng)的第一酶，且第二可檢測標記是偶聯(lián)酶反應系統(tǒng)的第二酶，并且試劑盒可以在一個或多個額外的小瓶，容器或隔室中包括，反應系統(tǒng)的一個或多個底物。例如，第一酶是氧化酶，第二酶是過氧化物酶，底物包括氧化酶底物和標記的AmplexRed或魯米諾衍生物。在一個具體的實施方案中，氧化酶是葡萄糖氧化酶，且氧化酶底物是葡萄糖。第一和第二可檢測標記可以是接近-依賴性系統(tǒng)的組分，例如，第一可檢測標記是FRET供體，且可檢測標記是FRET受體?？梢元毩y量第一和第二可檢測標記。任選地，第一和第二可檢測標記是就光譜特性而言彼此不同的發(fā)光標記。實施方案(17)和(18)的試劑盒中，第一可檢測標記是與第一底物反應產生第一信號的第一酶，且第二可檢測標記是與第二底物反應產生不同的第二信號的第二酶，并且試劑盒可以在一個或多個小瓶、容器或隔室中包括，第一酶底物和第二酶底物。任選地，第一和第二信號是具有不同光譜特性的光吸收的變化。在一個實施例中，第一和第二信號是具有不同光譜特性的發(fā)光信號。第一和第二酶可以是水解酶。在一個實施例中，第一和第二酶選自磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，或其組合。第一和第二底物可以選自磷酸鹽、硫酸鹽、半乳糖苷和葡糖苷酸修飾的穩(wěn)定的二氧雜環(huán)丁烷、4-甲基傘形酮、熒光素，或其組合。任選地，第一和第二酶選自辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。實施方案(19)：檢測樣品中目的分析物的方法，包括：(a)將分析物結合至捕獲試劑、具有第一可檢測標記的第一檢測試劑和具有第二可檢測標記的第二檢測試劑并形成復合物，其中所述復合物中的捕獲試劑在表面上固定化；(b)交聯(lián)第一和第二檢測試劑以形成交聯(lián)產物；(c)將所述交聯(lián)產物從所述表面釋放到洗脫液中；(d)計算包含第一和第二可檢測標記物兩者的洗脫液中的個別交聯(lián)產物。在該實施例(19)中，捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在一個具體的實施例中，捕獲試劑是抗體。同樣，第一檢測試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在一個具體的實施例中，第一檢測試劑是抗體。此外，第二檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適配體，且具體地，第二檢測試劑可以是抗體。在一個具體的實施例中，捕獲試劑和第一和第二檢測試劑是對分析物的抗體。實施方案(19)可進一步包括加入交聯(lián)劑以交聯(lián)第一和第二檢測試劑，例如，第一和第二檢測試劑包含反應性部分，且交聯(lián)劑是連接到反應性部分的多官能交聯(lián)劑。例如，反應性部分包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、馬來酰亞胺、點擊化學試劑(clickchemistryreagent)，及其組合。交聯(lián)劑可以包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、馬來酰亞胺，點擊化學試劑，及其組合。第一和第二檢測試劑可以包括結合部分，并且交聯(lián)劑是結合部分的多價結合伴侶。在一個實施例中，第一和第二檢測試劑是動物物種的抗體，并且交聯(lián)劑是靶向動物物種的抗體的多價抗物種抗體。第一和第二檢測試劑可以包括生物素，并且交聯(lián)劑是鏈霉親和素；第一和第二檢測試劑包括鏈霉親和素，并且交聯(lián)劑是生物素；第一和第二檢測試劑與鏈霉親和素連接，并且交聯(lián)劑是包含多個生物素分子的聚合物；和/或第一和第二檢測試劑分別包含第一和第二核酸探針，并且交聯(lián)劑是寡核苷酸，其可以包含與第一核酸探針互補的序列和與第二核酸探針互補的不同序列。實施方案(19)的表面可以包括顆粒、反應容器，例如管或安瓿瓶，和/或表面可以包括多孔板的孔。實施方案(19)的方法可以進一步包括收集顆粒和洗滌顆粒以除去雜質，且任選地，通過光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場，或其組合的測量來測量第一和第二可檢測標記。在一個具體的實施例中，第一和第二可檢測標記包括ECL標記，并且計數(shù)步驟可以包括測量ECL信號。實施方案(20)：用于檢測樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個或多個小瓶、容器或隔室中包含：(a)包含固定的捕獲試劑的表面；(b)具有第一可檢測標記的第一檢測試劑；(c)具有第二可檢測標記的第二檢測試劑；和(d)與第一和第二檢測試劑反應的交聯(lián)劑。實施方案(20)的第一和第二檢測試劑可以包含反應性部分，并且交聯(lián)劑是連接到反應性部分的多官能交聯(lián)劑。反應性部分可包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、馬來酰亞胺、點擊化學試劑，及其組合；并且交聯(lián)劑可以包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、馬來酰亞胺、點擊化學試劑及其組合。實施方案(20)的第一和第二檢測試劑可以包含結合部分，并且交聯(lián)劑是結合部分的多價結合伴侶，例如，第一和第二檢測試劑是動物物種的抗體，并且交聯(lián)試劑是靶向動物物種的抗體的多價抗物種抗體；所述第一和第二檢測試劑包括生物素，并且交聯(lián)劑是鏈霉親和素；第一和第二檢測試劑包括鏈霉親和素，并且交聯(lián)劑是生物素；第一和第二檢測試劑與鏈霉親和素連接，并且交聯(lián)劑是包含多個生物素分子的聚合物；和/或第一和第二檢測試劑分別包含第一和第二核酸探針，并且交聯(lián)劑是可以包括與第一核酸探針互補的序列以及與第二核酸探針互補的不同的序列的寡核苷酸。實施方案(20)的表面可以包括顆粒、多孔板的孔，或反應容器，例如管或安瓿瓶。另外，所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑位于表面上不同的結合域上。如果表面是孔，則孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑位于孔內的不同結合域上。所述表面還可以包括電極。實施方案(21)：檢測樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)將分析物結合到捕獲試劑、第一和第二檢測試劑以形成檢測復合物，其中第一檢測試劑可以包括第一可檢測標記和第一核酸探針，第二檢測試劑可以包括第二可檢測標記和第二核酸探針，并且復合物中的捕獲試劑被固定在表面上；(b)如下交聯(lián)第一和第二檢測試劑：(i)將第一探針與第二探針雜交，(ii)將第一和第二探針與具有與第一和第二探針互補的區(qū)域的第三核酸雜交，或(iii)連接所述第一和第二探針；(c)將所述交聯(lián)產物從所述表面釋放到洗脫液中；(d)計數(shù)包含第一和第二可檢測標記的洗脫液中的個別交聯(lián)產物。實施方案(21)的捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑是抗體。同樣，第一檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第一檢測試劑是抗體；第二檢測試劑可以是抗體，抗原，配體，受體，寡核苷酸，半抗原，表位，模板或適體，例如第二檢測試劑是抗體。在一個具體的實施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測試劑是對分析物的抗體。實施方案(21)的表面可以包括顆粒、反應容器，例如管或安瓿瓶，或多孔板的孔。實施方式(21)的方法可進一步包括收集顆粒并洗滌顆粒以除去雜質?？梢酝ㄟ^光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場，或其組合的測量來測量第一和第二可檢測標記。在一個具體的實施例中，第一和第二可檢測標記包括ECL標記，并且計數(shù)步驟可以包括測量ECL信號實施方案(22)：用于檢測樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個或多個小瓶、容器或隔室中包含：(a)包含固定化捕獲試劑的表面；(b)具有第一可檢測標記和第一核酸探針的第一檢測試劑；(c)具有第二可檢測標記和第二核酸探針的第二檢測試劑；和(d)具有與所述第一和第二核酸探針互補的區(qū)域的第三核酸。實施方案(22)的表面可以包括顆粒、多孔板的孔或反應容器，例如管或安瓿瓶。所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑位于表面上不同的結合域上。如果表面是孔，則孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑位于孔內的不同結合域上。表面任選地可以包括電極。實施方案(23)：檢測樣品中感興趣的分析物的方法，其包括：(a)將分析物結合至捕獲試劑、第一檢測試劑和第二檢測試劑以形成復合物，其中第一檢測試劑可包括第一核酸探針，第二檢測試劑可以包括第二核酸探針，并且復合物中的捕獲試劑固定在表面上；(b)延伸所述第二核酸探針以形成包含可檢測標記的延伸序列，該延伸依賴于所述復合物中第一和第二核酸探針的共定位；(c)將所述延伸序列從所述表面釋放到洗脫液中；和(d)計數(shù)洗脫液中的個別延伸序列。在該實施方案中，捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體。在一個具體實例中，捕獲試劑是抗體。同樣，第一檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在一個具體的實施例中，第一檢測試劑是抗體。第二檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，且具體地，第二檢測試劑是抗體。在一個具體的實施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測試劑是對分析物的抗體。實施方案(23)的表面可以包括顆粒、反應容器，例如管或安瓿瓶；或多孔板的孔。實施方案(23)的方法可進一步包含收集并洗滌顆粒以除去雜質。實施方案(23)的標記可以通過光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場，或其組合的測量來測量。在一個具體的實施例中，所述標記可以包括ECL標記，并且計數(shù)步驟可以包括測量ECL信號。實施方案(23)的延伸步驟可以包括將探針與模板核酸序列結合，并通過聚合酶鏈式反應延伸探針。延伸步驟還可以包括將第一探針結合到模板核酸序列，形成環(huán)形核酸模板，并通過滾環(huán)擴增延伸環(huán)形模板。延伸步驟可以包括將第一探針結合到模板核酸序列，將第二探針結合到模板序列，以及連接第一和第二探針。任選地，所述標記是熒光標記，并且個別延伸序列的計數(shù)可以包括單分子熒光檢測，例如可以包括熒光關聯(lián)光譜和/或熒光交叉關聯(lián)光譜。單分子熒光檢測可包括使洗脫液流過毛細管，將光源聚焦在毛細管內的體積上以產生探詢區(qū)，并用光檢測器觀察探詢區(qū)以檢測經過探詢區(qū)的熒光分子的通過。單分子熒光檢測還可包括使洗脫液流過毛細管，將光源聚焦在毛細管內的體積上以產生探詢區(qū)，并用光檢測器觀察探詢區(qū)以檢測經過探詢區(qū)的熒光分子的通過。實施方案(24)：檢測樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)將分析物結合到捕獲試劑、具有第一可檢測標記的第一檢測試劑和具有第二可檢測標記的第二檢測試劑，并形成復合物，其中所述復合物中的捕獲試劑被固定在表面上；(b)通過將固定化的捕獲試劑從表面解離進入洗脫液，從表面釋放形成的復合物；和(c)計數(shù)洗脫液中包含第一和第二可檢測標記兩者的個別產物。在該實施方案中，捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑是抗體；第一檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第一檢測試劑是抗體；第二檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第二檢測試劑是抗體；并且在一個具體的實施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測試劑是對分析物的抗體。實施方案(24)的表面可以包括顆粒、反應容器，例如管或安瓿瓶，和/或多孔板的孔。實施方式(24)的方法可以包括收集顆粒并洗滌顆粒以除去雜質?？梢酝ㄟ^光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場，或其組合的測量來測量第一和第二可檢測標記，且在一個具體的實施方案中，第一和第二可檢測標記包括ECL標記，并且計數(shù)步驟可以包括測量ECL信號實施方案(25)：檢測樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)將分析物結合到：(i)包含針對分析物的捕獲試劑的表面上的捕獲試劑；(ii)與第一核酸探針連接的用于分析物的第一檢測試劑；和(iii)與第二核酸探針連接的用于分析物的第二檢測試劑；從而在表面上形成復合物，所述復合物包含結合試劑、分析物以及第一和第二檢測試劑；(b)使用要求第一和第二探針接近的延伸過程，延伸第二探針以形成延伸序列；和(c)測量結合到表面的延伸序列的量。在該實施方案中，捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑是抗體；第一檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第一檢測試劑是抗體；第二檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第二檢測試劑是抗體；并且在一個具體的實施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測試劑是對分析物的抗體。實施方案(25)的延伸序列可以包含一個或多個檢測序列，并且測量步驟可以包含使延伸序列與與一個或多個檢測序列互補的多個標記的探針接觸；延伸序列可以包含一種或多種經修飾的堿基，并且測量步驟可以包含使延伸序列與能夠結合一種或多種經修飾的堿基的多個可檢測部分接觸；和/或延伸序列可以包含一種或多種標記的堿基，并且測量步驟可以包含檢測一種或多種標記的堿基的存在。一種或多種修飾的堿基包含適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位、或模擬位，并且多個可檢測部分各自包含一種或多種修飾的堿基的結合伴侶和可檢測標記物。一種或多種修飾的堿基可以包含鏈霉親合素，并且多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記物；一種或多種修飾的堿基包含生物素，并且多個可檢測部分各自包含鏈霉親合素和可檢測標記物；一種或多種修飾的堿基包含親合素，并且多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記物；和/或一種或多種修飾的堿基包含生物素，并且多個可檢測部分各自包含親合素和可檢測標記物。實施方案(25)的步驟(a)可包括以下列順序將分析物結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的檢測試劑；以下列順序將分析物結合到以下種類：(i)用于分析物的檢測試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑；或將分析物同時或基本上同時結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的檢測試劑。延伸步驟可以包括將探針結合到模板核酸序列，并通過聚合酶鏈式反應延伸探針；或將探針結合到模板核酸序列，形成環(huán)形核酸模板，并通過滾環(huán)擴增延伸環(huán)形模板。在該實施方案中，所述延伸的探針在探針延伸后可仍位于表面上，例如，所述復合物在延伸步驟后仍結合到表面。延伸步驟可包括PCR(聚合酶鏈式反應)、LCR(連接酶鏈式反應)、SDA(單鏈置換擴增)、3SR(自動維持合成反應)，或等溫擴增方法。在一個具體的實施例中，所述延伸步驟可包括等溫擴增方法，如解旋酶依賴性擴增或滾環(huán)擴增(RCA)。實施方案(25)的延伸過程可包括將步驟(a)中形成的復合物與連接子序列接觸，所述連接子序列包含(i)與第二探針互補的內部序列和(ii)與第一探針的非重疊區(qū)互補的雙末端序列。該過程可以進一步包括連接連接子寡核苷酸的雙末端序列以形成與第一和第二探針雜交的環(huán)形靶序列。實施方案(25)的延伸過程還可以包括將在步驟(a)中形成的復合物與第一連接子寡核苷酸序列和第二連接子寡核苷酸序列接觸，所述第一連接子寡核苷酸序列包含互補于所述第一探針的第一區(qū)域和所述第二探針的第一區(qū)域的第一連接子探針序列，所述第二連接子寡核苷酸包含互補于所述第一探針的第二非重疊性區(qū)域和所述第二探針的第二非重疊性區(qū)域的第二連接子探針序列。該過程還可以包括連接第一和第二連接子寡核苷酸以形成與第一和第二探針兩者雜交的環(huán)形靶序列。實施方案(25)的表面可以包括顆粒或多孔板的孔。所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑位于表面上的兩個不同的結合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑位于孔內的兩個不同的結合域上。所述表面可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑位于表面上相同的結合域上，并且如果表面是孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑位于孔內的相同結合域上。所述表面可以包括電極，并且測量步驟可以包括將電壓波形施加到電極以產生電化學發(fā)光信號。該方法任選地包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號。測量步驟可進一步包括將延伸序列結合到具有可檢測標記的檢測探針，測量可檢測標記，并將測量與樣品中分析物的量相關聯(lián)，其中檢測探針包含與延伸序列的區(qū)域互補的核酸序列?？赏ㄟ^光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場，或其組合的測量來測量可檢測標記。在一個具體的實施例中，可檢測標記是ECL標記，并且測量步驟可以包括測量ECL信號。實施方案(26)：用于檢測樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個或多個小瓶、容器或隔室中包括：(a)包含用于分析物的捕獲試劑的表面；(b)連接到第一核酸探針的用于分析物的第一檢測試劑；和(c)連接到第二核酸探針的用于分析物的第二檢測試劑。實施方案(26)的捕獲試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如捕獲試劑可以包括抗體；第一檢測試劑可包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第一檢測試劑可包括抗體；第二檢測試劑可包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第二檢測試劑可包括抗體；并且表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑位于表面上的兩個不同的結合域上；并且如果表面是孔，則孔可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑位于孔內的兩個不同的結合域上。任選地，表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑位于表面上的相同結合域上，并且如果表面是孔，則孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑位于孔內的相同結合域上。所述表面可以包括電極。實施方案1-26的表面可以包括測定容器(例如試管、比色皿、流動池、FACS細胞分選儀、筒(cartridge)或多孔板的孔)的內表面。所述表面還可以包括載玻片、測定芯片，或測定陣列；針、探針、珠，或過濾介質；側向流介質，例如過濾膜。實施方案(27)：檢測包含一種或多種分析物分子的樣品中的感興趣的分析物的方法，所述方法包括：(a)將樣品與包含位于表面上的多個可分辨結合區(qū)域的表面接觸，每個可分辨結合區(qū)域包含用于樣品中一種或多種分析物分子的多種捕獲試劑；(b)將一種或多種分析物分子結合到(i)表面上的一種或多種捕獲試劑；(ii)包含第一可檢測標記的用于分析物的第一檢測試劑，和(iii)包含第二可檢測標記的用于分析物的第二檢測試劑；從而在表面上的可分辨的結合域上形成檢測復合物，所述檢測復合物包括捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測試劑，其中所述第一和第二可檢測標記是不同的標記化合物；(c)確定每個結合區(qū)域中分析物分子的存在或不存在；和(d)鑒定含有分析物分子的結合區(qū)域的數(shù)目和/或鑒定不含分析物分子的結合區(qū)域的數(shù)目。鑒定步驟可以包括對來自表面的光學信號進行成像以生成包括多個像素的圖像，并且每個可分辨的結合區(qū)域映射到圖像中的一個或多個像素。可分辨的結合區(qū)域可以是陣列的元件和/或被配置為分離個別顆粒。每個可分辨的結合區(qū)域可以是具有體積＜100nL的單個納米孔和/或至少99％的結合區(qū)域包含零個或一個分析物分子；至少約95％的結合區(qū)域包含零個或一個分析物分子；其中至少約80％的結合區(qū)域包含零個或一個分析物分子；或至少約50％的結合區(qū)域包含零個或一個分析物分子?？梢灾辽俨糠值厥褂冒辽僖粋€或一個分析物分子的結合區(qū)域數(shù)目的校正曲線、泊松分布分析和/或高斯分布分析來確定樣品中分析物分子的濃度。實施方案(27)的表面可以包括多個顆粒，每個顆粒包括用于分析物分子的多種捕獲試劑，其中多個顆粒分布在多個可分辨結合區(qū)中，并且所述方法可以包括：(i)將一種或多種分析物分子結合到所述表面上的一種或多種結合試劑，和用于所述一種或多種分析物分子中的每一種的第一和第二檢測試劑，其中所述第一和第二檢測試劑分別包括第一和第二可檢測標記；(ii)在可糞便結合區(qū)的陣列間分布多個顆粒；和(iii)確定每個可分辨結合區(qū)域中分析物分子的存在或不存在，以便鑒定含有分析物分子的結合區(qū)域的數(shù)目和/或鑒定不含分析物分子的結合區(qū)域的數(shù)目，其中任選地，每個可分辨的結合區(qū)域可以是具有體積＜100nL的單個納米孔，和/或至少99％的結合區(qū)域包含零個或一個分析物分子；至少約95％的結合區(qū)域包含零個或一個分析物分子；其中至少約80％的結合區(qū)域包含零個或一個分析物分子；或至少約50％的結合區(qū)域包含零個或一個分析物分子。實施方案(27)中的捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑是抗體；第一檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，第一檢測試劑是抗體；第二檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位或適體，例如第二檢測試劑是抗體。在一個具體的實施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測試劑是對分析物的抗體。實施方案(27)的步驟(a)可以包括以下列順序將分析物結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的第一和第二檢測試劑；按以下順序將分析物結合到以下種類：(i)用于分析物的第一和第二檢測試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑；或將分析物同時或基本上同時結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于分析物的第一和第二檢測試劑。實施方案(27)的表面可以包括顆?；蚨嗫装宓目?。在一個具體的實施例中，所述表面可以包括電極，且所述鑒定步驟可以包括向電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號。實施方案(27)的方法可以進一步包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號。通過光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場，或其組合的測量來測量第一可檢測標記；和/或第二可檢測標記通過光散射、光學吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場，或其組合的測量來測量。所述第一和第二可檢測標記可以獨立地測量，并且在一個實例中，第一和第二可檢測標記是相對于光譜特性彼此不同的發(fā)光標記。實施方案(27)的表面可以包括測定容器(例如試管、比色皿、流動池、FACS細胞分選儀、筒，或多孔板的孔)的內表面。所述表面還可以包括載玻片、測定芯片，或測定陣列；針、探針、珠，或過濾介質；側向流介質，例如過濾膜。實施方案(28)：用于檢測包含一種或多種分析物分子的樣品中的感興趣的分析物的試劑盒，所述試劑盒包括：(a)包含位于表面上的多個可分辨結合區(qū)域的表面，每個可分辨結合區(qū)域包含用于樣品中一種或多種分析物分子的多種捕獲試劑；(b)包含第一可檢測標記的用于所述分析物的第一檢測試劑，和(c)包含第二可檢測標記的用于分析物的第二檢測試劑；其中所述第一和第二可檢測標記是不同的標記化合物。實施方案(28)的可分辨結合區(qū)域可以是陣列的元件和/或被配置為分離的個別的顆粒。任選地，每個可分辨的結合區(qū)域任選地是體積＜100nL的個別納米孔。所述表面可以包括多個顆粒，每個顆粒包括用于分析物分子的多種捕獲試劑，其中所述多個顆粒分布在多個可分辨的結合區(qū)域上，并且所述試劑盒可以包括：用于所述一種或多種分析物分子中的每一種的第一和第二檢測試劑，其中所述第一和第二檢測試劑分別包括第一和第二可檢測標記。實施方案(28)中的捕獲試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，捕獲試劑是抗體；第一檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如，第一檢測試劑是抗體；第二檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第二檢測試劑是抗體。在一個具體實施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測試劑是對分析物的抗體。實施方案(28)的表面可以包括顆?；蚨嗫装宓目?。在一個具體的實施例中，表面可以包括電極，并且鑒定步驟可以包括將電壓波形施加到電極以產生電化學發(fā)光信號。通過光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場，或其組合的測量來測量第一可檢測標記；和/或通過光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場，或其組合的測量來測量第二可檢測標記。第一和第二可檢測標記可以獨立地測量，并且在一個實施例中，第一和第二可檢測標記是相對于光譜特性彼此不同的發(fā)光標記。實施方案(28)的表面可以包括測定容器(例如試管、比色皿、流動池、FACS細胞分選儀、筒，或多孔板的孔)的內表面。所述表面還可以包括載玻片、測定芯片，或測定陣列；針、探針、珠，或過濾介質；側向流介質，例如過濾膜。實施方案(29)：檢測樣品中的HIVp24的方法，包括：(a)將HIVp24結合到：(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于HIVp24的捕獲試劑，和包含錨定寡核苷酸的錨定試劑；(ii)連接到第一核酸探針的用于HIVp24的第一檢測試劑；和(iii)連接到第二核酸探針的用于HIVp24的第二檢測試劑；從而在表面上形成復合物，所述復合物包含結合試劑、HIVp24以及第一和第二檢測試劑；(b)使用需要第一和第二探針接近的延伸過程，延伸第二探針以形成包含與錨定序列互補的錨定序列互補體的延伸序列；(c)將錨定序列與錨定序列互補體雜交；和(d)測量結合到表面的延伸序列的量。實施方案(29)的捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體。在一個具體的實施例中，捕獲試劑是抗體。同樣，第一檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，在一個具體的實施例中，第一檢測試劑是抗體。第二檢測試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在一個具體的實例中，第二檢測試劑是抗體。更具體地，捕獲試劑以及第一和第二檢測試劑是HIVp24的抗體。在實施方案(29)中，錨定寡核苷酸序列可以包括單鏈寡核苷酸序列或雙鏈寡核苷酸序列。在該實施方案中，延伸序列可以包括一個或多個檢測序列，且測量步驟可以包括將延伸序列與多個與一個或多個檢測序列互補的標記探針接觸。延伸序列還可以包括一個或多個修飾的堿基，并且測量步驟可以包括將延伸序列與能夠結合一個或多個修飾的堿基的多個可檢測部分接觸。延伸序列可以進一步包含一種或多種經標記的堿基，并且測量步驟可以包括檢測一種或多種標記的堿基的存在。一種或多種修飾的堿基可以包括適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位，或模擬表位，并且多個可檢測部分各自包含一種或多種修飾的堿基的結合伴侶和可檢測標記。例如，一種或多種修飾的堿基包含鏈霉親合素，并且多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記物；一種或多種修飾的堿基包含生物素，并且多個可檢測部分各自包含鏈霉親合素和可檢測標記物；或者一種或多種修飾的堿基包含親合素，并且多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記物；和/或一種或多種修飾的堿基包含生物素，并且多個可檢測部分各自包含親合素和可檢測標記。實施方案(29)的步驟(a)可以包括按以下順序將HIVp24結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于HIVp24的檢測試劑?；蛘撸襟E(a)可包括以下列順序將HIVp24結合到以下種類：(i)用于HIVp24的檢測試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑；或步驟(a)可以包括同時或基本上同時將HIVp24結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于HIVp24的檢測試劑。實施方案(29)的延伸步驟可以包括將探針結合到模板核酸序列，并通過聚合酶鏈式反應延伸探針。延伸步驟可以進一步包括將探針結合到模板核酸序列，形成環(huán)形核酸模板，并通過滾環(huán)擴增延伸環(huán)形模板。在探針延伸之后延伸的探針可以仍位于表面上，例如在延伸步驟后復合物仍結合到表面上。所述延伸的探針在所述表面上的復合物位置的10-100um內的位置處結合到所述錨定試劑。在一個具體實施方案中，所述延伸的探針在所述表面上的復合物位置的小于100um、小于50um，或更特別地小于10um的位置處結合到所述錨定試劑。延伸步驟可包括PCR(聚合酶鏈式反應)、LCR(連接酶鏈式反應)、SDA(單鏈置換擴增)、3SR(自動維持合成反應)，或等溫擴增方法。在一個具體的實施例中，所述延伸步驟可包括等溫擴增方法，例如為解旋酶依賴性擴增或滾環(huán)擴增(RCA)。實施方案(29)的延伸過程可包括將步驟(a)中形成的復合物與連接序列子接觸，所述連接子序列包含(i)與第二探針互補的內部序列和(ii)與第一探針的非重疊區(qū)互補的雙末端序列。該方法可以進一步包括連接寡核苷酸的雙末端序列以形成與第一和第二探針兩者雜交的環(huán)形靶序列?；蛘?，延伸過程可包括將實施方案(29)的步驟(a)中形成的復合物與第一連接子寡核苷酸序列和第二連接子寡核苷酸序列接觸，所述第一連接子寡核苷酸序列包括與第一探針上的第一區(qū)域和第二探針上的第一區(qū)域互補的第一連接子探針序列，所述第二連接子寡核苷酸序列包含與第一探針的第二非重疊區(qū)和第二探針的第二非重疊區(qū)互補的第二探針序列；并且任選地，連接第一和第二連接子寡核苷酸以形成與第一和第二探針兩者雜交的環(huán)形靶序列。實施方案(29)的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個不同的結合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的兩個不同的結合域上。所述表面還可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的相同結合域上。捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內。在一個具體的實施例中，所述表面可以包括電極，且所述測量步驟還可包括向電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號，并且任選地，實施方式(29)的方法進一步包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號。實施方案(29)的測量步驟可以包括將延伸序列與具有可檢測標記的檢測探針結合，測量可檢測標記，并將該測量與樣品中p24的量相關聯(lián)，其中檢測探針包含與延伸序列的區(qū)域互補的核酸序列?？赏ㄟ^光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場或其組合的測量來測量可檢測標記。在一個具體的實施例中，所述可檢測標記是ECL標記，且測量步驟可以包括測量ECL信號。實施方案(30)：用于檢測樣品中的HIVp24的試劑盒，其在一個或多個小瓶、容器或隔室中包括：(a)表面，包含(i)用于HIVp24的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(b)與第一核酸探針連接的用于HIVp24的第一檢測試劑；和(c)與第二核酸探針連接的用于HIVp24的第二檢測試劑。實施方案(30)的捕獲試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，在一個具體的實施例中，捕獲試劑可以包括抗體。同樣，第一檢測試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，在一個具體的實施例中，第一檢測試劑可以包括抗體。類似地，第二檢測試劑可以包括抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位，模擬表位，或適體，且在一個具體的實施例中，第二檢測試劑可以包括抗體。實施方案(30)的表面可以包括顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個不同的結合域上。如果表面是孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的兩個不同的結合域上。所述表面還可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結合域上；和/或如果表面是孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的相同結合域上。捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內。在一個具體的實施例中，所述表面可以包括電極。實施方案(31)：檢測樣品中的HIVp24的方法，包括：(a)將HIVp24結合到：(i)在表面上的用于HIVp24的捕獲試劑，所述表面包含捕獲試劑和錨定試劑；(ii)包含第一近端探針的用于HIVp24的第一檢測試劑，和(iii)包含第二近端探針的用于HIVp24的第二檢測試劑；從而在表面上形成檢測復合物，所述檢測復合物包含捕獲試劑、HIVp24以及第一和第二檢測試劑；(b)將在(c)中形成的檢測復合物與連接子序列相接觸，所述連接子序列包含(i)與第二近端探針互補的內部序列和(ii)與第一近端探針的非重疊區(qū)域互補的雙末端序列；(c)將連接子序列與第一和第二近端探針雜交；(d)連接連接子寡核苷酸的雙末端序列以形成與第一和第二近端探針的兩者雜交的環(huán)形靶序列；(e)通過靶序列的滾環(huán)擴增來延伸第二近端探針以產生包含結合錨定試劑的結合域的擴增子；(f)將擴增子結合到錨定試劑；和(g)測量表面上的擴增子的量。實施方案(32)：檢測樣品中的HIVp24的方法，包括：(a)將HIVp24結合到：(i)在表面上的用于HIVp24的捕獲試劑，所述表面包含捕獲試劑和錨定試劑；(ii)包含第一近端探針的用于HIVp24的第一檢測試劑，和(iii)包含第二近端探針的用于HIVp24的第二檢測試劑；從而在表面上形成檢測復合物，所述檢測復合物包含捕獲試劑、HIVp24以及第一和第二檢測試劑；(b)將在(c)中形成的檢測復合物與第一連接子寡核苷酸和第二連接子寡核苷酸相接觸，其中(i)第一連接子的第一末端和第二連接子的第一末端與第一近端探針的兩個非重疊區(qū)域互補，且(ii)第一連接子的第二末端和第二連接子的第二末端與第一近端探針的兩個非重疊區(qū)域互補；(c)將第一和第二連接子寡核苷酸與第一和第二近端探針雜交；(d)連接第一和第二連接子寡核苷酸以形成與第一和第二近端探針的兩者雜交的環(huán)形靶序列；(e)通過靶序列的滾環(huán)擴增來延伸第二近端探針以產生包含結合錨定試劑的結合域的擴增子；(f)將擴增子結合到錨定試劑；和(g)測量表面上的擴增子的量。實施方案(31)和(32)的捕獲試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，且在一個具體實施例中，捕獲試劑是抗體。類似地，第一檢測試劑可以是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第一檢測試劑是抗體。另外，第二檢測試劑是抗體、抗原、配體、受體、寡核苷酸、半抗原、表位、模擬表位，或適體，例如第二檢測試劑是抗體。在實施方案(31)和(32)的一個具體的實施例中，捕獲試劑以及第一和第二檢測試劑是對HIVp24的抗體。實施方案(31)和(32)的錨定試劑可以包括寡核苷酸序列、適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位或模擬表位。在一個實施例中，結合表位可以包括適體，且錨定試劑可以包括適體配體。結合域可以包括核酸序列，且錨定試劑可以包括DNA結合蛋白；和/或錨定試劑可以包括寡核苷酸序列，且擴增子可以包括互補寡核苷酸序列。實施方案(31)和(32)的擴增子可以包含一個或多個檢測序列，并且測量步驟可以包含使延伸序列接觸與一個或多個檢測序列互補的多個經標記的探針。此外，擴增子可以進一步包含一種或多種經修飾的堿基，并且測量步驟可以包含使延伸序列接觸能夠結合一種或多種經修飾的堿基的多個可檢測部分。此外，擴增子可以進一步包含一種或多種經標記的堿基，并且測量步驟可以包含檢測一種或多種經標記的堿基的存在。一種或多種經修飾的堿基可以包含適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位、或模擬位，并且多個可檢測部分各自包含一種或多種經修飾的堿基的結合伴侶和可檢測標記物。一種或多種經修飾的堿基可以包含鏈霉親合素，并且多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記物；一種或多種經修飾的堿基可以包含生物素，并且多個可檢測部分各自包含鏈霉親合素和可檢測標記物；一種或多種經修飾的堿基可以包含親合素，并且多個可檢測部分各自包含生物素和可檢測標記物；和/或一種或多種經修飾的堿基可以包含生物素，并且多個可檢測部分各自包含親合素和可檢測標記物。實施方案(31)和(32)的步驟(a)可包括以下列順序將HIVp24結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于HIVp24的第一和第二檢測試劑?；蛘?，步驟(a)可包括以下列順序將HIVp24結合到以下種類：(i)用于HIVp24的第一和第二檢測試劑；和(ii)表面上的捕獲試劑。另外，步驟(a)可以包括同時或基本上同時將HIVp24結合到以下種類：(i)表面上的捕獲試劑；和(ii)用于HIVp24的第一和第二檢測試劑。實施方案(31)和(32)的擴增子可以在探針延伸之后仍位于表面上。復合物可以在延伸步驟后仍結合在表面上。例如，擴增子在表面上的復合物的位置的10-100um內的位置處與錨定試劑結合。在一個具體實施方案中，所述延伸的探針在所述表面上的復合物位置的小于100um、小于50um，或更特別地小于10um的位置處結合到所述錨定試劑。實施方案(31)和(32)的表面可以包含顆粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上的兩個不同的結合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的兩個不同的結合域上。所述表面可以包含多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于表面上相同的結合域上。如果表面是板的孔，則所述孔可以包括多個不同的結合域，并且捕獲試劑和錨定試劑位于孔內的相同結合域上。在一個具體的實施例中，捕獲試劑和錨定試劑在表面上的10-100nm內。另外，表面可以包括電極，并且測量步驟可以包括將電壓波形施加到電極以產生電化學發(fā)光信號。在這些實施方案((31)和(32))中，該方法還可以包括在電極上收集顆粒并向電極施加電壓波形以產生電化學發(fā)光信號。測量步驟可以包括將擴增子結合到具有可檢測標記的檢測探針，測量可檢測標記，并將測量與樣品中分析物的量相關聯(lián)，其中檢測探針包含與擴增子區(qū)域互補的核酸序列?？蓹z測標記通過光散射、光吸收、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、生物發(fā)光、磷光、放射性、磁場，或其組合的測量來測量。例如，可檢測標記是ECL標記，且測量步驟可以包括測量ECL信號。實施方案(33)：檢測樣品中感興趣的分析物的方法，包括：(a)在足以形成包含結合至第一檢測試劑的分析物的分析物復合物的條件下濃縮樣品，其中所述第一檢測試劑連接至第一核酸探針；(b)將步驟(a)中形成的分析物復合物結合到：(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于分析物的捕獲試劑，和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；和(ii)與第二核酸探針連接的用于分析物的第二檢測試劑；從而在表面上形成包含捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測試劑的復合物；(c)使用需要第一和第二探針接近的延伸過程，延伸第二探針以形成包含錨定序列互補體的延伸序列，所述互補體與錨定序列互補；(d)將錨定序列與錨定序列互補體雜交；和(e)測量結合到表面的延伸序列的量。濃縮步驟(a)可進一步包括(i)將包含分析物的樣品與固相接觸，所述固相連接至與第一核酸探針的至少一部分互補的靶向劑，從而形成包含通過所述第一核酸探針和靶向劑之間的結合反應結合到固相的分析物的濃縮復合物；(ii)收集所述濃縮復合物；(iii)從所述濃縮復合物中分離樣品的未結合的組分；和(iv)釋放所述濃縮復合物以將固相從所述分析物分離，以形成分析物復合物。實施方案(34)：用于檢測樣品中感興趣的分析物的試劑盒，其在一個或多個小瓶、容器或隔室中包括：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(b)連接到第一核酸探針的用于分析物的第一檢測試劑；(c)連接到第二核酸探針的用于分析物的第二檢測試劑；和(d)固相，其包含與第一核酸探針的至少一部分互補的靶向劑。實施方案(35)：檢測樣品中的外來體(exosome)的方法，包括：(a)將外來體結合到：(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于外來體的捕獲試劑，和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(ii)連接到第一核酸探針的用于外來體的第一檢測試劑；和(iii)連接到第二核酸探針的用于外來體的第二檢測試劑；從而在表面上形成復合體，所述復合體包含結合試劑、外來體以及第一和第二檢測試劑；(b)使用需要第一和第二探針接近的延伸過程，延伸第二探針以形成包含錨定序列互補體的延伸序列，所述互補體與錨定序列互補；(c)將錨定序列與錨定序列互補體雜交；和(d)測量結合到表面的延伸序列的量。實施方案(36)：用于檢測樣品中感興趣的外來體的試劑盒，其在一個或多個小瓶、容器或隔室中包括：(a)表面，包含(i)用于外來體的捕獲試劑，和(ii)包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；(b)連接到第一核酸探針的用于外來體的第一檢測試劑；和(c)連接到第二核酸探針的用于外來體的第二檢測試劑。附圖簡述圖1(a)-(c)例示了免疫測定中錨定試劑的使用。圖1(a)顯示了使用錨定試劑結合和穩(wěn)定化檢測復合物，所述檢測復合物包含捕獲試劑、感興趣的分析物和包含核酸探針的檢測試劑。延伸核酸探針以結合錨定試劑。在圖1(b)中，錨定試劑包含以下寡核苷酸序列，其包含與檢測試劑上形成的延伸序列的一部分互補的區(qū)域。圖1(c)顯示了在具體的實施方案中，使用兩種檢測試劑以結合分析物，每種檢測試劑包括核酸探針。對檢測試劑上的探針進行擴增過程，所述過程使得一種延伸的探針與錨定寡核苷酸序列雜交。圖2(a)顯示一個具體的實施方案，其中對帶有錨定試劑的表面上形成的免疫復合物進行PLA-RCA過程以在附接于免疫復合物的延伸序列中摻入多種可檢測的種類。圖2(b)和2(c)是連接寡核苷酸的兩種備選的配置，其可以在本發(fā)明的方法中采用。圖3顯示將寡核苷酸附接于蛋白質的方法。圖4(a)例示了本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，其中在捕獲試劑、分析物和兩種檢測試劑之間形成表面結合復合物，其中所述兩種檢測試劑各自分別附接第一和第二近端探針，其(ligated)到連接子探針以形成環(huán)形DNA模板，其通過滾環(huán)擴增來擴增。圖4(a)還包括擴增試劑，其包括與隨著測定方法進展形成的擴增子的序列互補的錨定寡核苷酸序列。圖4(b)顯示了第一環(huán)形DNA模板Circ-1、檢測寡核苷酸序列，擴增子的無活性區(qū)(inertregion)和被設計為與第二近端探針雜交的部分PP2的示例性序列。在圖4(c)中描繪了替代實施方案。圖5和圖6(a)-(b)例示了生成可通過滾環(huán)擴增來擴增的擴增子的備選方法。圖7例示了一個備選的實施方案，其中夾心復合物中的每個近端探針的一部分由雜交于各區(qū)段的RNA短鏈暫時保護。酶法除去那些鏈以允許近端探針彼此雜交和與要延伸的鏈雜交。圖8顯示了進一步的實施方案，其中近端探針附接于捕獲試劑和檢測試劑，且每個近端探針的一部分由與其雜交的RNA短鏈暫時保護，如上文關于圖8描述的。圖9顯示使用實施例1中描述的方法進行的IL-10測定法的校正曲線。圖10(a)-(b)顯示了使用(a)和不使用(b)錨定試劑的熒光顯微圖像。圖11(a)顯示了包括連接位點1或2的單個線性連接子寡核苷酸序列的配置，以及在本發(fā)明的測定中這些連接子的使用。圖11(b)顯示了使用Circ-1和Circ-2的組合相對于(vs.)包括連接位點1的單個線性連接寡核苷酸序列或包括連接位點2的單個線性連接寡核苷酸序列的測定的比較性能數(shù)據(jù)。圖12顯示使用實施例1和6中描述的方法進行的HIVp24測定法的校正曲線。圖13顯示使用實施例1和6中描述的方法對血清轉化組(seroconversionpanel)的分析的結果。圖14(a)-(c)顯示包括分析物濃縮步驟的用于HIVp24的測定結果。圖15顯示包括分析物濃縮步驟的用于HIVp24測定的校正曲線。圖16是如本文所述的包括分析物濃縮步驟的測定方法的示意圖。圖17是如本文所述的測定方法的示意圖，其中在通過捕獲試劑和/或錨定試劑結合到表面之前在溶液中形成擴增子。圖18是結合使用多個U形序列(staplesequences)以附著于擴增子，從而在表面上形成更緊湊結構的測定方法的示意圖。圖19是結合3ABPLA-RCA技術和使用靶向部分及其互補體以將捕獲試劑結合到表面的橋接免疫測定形式(bridgingimmunoassayformat)的示意圖。圖20(a)-(b)是用于模板形成的生物合成方法的示意圖。圖21是樣品多重化(multiplexing)的示意圖。圖22是使用本文所述方法檢測脂蛋白復合物的示意圖。發(fā)明詳述除非本文中另外定義，關于本發(fā)明中使用的技術和科學術語應具有與本領域中的普通技術人員普遍理解的相同的含義。此外，除非上下文另外要求，單數(shù)術語應包括復數(shù)且復數(shù)術語應包括單數(shù)。冠詞“一個”和“一種”用于本文指一個/種或超過一個/種(即至少一個/種)的該冠詞的語法對象。例如，“一個/種要素”意指一個/種要素或超過一個/種要素。本發(fā)明包括改進的免疫測定方法，其包括(i)錨定靶分析物和測定法中使用的一種或多種分析物結合試劑之間形成的檢測復合物；和/或(ii)從經標記的檢測復合物擴增信號。錨定可用于穩(wěn)定化牽涉低結合親和力相互作用和/或一種或多種高分子量標記物或標記位點的復合物。信號擴增可通過將延伸的探針附接于含有多個標記物或檢測標記位點的結合復合物，由此對于每個檢測復合物擴增可檢測信號來實現(xiàn)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括將包含多個標記物或檢測標記位點的延伸探針附接于檢測復合物，并將該復合物錨定至表面以確保復合物保留在表面上。這種經改良的測定方法可用于檢測極低數(shù)目的結合事件，甚至單個的分析物-結合試劑復合物。該基礎辦法不限于免疫測定且可用于實施使用其他結合試劑類別的結合測定法?？捎糜诟倪M結合測定法的一種方法是使用表面結合的錨定試劑以將包含目的分析物的檢測復合物粘附至表面并穩(wěn)定化該檢測復合物。該辦法可用于克服形成檢測復合物的試劑之間的低結合親和力和/或預防復合物在隨后處理之前從表面解離。錨定試劑在結合測定法中的使用例示于圖1(a)。表面(101)包含結合分析物A的捕捉試劑(102)和錨定試劑(103)。在一個或多個步驟中，分析物結合捕捉試劑且檢測試劑(104)也結合分析物,，其中所述檢測試劑連接于核酸探針(105)。分析物可同時或基本同時地結合捕捉和檢測試劑，或分析物可以序貫結合捕捉和檢測試劑的每一種(以任一次序)。因此，在表面上形成復合物(106)，其包含捕捉試劑、分析物和檢測試劑。探針延伸以形成延伸序列(107)，其包含結合錨定試劑的錨定區(qū)域。延伸序列結合錨定試劑，并測量結合于表面的延伸序列的量。結合測定領域的熟練技術人員將容易地理解可用于所述方法的捕捉試劑和陪伴結合伴侶的范圍。這類對的非限制性例子包括(以任一次序)受體/配體對、抗體/抗原、天然或合成受體/配體對、半抗原/抗體對、抗原/抗體對、表位/抗體對、模擬位/抗體對、適體/靶分子對、雜交伴侶、和嵌入物/靶分子對。在一個實施方案中，結合測定法采用抗體或其他受體蛋白質作為目的分析物的捕捉和/或檢測試劑。術語“抗體”包括完整的抗體分子(包括通過抗體亞基的體外重聯(lián)合組裝的雜合抗體)、包含抗體的抗原結合域的抗體片段和重組蛋白質構建體(如記載于例如Porter,R.R.和Weir,R.C.J.CellPhysiol.,67(Suppl)；51-64(1966)和Hochman,1.Inbar,D.andGivol,D.Biochemistry12:1130(1973))、以及已經過化學修飾(例如通過引入可檢測的標記)的抗體構建體。類似地，錨定試劑和相應的錨定成員或區(qū)域可包含任何適宜的結合對，例如受體/配體對、抗體/抗原、天然或合成受體/配體對、半抗原/抗體對、抗原/抗體對、表位/抗體對、模擬位/抗體對、適體/靶分子對、雜交伴侶、和嵌入物/靶分子對，和使用通過靜電電荷結合的表面和錨定試劑。例如，錨定試劑可以是寡核苷酸序列、適體、適體配體、抗體、抗原、配體、受體、半抗原、表位、或模擬位，且相應的錨定區(qū)域分別包含互補的寡核苷酸序列、適體配體、適體、抗原、抗體、受體、配體、或抗體。在一個具體的實施方案中，錨定區(qū)域是寡核苷酸序列且錨定試劑包含DNA結合蛋白質?；蛘撸绻^定區(qū)域是雙鏈寡核苷酸序列，則錨定試劑可包含嵌入劑。在一個另外的實施方案中，錨定區(qū)域可包含一個或多個經修飾的寡核苷酸堿基且相應的錨定試劑包含結合錨定區(qū)域上經修飾的堿基的一個或多個模塊。例如，所述經修飾的堿基可包含半抗原或配體，而相應的錨定試劑包含分別特異于該半抗原或配體的一種或多種抗體或配體。而且，錨定區(qū)域可包含多個經標記的核苷酸堿基，其可用于檢測檢測復合物。在圖1(b)中繪出的一個具體的實施方案中，結合表面的錨定試劑包含用于將檢測復合物錨定至表面的寡核苷酸。錨定寡核苷酸序列結合附接于檢測復合物的互補性寡核苷酸序列。在該實施方案中，表面(108)包含結合分析物A的捕捉試劑(109)，和包含錨定寡核苷酸序列(111)的錨定試劑(110)。在一個或多個步驟中，分析物結合于捕捉試劑和也結合分析物的檢測試劑(112)，其中所述檢測試劑連接于核酸探針(113)。如上文對于圖1(a)描述的，分析物可以同時或基本同時地結合捕捉和檢測試劑，或分析物可以序貫結合捕捉和檢測試劑的每一種(以任一次序)。因此，在表面上形成復合物(114)，其包含結合試劑、分析物和檢測試劑。探針延伸以形成延伸序列(115)，其包含互補于錨定序列的錨定序列互補體。錨定序列雜交于錨定序列互補體，并測量結合于表面的延伸序列的量。所述檢測復合物可包含一種或多種檢測試劑，例如以增強測定對分析物的特異性。使用多種檢測試劑能增強測定的特異性，如果例如測定設計為當每種檢測試劑在分析物附近時發(fā)出可檢測信號，或者來自結合于分析物的單一檢測試劑的信號能與從結合于分析物的多種檢測試劑發(fā)出的信號區(qū)分的話。這類測定的一個實施方案顯示于圖1(c)。表面(116)包含結合分析物A的捕捉試劑(117)和包含錨定寡核苷酸序列(119)的錨定試劑(118)。在一個或多個步驟中，分析物結合于捕捉試劑和結合分析物的兩種(或更多種)檢測試劑的每一種(分別為120和121)，其中所述第一和第二檢測試劑的每一種連接于核酸探針(122和123，分別為第一和第二核酸探針)。分析物可以同時或基本同時，或以序貫、逐步的方式結合捕捉和檢測試劑。因此，在表面上形成復合物(124)，其包含捕捉試劑、分析物和一和第二檢測試劑。使用需要第一和第二探針彼此接近的延伸過程，第一探針延伸以形成延伸序列(125)，其包含互補于錨定序列的錨定序列互補體。在倒數(shù)第二步中，錨定序列雜交于錨定序列互補體，并測量結合于表面的延伸序列的量。圖1(c)中繪出的方法的一個具體的實施方案顯示于圖2(a)，其中錨定試劑用于將檢測復合物粘附于表面且附接于檢測復合物的探針延伸以生成結合錨定試劑的延伸區(qū)域。在該實施方案中，使用結合于近端探針的兩種檢測試劑檢測復合物。該方法還包括將檢測試劑與連接體序列聯(lián)合，其然后連接以形成環(huán)狀靶序列，并進行滾環(huán)擴增以生成結合錨定試劑的擴增子。表面(201)包含捕捉試劑(202)和錨定試劑(203)。在一個或多個步驟中，分析物結合于捕捉試劑，包含第一近端探針(205)的第一檢測試劑(204)，和包含第二近端探針(207)的第二檢測試劑(206)，由此在表面上形成檢測復合物(208)。使該檢測復合物與兩種連接體序列(209a和209b)接觸，其各自包含與所述第一近端探針的非重疊性區(qū)域互補的端序列和與所述第二近端探針的非重疊性區(qū)域互補的端序列。連接體序列與第一和第二近端探針雜交，且連接體寡核苷酸的端序列連接以形成環(huán)狀靶序列(210)，其與第一和第二近端探針兩者雜交。第二近端探針通過滾環(huán)雜交延伸以生成包含結合錨定試劑的結合試劑的擴增子，并測量結合于表面的擴增子的量。第一近端探針可以加帽或有其他修飾以防止第一探針的延伸。(在一個備選的實施方案中，第一近端探針延伸而第二近端探針可以加帽或有其他修飾以防止延伸)。在圖2(a)繪出的實施方案中，擴增子還包含兩個或更多個互補于經標記的檢測探針的檢測序列，所述檢測探針與擴增子雜交，用于測量結合于表面的擴增子的量。在一個備選的實施方案中(未在圖2(a)繪出)，延伸過程將經標記的核苷酸堿基摻入擴增子，其用于直接檢測表面上的擴增子而不用添加與擴增子互補的一種或多種經標記的探針。圖2(b)是連接體序列組成的示意圖，其顯示第一和第二連接體寡核苷酸(分別為209a和209b)，其中第一連接體的第一端(C1(E1))和第二連接體的第一端(C2(E1))互補于第一近端探針的兩個非重疊性區(qū)域，且第一連接體的第二端(C1(E2))和第二連接體的第二端(C2(E2))互補于第二近端探針的兩個非重疊性區(qū)域。所述第一和第二連接體與第一和第二近端探針雜交且第一和第二連接體連接以形成環(huán)狀靶序列，其與第一和第二近端探針兩者雜交。圖2(c)顯示了連接體的一個備選實施方案。連接體序列211包含互補于第二近端探針的內部序列(CIS)和互補于第一近端探針的非重疊性區(qū)域的兩個端序列(分別為CE1和CE2)。在該實施方案中，僅需要一個連接事件來形成環(huán)狀靶序列用于滾環(huán)擴增(即與第一近端探針雜交的端CE1和CE2的連接)，然而，由于引發(fā)/延伸來自第二近端探針，仍需要兩種近端探針接近。優(yōu)選地，第一近端探針加帽或有其他修飾以防止第一探針的延伸。其后，第二近端探針通過環(huán)狀靶序列的滾環(huán)擴增延伸以生成擴增子，其包含結合錨定試劑的結合區(qū)，并測量結合于表面的擴增子的量。第一和第二近端探針的序列可通過本領域技術人員已知的方法設計。例如，每種探針長度為約20-50個堿基，優(yōu)選長為25-40個堿基，最優(yōu)選長為約30-35個堿基。第一和第二近端探針還包含與如本文中描述的過程中使用的一種或多種連接體序列或其部分互補的序列。在一個實施方案中，使檢測復合物與兩種連接體序列(209a和209b)接觸，其各自包含互補于第一近端探針的非重疊性區(qū)域的端序列和互補于第二近端探針的非重疊性區(qū)域的端序列。因此，在該實施方案中，第一和第二近端探針各自包含互補于連接體的端序列的非重疊性區(qū)域?；蛘撸墒褂脙H一種連接體且該連接體序列(211)包含互補于第二近端探針的內部序列(CIS)和互補于第一近端探針的非重疊性區(qū)域的兩個端序列(分別為CE1和CE2)。因此，在該實施方案中，第一近端探針包含分別互補于連接體的兩個端序列CE1和CE2的非重疊性區(qū)域，而第二近端探針包含互補于連接體的內部序列(CIS)的序列。第一近端探針可以加帽或有其他修飾以防止第一探針的延伸。(在一個備選的實施方案中，第一近端探針延伸而第二近端探針可以加帽或有其他修飾以防止延伸。)因此，示于圖1-2圖1-2中例示的實施方案顯示可改良結合測定法以納入錨定試劑和/或可以擴增來自檢測復合物的信號。在一個優(yōu)選的實施方案中，在結合測定法中采用錨定試劑和信號擴增方法。在包括使用錨定試劑的實施方式中，存在于表面的錨定試劑的濃度為0.2-200ug/mL，特別是，1.0-50ug/mL，且更特別是3.0-10ug/mL?；蛘?，僅一種或另一種方法可以用于實現(xiàn)增強的結合測定。本發(fā)明因此包括具有如圖1-2中描述的信號擴增方法的測定法，省去了錨定試劑。在其中錨定試劑包含直接或間接結合于表面(例如經由結合反應)的錨定序列的那些實施方案中，可以采用本領域中建立的用于固定化寡核苷酸的方法來生成錨定試劑，包括共價和非共價附接方法。在一個實施方案中，所述錨定試劑包含連接或以其他方式結合于錨定序列的蛋白質。在該實施方案中，可以使用能固定化在表面上(共價或非共價)并通過錨定寡核苷酸修飾的任意蛋白質。非限制性例子包括鏈霉親合素、親合素或牛血清清蛋白(BSA)。在一個優(yōu)選的實施方案中，錨定試劑包含BSA。蛋白質可由錨定寡核苷酸修飾并使用已知的方法附接于表面，例如如圖3中例示的，使用磺基琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(Sulfo-SMCC)，一種確立的異雙功能交聯(lián)劑。SMCC的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)基團與牛血清清蛋白(BSA)的反應將BSA標記有硫醇反應性馬來酰亞胺基團。馬來酰亞胺基團相應地與硫醇修飾的寡核苷酸反應以形成BSA-寡核苷酸綴合物，其經由穩(wěn)定的硫醚鍵連接。在一個具體的例子中，通過將一系列BSA-寡核苷酸綴合物打印到石墨碳表面(優(yōu)選絲網印刷的碳墨電極(screenprintedcarboninkelectrode))上來形成陣列?；蛘?，如果蛋白質是親合素或鏈霉親合素，則錨定序列可連接于生物素并經由生物素-親合素或生物素-鏈霉親合素相互作用聯(lián)合至固定化的親合素或鏈霉親合素。附接于錨定試劑的錨定寡核苷酸可以是將與在延伸過程期間形成的延伸序列(或擴增子)雜交的任意序列。錨定寡核苷酸還可以包含非互補性區(qū)域(例如聚(A)序列)，其用作表面和互補性(雜交)區(qū)域之間的接頭序列以將互補性區(qū)域伸至離開表面。在一個實施方案中，雜交序列選擇為與結合近端或檢測探針無關的擴增子區(qū)域(“無活性”區(qū)域)。在一個更具體的實施方案中，單獨或與聚(A)臂(例如長度多達30個核苷酸)組合地納入互補于擴增子的全長無活性區(qū)域的雜交序列(優(yōu)選長度約25個核苷酸)。優(yōu)選地，錨定寡核苷酸選自：(i)(擴增子無活性區(qū)域的全長互補體，長度25個核苷酸)-(20個核苷酸聚(A)臂)；或(ii)(擴增子無活性區(qū)域一部分的互補體，長度15個核苷酸)-(30個核苷酸聚(A)臂)。在一個實施方案中，實施近端連接擴增(PLA)來延伸第二近端探針。如上文對圖2(a)-(c)描述的，使包含兩種近端探針的復合物與一種或多種連接體寡核苷酸(209a-209b或211)接觸，且雜交的連接體序列的連接形成環(huán)狀寡核苷酸，其然后用于通過環(huán)的滾環(huán)擴增(RCA)延伸第二近端探針。適宜的探針設計和近端連接擴增的擴增條件是本領域中確立的。本發(fā)明的一個獨特方面是在連接體之一中納入與錨定試劑中使用的相同序列。由此在第二近端探針的延伸期間，延伸的區(qū)域包含錨定序列的互補體，其與錨定試劑雜交，從而穩(wěn)定化夾心復合物和防止第二近端探針的解離。延伸的第二近端探針可含有可檢測的標記(例如通過在RCA延伸反應期間納入經標記的核苷酸)，可測量該標記來測定表面上分析物的量。或者，添加包含可檢測的標記的多種經標記的探針且與延伸的第二近端探針雜交，并測量結合于表面上的分析物的量?？梢允褂萌魏芜m宜的擴增技術來生成延伸序列(或擴增子)，包括但不限于，PCR(聚合酶鏈式反應)，LCR(連接酶鏈式反應)，SDA(鏈置換擴增)，3SR(自維持合成反應)，和等溫擴增方法，例如螺旋酶依賴性擴增和滾環(huán)擴增(RCA)。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用RCA因為其就靈敏性、多重性、動態(tài)范圍和可擴縮性而言具有顯著優(yōu)勢。RCA的技術是本領域中已知的(參見例如Baner等,NucleicAcidsResearch,26:50735078,1998；Lizardi等,NatureGenetics19:226,1998；Schweitzer等Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:10113119,2000；Faruqi等,BMCGenomics2:4,2000；Nallur等,Nucl.AcidsRes.29:e118,2001；Dean等GenomeRes.11:10951099,2001；Schweitzer等,NatureBiotech.20:359365,2002；U.S.Pat.Nos.6,054,274,6,291,187,6,323,009,6,344,329和6,368,801)。已知RCA的幾種不同的變型，包括線性RCA(LRCA)和指數(shù)性RCA(ERCA)。RCA生成數(shù)以千計的環(huán)狀模板的拷貝，拷貝的鏈附接于初始靶DNA，從而允許靶物的空間分辨和信號的快速擴增。RCA促進(i)單一靶分子的檢測；(ii)來自蛋白質以及DNA和RNA的信號的擴增；(iii)鑒定已擴增的分子在固體表面上的位置；(iv)同時測量許多不同的靶物；和(v)分析溶液中或固相中的一種或多種靶物。在基于陣列或顆粒的形式中進行多重結合測定法時，RCA產物與檢測復合物的空間定位是尤為有利的。本發(fā)明的一個具體實施方案描述在圖4(a)中，其中使用錨定試劑和信號擴增過程兩者。在表面(401)上形成捕獲試劑(402)、分析物(403)和兩種檢測試劑(304和305)之間的復合物，每種檢測試劑分別包括第一和第二近端探針(406和407)。分別添加圖4(a)中第一和第二連接子寡核苷酸Circ-1(408)和Circ-2(409)，當兩種近端探針均存在于復合物中時，每個雜交并橋連兩個近端探針。結合的連接子探針分別在連接位點1和2(410和411)處連接以形成環(huán)形DNA模板(412)。通過滾環(huán)擴增來擴增環(huán)形DNA模板以延伸第二近端探針，從而產生包含一個或多個檢測序列(413)和錨定寡核苷酸序列互補體(414)的擴增子(包括部分錨定序列互補體(415))。錨定寡核苷酸序列(416)(附接于捕獲部分(417))和其互補體雜交，多個檢測探針與多個檢測探針序列雜交，并且測量結合到表面的分析物的量(未顯示，但例示于圖1(a))。圖4(b)顯示了第一環(huán)形DNA模板Circ-1(408)(其設計為與第一近端探針(PP1)雜交)、檢測寡核苷酸序列、擴增子的無活性區(qū)域(其可全部或部分使用以結合錨定寡核苷酸序列)和部分PP2(其設計為與第二近端探針雜交)。另外的實施方案如圖4(c)所示，其中通過滾環(huán)擴增來擴增環(huán)形DNA模板以產生包含多個檢測序列(分別為418和419)的擴增子。在進一步實施方案中，附接于捕獲部分417的錨定寡核苷酸序列(416)可以作為具有游離3'末端的引物。在該實施方案中，第二近端探針包括與檢測序列(413)互補的序列。在一個實施方案中，本文所述的測定形式利用與檢測序列的5'末端偶聯(lián)的檢測試劑，其中3'端暴露以促進與連接子探針的連接以形成環(huán)形DNA模板，其然后通過滾環(huán)擴增以延伸第二近端探針(PP2)。在該實施方案中，PP1潛在地獨立地可用于通過聚合酶的延伸，但是這個問題可以通過添加修飾的堿基以防止聚合酶引發(fā)(priming)來解決。或者，連接模板PP1可以通過其3'末端直接偶聯(lián)到檢測試劑，防止該寡核苷酸作為DNA聚合酶的引物參與，即使它被降解。生成通過RCA或任何適宜的擴增方法擴增的靶序列的另一種辦法例示于圖5中。在該實施方案中，每種近端探針能折疊成環(huán)狀發(fā)夾結構。這些發(fā)夾結構的形成生成單鏈環(huán)和雙鏈部分，其含有重組信號。添加重組酶以驅動兩個發(fā)夾結構的重組從而形成環(huán)狀DNA模板，其隨后進行如上文描述的RCA。標記擴增子且任選地錨定于錨定試劑，并檢測分析物。該實施方案的關鍵要素是重組酶催化含有序列特異性重組位點的DNA的位點特異性重組的能力。例如，來自噬菌體P1的Cre重組酶在含有l(wèi)oxP位點的位點處催化重組，且其他非限制性例子包括但不限于翻轉酶(Flippase)(flp，來自Yeast)，Hin(Salmonella)和Tre，Cre的工程化(進化)型式。這種備選的辦法不需要添加另外的組分如寡核苷酸模板、ATP和dNTP。在該實施方案中，loxP(重組)位點優(yōu)選修飾為非對稱的，從而產生朝向期望的重組產物形成的正常平衡中的遷移。這在圖5中例示，重組位點具有淺/深色陰影。而且，圖6(a)又例示了另一種生成靶序列的方法，其通過RCA或任何適宜的擴增方法擴增。附接于檢測試劑的每種近端探針包含loxP位點，其使得兩個寡核苷酸之間通過Cre重組酶能進行位點特異性重組，導致新寡核苷酸序列的形成，該新寡核苷酸序列包含側接loxP位點的一種近端探針的5’部分和另一種近端探針的3’部分。新創(chuàng)建的靶序列隨后可通過任何適宜的方法擴增、標記、任選地錨定和如上文描述的檢測。圖6(a)例示了該實施方案，使用T7RNA聚合酶啟動子作為用于擴增的可操作元件。還應理解其他RNA聚合酶位點如在近端探針的3或5’部分的任一處連接的T3和SP6也同樣適用于該方法。在該實施方案中，loxP(重組)位點優(yōu)選修飾為非對稱的，從而產生朝向期望的重組產物形成的正常平衡中的遷移。如圖6(b)中顯示的，該方法還可用于生成可在RCA中使用的環(huán)狀DNA模板。本發(fā)明包括用于檢測分析物的方法，包括使分析物結合表面上的捕捉試劑和兩種檢測試劑以形成檢測復合物。該方法包括測量檢測復合物，其中相對于僅包含兩種檢測試劑之一的復合物，測量方法優(yōu)先測量包含兩種檢測試劑的復合物。在一個實施方案中，該方法包括形成復合物，然后交聯(lián)檢測試劑并檢測交聯(lián)的試劑?？梢允褂萌魏芜m宜的交聯(lián)化學來連接檢測復合物的組分。例如，第一和第二檢測試劑可以包含反應模塊，其通過添加連接反應模塊的多功能交聯(lián)劑反應和連接。在該實施方案中，反應模塊和交聯(lián)劑可包含胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺(iodoacetamide)、馬來酰亞胺、點擊化學試劑及其組合。在另一個實施方案中，第一和第二檢測試劑可以包含結合模塊且交聯(lián)劑是該結合模塊的多價結合伴侶。該實施方案的幾個非限制性例子包括：(a)第一和第二檢測試劑是動物物種的抗體且交聯(lián)劑是靶向該動物物種抗體的多價抗物種抗體；(b)第一和第二檢測試劑包含生物素且交聯(lián)劑是鏈霉親合素(或反之)；(c)第一和第二檢測試劑連接于鏈霉親合素且交聯(lián)劑是包含多個生物素分子的聚合物(或反之)；或(d)第一和第二檢測試劑分別包含第一和第二核酸探針且交聯(lián)劑是寡核苷酸，其包含互補于第一核酸探針的序列和互補于第二核酸探針的另一個序列。在一個具體的實施方案中，可通過使分析物結合固定化的捕捉試劑、第一檢測試劑和第二檢測試劑以形成復合物來檢測樣品中的目的分析物，其中所述第一檢測試劑包含第一可檢測的標記和第一核酸探針，和第二檢測試劑包含第二可檢測的標記和第二核酸探針。在該實施方案中，第一和第二檢測試劑通過以下交聯(lián)：(i)將第一探針雜交于第二探針，(ii)將第一和第二探針雜交于具有互補于第一和第二探針的區(qū)域的第三核酸，或(iii)連接第一和第二探針。一旦交聯(lián)的產物結合表面就可檢測該產物，或任選地，交聯(lián)的產物可從表面釋放到洗脫物中并檢測。在此方面，僅計算洗脫物中包含第一和第二可檢測的標記兩者的那些各個交聯(lián)的產物?？梢圆捎萌魏芜m宜的檢測方法來檢測洗脫物中標記物的存在。在一個優(yōu)選的實施方案中，標記物是熒光分子且通過單分子熒光檢測，例如熒光相關光譜和/或熒光交互相關光譜，來計算存在于洗脫物中的經標記的交聯(lián)產物。在該實施方案中，單分子熒光檢測包括使洗脫物流經毛細管，將光源聚焦在毛細管內的某體積上以創(chuàng)建探詢帶(interrogationzone)，并用光檢測器觀察探詢帶以檢測熒光分子經由探詢帶的通過。該檢測方法可進一步包括檢測與第一標記物有關的第一熒光信號和與第二標記物有關的第二熒光信號，并且當從探詢帶檢測出兩種信號時對檢測事件計數(shù)。或者，一種標記物是熒光共振能量轉移(FRET)供體而另一種標記物是FRET接受體，且檢測方法可進一步包括激發(fā)探詢帶中的FRET供體并檢測來自FRET接受體的熒光信號。在一個具體的實施方案中，可通過使分析物結合固定化的捕捉試劑、第一檢測試劑和第二檢測試劑以形成復合物來檢測樣品中的分析物，其中所述第一檢測試劑包含第一核酸探針，第二檢測試劑包含第二核酸探針；延伸第二核酸探針以形成包含可檢測的標記的延伸序列，所述延伸依賴于第一和第二核酸探針在復合物中的共定位；從表面釋放延伸序列至洗脫物中；并計算洗脫物中的各個延伸序列。延伸步驟可包括使探針結合模板核酸序列并通過聚合酶鏈式反應延伸探針?；蛘?，延伸步驟包括使第一探針結合模板核酸序列，形成環(huán)狀核酸模板，并通過滾環(huán)擴增延伸該環(huán)狀模板。延伸步驟還可以包括使第一探針結合模板核酸序列，使第二探針結合該模板序列，并連接第一和第二探針。在采用捕捉試劑的本發(fā)明的方法中，捕捉試劑可以直接固定化于固相上或它們可以經由次級結合試劑如下文描述的靶向性試劑間接固定化。例如，捕捉試劑可以連接于或包含靶向性試劑，其結合固相上固定化的靶向性試劑互補體。靶向性試劑對其互補體的結合可以是直接的(例如，靶向性試劑可為鏈霉親合素而互補體可為生物素)，或者是經由橋接試劑為間接的(例如靶向性試劑和互補體可為生物素，而橋接試劑可以是多價生物素結合受體如鏈霉親合素)。在一個實施方案中，靶向性試劑及其互補體包括第一寡核苷酸和互補性寡核苷酸、受體-配體對、抗原-抗體對、半抗原-抗體對、表位-抗體對、模擬位-抗體對、適體-靶分子對、雜交配偶、或嵌入劑-靶分子對。測定中使用的靶向性試劑和互補體選擇為使得與通過測定測量的一種分析物的捕捉或檢測試劑聯(lián)合的靶向性試劑和互補體與通過測定測量的其他分析物的捕捉或檢測試劑聯(lián)合的靶向性試劑和互補體基本是非交叉反應性的。例如，結合試劑對其聯(lián)合的結合域的結合(經由其聯(lián)合的靶向性試劑和靶向性試劑互補體)應實質性大于其對與其他分析物聯(lián)合的結合域(且呈現(xiàn)不同的靶向性試劑互補體)的結合。優(yōu)選地，一種分析物的捕捉或檢測試劑對與其他分析物有關的結合域的結合相對于對正確結合域的結合的交叉反應性為<1％，更優(yōu)選<0.1％且更優(yōu)選<0.01％。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶向性試劑/靶向性試劑互補體包含包括互補性序列的一對寡核苷酸且靶向性試劑及其互補體在足以使靶向性試劑雜交于其互補體的條件下接觸。當使用靶向性試劑時，就何時將測定法中使用的捕捉試劑固定化于固相上而言有一定靈活性。在一個實施方案中，對使用者提供經由靶向性試劑–靶向性試劑互補體相互作用預固定化于固相上的捕捉試劑。在另一個實施方案中，以分開的組分提供連接于靶向性試劑的捕捉試劑和支持固定化的靶向性試劑互補體的固相。因此，測定方法進一步包括通過使靶向性試劑結合其互補體(直接或經由橋接劑的使用)將捕捉試劑固定化于固相上的步驟。該步驟與形成檢測復合物有關的步驟可在前、同時或在后實施。在一個具體實施方案中，多功能靶向劑可用于本文所述的測定方法和組分中。多功能靶向劑可以包括(a)設計成通過第一區(qū)段互補體與捕獲試劑結合的第一區(qū)段(即，捕獲試劑包括靶向劑互補體，該互補體與多功能靶向劑的第一區(qū)段互補)，和(b)設計成結合擴增子的第二區(qū)段(即，多功能靶向劑的第二區(qū)段，其用作表面上的錨定試劑)。因此，在該實施方案中，表面包括多功能靶向劑，其與通過第一區(qū)段和第一區(qū)段互補體之間的連接結合到靶向劑的捕獲試劑接觸。3-ABRCA/PLA測定如本文所述進行，并且在測量步驟之前擴增子結合多功能靶向劑的錨定區(qū)段。該方法可用于確保在測定方法中使用1:1比例的捕獲劑與錨定試劑。很多種表面適用于本發(fā)明的方法，包括結合測定領域中的常規(guī)表面。表面可從多種不同材料制備，包括聚合物(例如聚苯乙烯和聚丙烯)、陶瓷、玻璃、復合材料(例如碳聚合物復合材料如基于碳的墨)。合適的表面包括肉眼可見(macroscopic)物體的表面如測定容器(例如試管、小池、流動池、FACS細胞分選器、筒(cartridge)、多孔板中的孔等)的內部表面，載玻片，測定芯片(如在基因或蛋白質芯片測量中使用的那些)、針(pin)或探針、珠、過濾介質、側向流動介質(例如側向流動測試條中使用的過濾膜)等。適宜的表面還包括通常用于基于顆粒的其他類型測定法中的顆粒(包括但不限于膠體或珠)，例如磁性、聚丙烯和膠乳顆粒，通常用于固相合成中的材料例如聚苯乙烯和聚丙烯酰胺顆粒，和通常用于層析應用中的材料例如硅土、鋁、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯。材料還可以是纖維如碳纖絲。微顆粒可以是無生命的或者，可以包含有生命的生物實體如細胞、病毒、細菌等。用于所述方法的顆?？捎蛇m用于附接一種或多種捕捉或檢測試劑的任意材料構成，且其可經由例如離心、重力、過濾或磁性收集來收集?？筛浇佑诓蹲交驒z測試劑的很多種不同類型的顆粒是商品化的以用于結合測定法中。這些包括非磁性顆粒以及包含可磁化材料的顆粒，其允許用磁場收集顆粒。在一個實施方案中，顆粒由電導性和/或半導體材料構成，例如膠體金顆粒。微顆?？梢跃哂泻芏喾N大小和形狀。例如且不限于，微顆?？梢詾?納米至100納米。優(yōu)選地，微顆粒具有20nm至10微米的材料。顆?？梢允乔蛐?、長方形、桿狀等，或者其可以是形狀不規(guī)則的。用于所述方法的顆?？梢允菐Ь幋a的，以允許在顆?；旌衔镏需b定特定顆?；蝾w粒子群體。這類編碼顆粒的使用已被用于實現(xiàn)采用顆粒作為固相支持物進行結合測定的測定法的多重化(multiplexing)。在一個辦法中，制造顆粒以納入一種或多種熒光染料并基于在一個或多個波長處熒光發(fā)射的強度和/或相對強度來鑒定特定的顆粒群體。該辦法已用在LuminexxMAP系統(tǒng)(參見例如美國專利No.6,939,720)和BectonDickinsonCytometricBeadArray系統(tǒng)中。或者，顆?？山浻善渌锢硖匦匀绱笮　⑿螤?、包埋的光學模式等中的差異編碼。通過顆粒光學特性、大小、形狀、包埋的光學模式等，可以編碼混合物或顆粒集合中提供的一種或多種顆粒以與混合物中的其他顆粒區(qū)分。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的方法可用在多重形式中，其通過使多種不同的分析物結合多種針對那些分析物的捕捉試劑，捕捉分析物固定化于編碼的珠上，從而使得該編碼鑒定特定珠的捕捉試劑(和分析物靶物)。該方法進一步包括對具有結合的分析物的珠的數(shù)目計數(shù)(使用本文中描述的檢測辦法)?；蛘?另外，檢測復合物和/或捕捉試劑可以直接或間接結合一種或多種固相上的不同的離散的結合域，例如如在結合陣列中，其中所述結合域是各個陣列元件，或者在一組珠中，其中所述結合域是各個珠，從而使得在每個結合域上生成并從其測量離散的測定信號。如果針對不同分析物的捕捉試劑固定化于不同的結合域中，則可以獨立測量結合那些域的不同分析物。在這類實施方案的一個例子中，通過在一種或多種表面上固定化結合目的分析物的捕捉試劑的離散域來制備結合域。任選地，所述一種或多種表面可以部分限定保持樣品或樣品經由其通過的容器(例如流動池、孔、小池等)的一個或多個邊界。在一個優(yōu)選的實施方案中，在電極上形成各個結合域用于電化學或電化學發(fā)光測定法中。使用電化學發(fā)光在包含多個結合域的表面上對分析物的多重測量已用在MesoScaleDiagnostics,LLC,MULTI-和Imager產品線(參見例如美國專利Nos.7,842,246和6,977,722，其公開內容通過提述完整并入本文)。更進一步地，檢測復合物和/或捕捉試劑可直接或間接結合于電極表面，其任選地包含如上文描述的不同的離散的結合域。電極表面可以是多孔壁和/或流動池的組分。電極可包含電導材料，例如金屬如金、銀、鉑、鎳、鋼、銥、銅、鋁、允許導電物(conductiveallow)，等等。它們還可以包含涂布氧化物的金屬，例如氧化鋁涂布的鋁。電極可包括工作電極和對應電極，其可從相同或不同材料制備，例如金屬對應電極和碳工作電極。在一個具體的實施方案中，電極包含基于碳的材料如碳、碳黑、石墨碳、碳納米管、碳纖絲、石墨、石墨烯、碳纖維和其混合物。在一個實施方案中，電極包含元素碳，例如石墨、碳黑、碳納米管等。有利的是，它們可以包含導電性碳聚合物復合材料、分散在基質中的導電顆粒(例如碳墨、碳膠、金屬墨、石墨烯墨(grapheneink))，和/或導電性聚合物。本發(fā)明的一個具體的實施方案是測定模塊，優(yōu)選為多孔板，其具有包含碳的電極(例如工作和/或對應電極)，例如碳層和/或絲網印刷的碳墨層。本發(fā)明包括用于檢測和計算各個檢測復合物的方法。在一個具體的實施方案中，表面可包含針對存在于樣品中的一種或多種分析物的多種捕捉試劑，且多種捕捉試劑分布跨越在位于表面上的多個可解析的結合區(qū)域中。在用于實施和分析測量的條件下，“可解析的結合區(qū)域”是與單個結合事件有關的最小表面區(qū)域，其能夠被解析和與發(fā)生另外的單個結合事件的另一區(qū)域區(qū)分開來。因此，所述方法包括使一種或多種分析物分子與表面上的一種或多種捕捉試劑結合，測定分析物分子在表面上的多個可解析結合區(qū)域中的存在或缺乏，并鑒定含有分析物分子的可解析結合區(qū)域的數(shù)目和/或不含分析物分子的分析物域的數(shù)目。可解析結合區(qū)域可以全部或部分地進行光學探詢，即每個可解析結合區(qū)域可分別地光學探詢和/或包含多個可解析結合區(qū)域的整個表面可以成像且可將該圖像內的一個或多個像素或像素分組圖譜定位(mapped)到各個可解析結合區(qū)域?？山馕鼋Y合區(qū)域還可以是多個微顆粒內的微顆粒?？梢酝ㄟ^常規(guī)的光學檢測系統(tǒng)來鑒定在其光學簽名(signature)中顯示變化的可解析結合區(qū)域。根據(jù)檢測的種類(例如熒光實體的類型等)和操作波長，可以采用設計用于特定波長的光纖來進行可解析結合區(qū)域的光學探詢。在其中使用光學探詢的實施方案中，系統(tǒng)可包含超過一種光源和/或多種光纖以調整波長和/或光源的強度。在一些實施方案中，使用CCD照相機捕捉來自多個可解析結合區(qū)域的光信號。可用于捕捉圖像的照相機成像系統(tǒng)的其他非限制性例子包括，電荷注入器件(CID)、互補金屬氧化物半導體(CMOS)器件、科學CMOS(sCMOS)器件和延時探詢(timedelayintegration)(TDI)器件，如本領域普通技術人員已知的。在一些實施方案中，可將與光電二極管或光電倍增管(PMT)偶聯(lián)的掃描鏡像系統(tǒng)用于成像。所述方法的測量步驟可包括對來自表面(或其部分)的光信號成像以生成由多個像素組成的圖像，其中每個可解析結合區(qū)域圖譜定位至圖像中的一個或多個像素或像素組?？梢允褂帽绢I域認可的方法完成圖像分析以鑒定具有指示結合事件(檢測復合物)的信號的像素或像素集合，所述方法例如存在的大量圖像分析算法和軟件以鑒定和計算熒光顯微鏡圖像中經標記的生物結構。在一個實施方案中，在過濾圖像以除去大規(guī)模信號梯度后，使用分割閾值將圖像轉化為二進制圖像。通過鑒定具有高于閾值強度的連續(xù)區(qū)域來發(fā)現(xiàn)可解析結合區(qū)域。如果結合域滿足大小和強度要求，則將其歸類為結合事件。在一個實施方案中，可解析結合區(qū)域是陣列的元件。在一個優(yōu)選的實施方案中，陣列是微孔或納米孔的陣列，例如具有單一基底的各個凹坑或孔(individualdepressionsorwellsofaunitarysubstrate)。優(yōu)選地，孔的體積低于100nL，優(yōu)選低于50nL。在一個實施方案中，孔體積的范圍為約10aL–100pL。任選地，孔可以配置為存放微顆粒。在一個實施方案中，位于基底上且在測定期間尋址的可解析結合區(qū)域的至少50％含有0或1個分析物分子。優(yōu)選地，至少80％，更優(yōu)選至少95％，且最優(yōu)選至少99％的可解析結合區(qū)域含有0或更多分析物分子。樣品中分析物分子的濃度至少部分使用校正曲線測定，泊松分布分析和/或高斯分布分析含有至少0或1個分析物分子的結合區(qū)域的數(shù)目。在一個具體的實施方案中，表面包含多個顆粒，其各自包含針對分析物分子的多種捕捉試劑，且多種顆粒分布跨越在多個可解析結合區(qū)域(例如微孔或納米孔的陣列)。因此，所述方法包括：(i)使一種或多種分析物分子與表面上的一種或多種捕捉試劑結合，(ii)將多種顆粒分布跨越在可解析結合區(qū)域的陣列上；和(iii)測定每個可解析結合區(qū)域中分析物分子的存在或缺乏，從而鑒定含有分析物分子的結合域的數(shù)目和/或不含有分析物分子的結合域的數(shù)目。使用本發(fā)明的一種或多種方法檢測在受限體積中的分析物也可以是有利的。在這些實施方案中，樣品中的分析物分子結合一對檢測試劑，其各自攜帶可區(qū)分的標記物，且分析物在基底(例如板、皿、芯片、光纖，網格等)上的多個位置，例如孔或反應容器(本文中稱為“反應容器”)上劃分開，從而大多數(shù)反應容器含有一個或更少的分析物。該方法允許使用者通過對含有附接于分析物的每種可區(qū)分標記物的反應容器的數(shù)目計數(shù)來檢測分析物分子。在一些情況中，尋址(address)的多個反應容器是可能含有至少1個分析物分子(比如與至少一個分析物分子聯(lián)合或不與任何分析物分子聯(lián)合)的反應容器總量的一部分或基本全部。提及以下公布的美國專利申請：美國專利申請No.20070259448；美國專利申請No.20070259385；美國專利申請No.20070259381；和國際專利申請No.PCT/US07/019184；和國際專利申請No.PCT/US09/005428。通過提述將這些公布內容的每一個并入本文。至少一部分的反應容器可以尋址且可以進行指示含有至少一個分析物分子或顆粒的反應容器的數(shù)目/百分比的測量。在一些情況中，基于數(shù)目/百分比，可以測定流體樣品中分析物分子濃度的量度。在實現(xiàn)受限體積中分析物分子檢測的一個具體的實施方案，可通過使分析物結合第一和第二檢測試劑以形成檢測復合物來檢測樣品中的分析物。每種檢測復合物包含分析物、第一檢測試劑和第二檢測試劑，且第一檢測試劑和第二檢測試劑分別具有第一和第二可檢測的標記。檢測復合物可以同時、基本同時或序貫形成。檢測復合物跨多個反應容器劃分從而使得多數(shù)反應容器含有一個或更少的檢測復合物，且通過計算含有第一和第二可檢測的標記的每種的反應容器的數(shù)目來檢測分析物分子的數(shù)目。優(yōu)選地，檢測復合物跨多個反應容器劃分，從而使得在同一容器中檢測未結合的第一檢測試劑和未結合的第二檢測試劑的可能性低于約十分之一，優(yōu)選低于約百分之一，更優(yōu)選低于約千分之一，且最優(yōu)選低于約萬分之一。檢測復合物跨多個反應容器劃分，即分成或分到部分中，例如通過在多個反應容器中等分檢測復合物的部分手動分開，和/或通過使包含檢測復合物的溶液流過多個反應容器，從而使得檢測復合物分到支持物上的各反應容器中。在一個別的實施方案中，可通過以下檢測樣品中的分析物：(a)使分析物結合表面結合的捕捉試劑和第一和第二檢測試劑以形成檢測復合物，其中(i)每種檢測復合物包含捕捉試劑、分析物、第一檢測試劑和第二檢測試劑，和(ii)第一檢測試劑具有第一可檢測的標記物且第二檢測試劑具有第二可檢測的標記物。檢測復合物可通過以任意次序添加組分形成，例如通過同時或基本同時使組分接近到一起，或序貫添加每種組分以逐步方式建立檢測復合物。檢測復合物跨多個反應容器劃分，從而使得多數(shù)反應容器含有一個或更少的分析物，且通過對含有第一和第二可檢測的標記物的反應容器的數(shù)目計數(shù)來檢測分析物分子的數(shù)目。該方法可在每個步驟后和檢測步驟之前有或無清洗的情況下進行。表面可以是顆粒和任選地，多種捕捉試劑固定化于顆?；蚨鄠€顆粒上。在該實施方案中，劃分步驟可以多種方式進行：(i)捕捉試劑固定化于多個顆粒上且通過使分析物結合捕捉試劑和將顆粒劃分到多個反應容器中來實現(xiàn)分析物的劃分；或(ii)捕捉試劑固定化于多個顆粒上且通過將顆粒劃分到多個反應容器中然后使分析物結合捕捉試劑來實現(xiàn)分析物的劃分。多個反應容器還可以包含分散在油包水乳液中的水滴。乳液可制備為具有直徑高達100um和體積近1nL的液滴。高負載，即乳液中超過1010個液滴，制備乳液的容易性和其在大范圍條件下的高穩(wěn)定性使得其成為區(qū)室化生物化學測定法的理想手段。每個水滴充當獨立的反應容器且任選地附接于顆粒的檢測復合物可以跨多個水滴劃分?；蛘?，例如如果反應容器是板的孔的話，表面位于反應容器之一中，然后表面可以是板孔之一內的域或區(qū)域。在該實施方案中，捕捉試劑可固定化于多個反應容器的域或區(qū)域上，且劃分步驟通過使分析物分子結合捕捉試劑實現(xiàn)。在另一個實施方案中，多個反應容器包含對其固定化有靶向性模塊的區(qū)域，捕捉試劑包含靶向性模塊互補體，且劃分步驟通過使靶向性模塊互補體結合位于多個反應容器中的靶向模塊來實現(xiàn)。在一個另外的或替代的實施方案中，本文中描述的結合測定法還可以包含預濃縮步驟以改進測定性能，例如通過增加樣品中分析物的濃度和/或通過降低可能存在于樣品中的可能阻礙測定性能的無關材料的濃度。這可以通過(a)使包含目的分析物的樣品與連接于結合分析物的第一結合試劑的顆粒接觸，由此形成包含結合于所述第一結合試劑的分析物的復合物；(b)收集該復合物；(c)將樣品未結合組分從復合物分開；(d)釋放該復合物來完成。這種預濃縮方法可在本文中描述的結合測定法之前進行以除去可能阻礙測定性能的雜質。在此方面，提述美國申請公開No.US2010/0261292，其公開內容通過提述并入本文。具體地，濃縮步驟包括使包含分析物的樣品經受足以形成分析物復合物的條件，所述分析物復合物包括結合至第一檢測試劑的分析物，其中第一檢測試劑連接至第一核酸探針。然后，將在濃縮步驟結束時形成的分析物復合物結合到(i)表面上的捕獲試劑，所述表面包含用于分析物的捕獲試劑，和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；和(ii)與第二核酸探針連接的用于分析物的第二檢測試劑；從而在表面上形成包含捕獲試劑、分析物以及第一和第二檢測試劑的復合物。使表面結合的復合物進行需要第一和第二探針接近的延伸過程，延伸第二探針以形成包含與錨定序列互補的錨定序列互補體的延伸序列。在一個具體的實施方案中，濃縮步驟進一步包括：(i)將包含所述分析物的樣品與連接至靶向劑的固相接觸，所述靶向劑與第一核酸探針的至少一部分互補，從而形成濃縮復合物，所述濃縮復合物包含通過第一核酸探針和靶向劑間的結合反應結合到固相的分析物。(ii)收集所述濃縮復合物；(iii)從所述濃縮復合物中分離樣品的未結合的組分；和(iv)釋放濃縮復合物以將固相與分析物分離以形成分析物復合物。如本文所使用的，收集是指混合物中材料的物理定位。收集包括通過結合反應或吸附的材料的定位。例如，可以通過將材料吸附在固相上或通過將材料與固相上的結合試劑結合，在固相上收集混合物中的材料。然而，收集不限于定位在固相上，并且還可以包括本領域中用于將材料定位在較大流體體積內的位置/體積處的技術，例如通過使用光學鑷子(opticaltweezers)(其使用光來操縱小至單個原子的微觀對象，其中來自聚焦激光束的輻射壓力能夠捕獲小顆粒)、電場或磁場、聚集流(focusedflow)、密度梯度離心等來定位材料。本發(fā)明的某些實施方案包括收集微?；蚪Y合到微粒的材料。合適的收集方法包括實現(xiàn)從懸浮液中定位微粒的基于微粒的測定的領域中已知的許多方法。這些方法包括在重力下或通過離心沉淀，在過濾器或多孔膜上過濾、通過施加磁場定位(可磁化顆粒)、將顆粒結合或吸附到宏觀固相、使用光學鑷子等。如本文所用，釋放是指先前收集的材料的去定位(delocalization)。通過化學鍵或通過特異性或非特異性結合相互作用保持在定位位置的材料可以允許通過破壞鍵或相互作用而去定位，使得材料可擴散或混合到周圍介質中。存在許多成熟的可裂解化學連接子，其可以用于提供可以在不需要苛刻條件的情況下裂解的共價鍵。例如，可以使用硫醇或其它還原劑裂解含二硫鍵的連接子，可以使用高碘酸鹽裂解包含順-二醇的連接子，可以通過改變pH或引入競爭性配體來裂解金屬-配體相互作用(例如鎳-組氨酸)。類似地，存在可以使用的許多成熟的可逆結合對(包括已經在親和層析領域中鑒定的那些)。舉例來說，許多抗體-配體對的結合可以通過pH的變化、添加蛋白質變性劑或離液劑、添加競爭性配體等來逆轉。其他合適的可逆結合對包括互補核酸序列，其雜交可以在多種條件下逆轉，包括改變pH、降低鹽濃度、增加溫度至高于所述對(pair)的解鏈溫度和/或添加核酸變性劑(例如甲酰胺)。此類可逆結合對可以用作靶向劑(如上所述)，例如，可以將第一靶向劑連接到結合分析物的第一結合試劑，第二靶向劑可以連接到固相，且第一和第二靶向劑的結合相互作用可以用于將第一結合試劑可逆地固定化在固相上。釋放還包括通過例如混合、震蕩、渦旋、對流流體流動、通過施加磁力、電力或光學力混合等的材料的物理去定位。在已經收集微?；蚪Y合到微粒的材料的情況下，可以使用此類物理方法將顆粒重懸在周圍基質中。釋放可以簡單地與先前收集步驟(例如，通過上述任何機制)相反，或者收集和釋放可以通過兩種不同的機制進行。在一個此類實例中，結合到顆粒的材料(例如分析物或包含分析物的復合物)的收集可以通過顆粒的物理收集來實現(xiàn)。然后通過切割鍵或逆轉將材料保持顆粒上的結合反應來釋放材料。在第二個此類實例中，通過與連接到表面的結合試劑的結合相互作用，將材料(例如包含分析物的復合物的分析物)收集在表面上。然后通過破壞鍵或將結合試劑連接至表面的第二結合相互作用釋放材料。收集接著釋放可被用于濃縮和/或純化樣品中的分析物。通過在第一體積中收集并釋放到第二較小體積中，可以濃縮樣品中的分析物。通過濃縮，通常可以顯著提高后續(xù)測量步驟的靈敏度。通過從樣品中收集并除去一些或全部未收集的樣品，可以減少或消除樣品中的潛在測定干擾物。任選地，未結合的樣品的除去可以包括用液體試劑洗滌并將材料釋放到限定的液體試劑種(例如，測定或洗滌緩沖液)，以便為隨后的測定步驟提供均勻的基質。如US2010/0261292的圖3(a)中所示，其通過引用并入本文，該方法包括將包含靶分析物的樣品與連接到第一結合試劑的顆粒接觸，所述第一結合試劑結合靶分析物，其中所述第一結合試劑連接到第一靶向劑，且所述顆粒連接到第二靶向劑，且第一結合試劑和顆粒通過所述第一和第二靶向劑之間的結合反應連接以形成包含結合到所述第一結合試劑的靶分析物的復合物。然后收集復合物，并將從復合物分離樣品中的未結合組分。釋放復合物，并將釋放的復合物與結合到固相的第二結合試劑接觸，其中第二結合試劑結合復合物。該具體的實施方案如圖16所示。修飾顆粒(1601)以包括捕獲寡核苷酸序列，1602，其與近端探針的序列，1603，至少部分互補，其結合到檢測抗體1604。所述顆粒與近端探針混合以將捕獲序列與探針序列雜交以形成復合物，1605。然后復合物與包含分析物，1606，且任選地，一種或多種污染物，1607-1608的樣品混合。將分析物結合到檢測抗體(1609)并去除污染物(1610)。在合適的條件下從包括結合的分析物的復合物中除去顆粒，以形成與近端探針(1611)結合的濃縮的分析物溶液，其可如本文所述在免疫測定中使用，其中另外的近端探針結合到分析物，并將3-抗體復合物進行RCA-PLA以檢測樣品中分析物的存在(1612)，例如，如圖2(a)和所附說明所述。在另一個實施方案中，檢測抗體和分析物之間的免疫測定復合物在溶液中形成，之后擴增，且然后擴增產物通過捕獲試劑和/或錨定物粘附在顆粒上。任選地，可以過濾擴增的產物和然后通過捕獲試劑和/或錨定物將其捕獲在顆粒上。這一方法示于圖17中。將分析物，A(1701)結合到檢測抗體(分別為1702和1703)，其每一個結合到近端探針(分別為1704和1705)和形成包含結合到每個檢測抗體的分析物的檢測復合物(1706)。將所述檢測復合物與兩個連接子序列(1707a和1707b)接觸，所述連接子序列的每一個包括與第一近端探針的非重疊區(qū)互補的末端序列以及與第二近端探針的非重疊區(qū)互補的末端序列。將所述連接子序列與第一和第二近端探針雜交，并連接(ligate)連接子寡核苷酸的末端序列以形成與第一和第二近端探針兩者雜交的環(huán)形靶序列(1708)。通過滾環(huán)雜交延伸第二近端探針以產生包含與錨定試劑互補的結合試劑的擴增子。將所述擴增子與包括捕獲試劑(1710)和錨定試劑(1711)的表面(1709)接觸，且通過使用多個標記的探針(1712)標記來測量結合到表面上的擴增子的量。另外，本文描述的方法可用于寡聚體分析物的檢測和定量。如果靶抗原是均一寡聚體(homo-oligomer)，即具有兩個或多個相同亞基的抗原，則檢測抗體需要用連接模板寡核苷酸(ligationtemplatingoligonucleotide)和引物寡核苷酸兩者獨立地標記。這可能導致低效率，因為僅具有模板寡核苷酸的兩種抗體或僅具有引發(fā)(priming)寡核苷酸的兩種抗體可以結合，并且這種非生產性(nonproductive)復合物可以降低該方法的靈敏度。當該方法應用于特異性寡聚結構的檢測時，這個問題可能加劇，其中使用另外的特異性模板寡核苷酸以允許寡聚體的特異性檢測。因此，本文所述的方法可以包括一組檢測抗體的預形成，所述檢測抗體被配置為有效地結合所需的低聚物分析物以及用于形成滾環(huán)模板的模板。這可以使用另外的寡核苷酸序列，例如支架寡核苷酸來實現(xiàn)，所述寡核苷酸序列可以與抗體偶聯(lián)的寡核苷酸特異性雜交，使得抗體以寡聚體的形式被配制于檢測抗體混合物中，與靶抗原寡聚體配對(match)。這一預組織步驟允許檢測抗體與靶寡聚體的最佳結合。在檢測抗體與寡聚物抗原結合之后，可以通過外切核酸酶降解或另一種合適的化學方法或核酸內切酶處理去除支架寡核苷酸。一旦除去支架寡核苷酸，可如本文所述進行接近連接滾環(huán)擴增測定。在另外的實施方案中，本文所述的測定形式還包括一種或多種對照測定?？梢栽诮Y合域上包括陰性對照，其包括不具有相應檢測抗體的捕獲抗體，從而為所有樣品提供一致的背景信號。高于預設閾值的信號的測量可以指示不適當?shù)臏y定處理或存在導致標記的檢測探針的非特異性結合的樣品依賴性基質效應。此外，在人靶抗原(例如分泌的或胞內蛋白質)的測定中也可以包括樣品樣本，其用于進行多重對照功能。陽性信號將指示存在人類材料，因此測試樣品添加和質量。人抗原還可以作為細菌抗原提取的過程對照。例如，可以選擇細胞內人分析物作為樣本，其也需要裂解和提取以進行檢測，例如Akt。低于預定閾值的信號的測量將表明沒有添加樣品，表明試劑或處理的失敗發(fā)生，或表明存在干擾擴增或檢測的物質。除了內部對照外，外部陽性和陰性對照也可以與方法和/或試劑盒一起使用。陽性對照可包含非感染性細菌提取物的混合物，所述組合物代表通過多重組(multiplexedpanel)所檢測的所有特異性靶抗原，提供了測試時所有測定的陽性信號。陰性對照包括不含任何靶蛋白的代表性基質?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法分析的樣品的例子包括但不限于，食物樣品(包括食物提取物、食物勻漿物、飲料等)、環(huán)境樣品(例如油樣品、環(huán)境淤渣(sludges)、收集的環(huán)境浮質(aerosol)、環(huán)境拭擦物(wipes)、水過濾物等)、工業(yè)樣品(例如起始材料、來自工業(yè)生產過程的產物或中間物)、人臨床樣品、獸醫(yī)樣品和其他具有生物起源的樣品?？煞治龅纳飿悠钒ǖ幌抻?，糞、粘膜拭樣(swab)、生理學樣品和/或含有細胞懸液的樣品。生物樣品的特定例子包括血液、血清、血漿、糞、粘膜拭樣、組織抽吸物、組織勻漿物、細胞培養(yǎng)物和細胞培養(yǎng)上清(包括真核和原核細胞的培養(yǎng)物)、尿、唾液、痰和腦脊髓樣品?？墒褂帽景l(fā)明的方法測量的分析物包括但不限于，蛋白質、毒素、核酸、微生物、病毒、細胞、真菌、孢子、糖類、脂質、糖蛋白、脂蛋白、多糖、藥物、激素、類固醇、營養(yǎng)物、代謝物和上述分子的任何經修飾的衍生物，或包含一種或多種上述分子或其組合的任意復合物。樣品中目的分析物的水平可以指示疾病或疾病狀況，或者其可以簡單地指示患者是否暴露于該分析物。在一個具體的實施方案中，感興趣的分析物是外來體，即，由大多數(shù)細胞類型釋放的小膜囊泡。外來體的釋放和隨后的攝取是細胞與細胞間通信的方法并在許多生理和病理過程的調節(jié)中具有作用。外來體已經顯示含有多種的信號分子，包括但不限于表面結合的和胞質蛋白、脂質、mRNA和miRNA，并且已經表明可以使用每種外來體中這些物質的特性和濃度以推斷其細胞起源和功能。因此，患者的總外來體群體的基因組或蛋白質組圖譜可以為各種病理狀況提供有價值的預后信息，包括癌癥、感染性疾病、腎臟和肝臟疾病，以及創(chuàng)傷性腦損傷等。通常在聚集體(aggregate)中測量外來體，其是通過從生物流體中分離大量的聚集體，破碎它們的膜，并通過常規(guī)方法，例如western印跡、PCR或測序來測定內含物(contents)的方式測量的。然而，本發(fā)明的方法和試劑盒可用于通過在表面上捕獲外來體以及隨后檢測由外來體表達的靶分子來表征外來體。已經鑒定了在大多數(shù)外來體中共有的幾種蛋白質，例如CD9、CD63、CD81、Hsp70、PDCD6IP、Tsg101，并且在一個實施方案中，可以單個使用或組合使用這些靶標以通過一種或多種捕獲試劑與一種或多種共有的外來體靶蛋白之間的結合相互作用來在表面上捕獲外來體。在替代的或另外的實施方案中，存在于外來體上或之中的疾病相關標志物被用于通過一種或多種捕獲試劑和疾病相關的外來體標志物之間的結合相互作用來在表面上捕獲外來體。然后可以使用一種或多種檢測試劑探測捕獲的外來體，所述檢測試劑針對一種或多種共有外來體蛋白質，或存在于外來體的一些部分的表面內或表面上的一種或多種另外的分子靶標。當選擇捕獲和檢測試劑的不同靶標時，將僅檢測包含兩種靶標的那些外來體，從而在鑒定或定量外來體亞群中具有另外的特異性。在一個具體的實施方案中，使用的樣品是純化的外來體制備物。在一個具體的實施方案中，可以使用一對檢測試劑來實現(xiàn)特定的表型不同的外來體亞群的檢測，所述檢測試劑僅當如本文所述的通過與接近的靶標(proximaltargets)的結合相互作用而接近時才產生信號。在本實施方案中，所述接近的靶標可以是相同分子上的不同表位，它們可以是在單個外來體內部或結合在相同外來體膜中的接近的相同分子種類的不同拷貝，或者它們可以是在單個外來體中或之上的不同的相互作用種類，例如兩個相互作用的蛋白(例如四絲氨酸-整聯(lián)蛋白復合物)、蛋白受體和配體(如EFG和EGFR)，或mRNA分子和RNA結合蛋白(如Argonaute1-4或GW182)。另外，使用本文所述的方法允許分析多達三種不同的靶分子，這些靶分子可以不是功能性相連的，而是通過存在于單個外來體內而連接。可以延長在本文所述的PLA/RCA方法中使用的近端探針，以允許連接和隨后擴增在外來體上或其中離得更遠的靶分子。在一個實施方案中，使用用于擴增子的特異性熒光探針進行PLA/RCA測定。此后，使用通用的熒光試劑(例如用于外來體中的RNA的吖啶橙)來標記捕獲的外來體，并對捕獲外來體成像以確定兩種熒光標記(fluorescentsignatures)之間的相關性。通用熒光試劑的使用允許基于尺寸和染色強度的從期望的外來體或其子集中選擇信號。為了探測內部靶分子(載體蛋白、脂質或RNA分子)，可以在捕獲之前或之后但在添加檢測試劑之前固定和通透(permeablized)外來體。如果使用本文所述的方法探尋(interrogate)經通透的外來體，則檢測試劑的一種或兩種可以包含能夠結合特定RNA的寡核苷酸探針，使得能夠檢測mRNA、miRNA和/或蛋白質和RNA之間的相互作用。可使用本文所述方法使用或不適用錨定試劑來測量外來體。如前所述，結合測定中錨定試劑的使用示于圖1(a)中，且如果分析物是外來體，則表面(101)包括捕獲試劑，如針對共有外來體的靶蛋白的捕獲試劑。在一個具體的實施方案中，表面還包括錨定試劑(103)。在一個或多個步驟中，將外來體結合到捕獲試劑和檢測試劑(104)，所述檢測試劑通過相同或不同的外來體靶蛋白也結合外來體，其中檢測試劑連接到核酸探針(105)。因此，在表面上形成的包括捕獲試劑、外來體和檢測試劑的復合物。延伸探針以形成包括結合錨定試劑的錨定區(qū)的延伸序列(107)。所述延伸序列結合到錨定試劑，并測量結合到表面的延伸序列的量。同樣，示于圖1(b)中的方法也可用于外來體的檢測。在一個具體的實施方案中，檢測復合物可包括一種或多種檢測試劑以增強外來體測定的特異性，例如，如圖1(c)所示。在一個或多個步驟中，將外來體與捕獲試劑和兩個(或多個)檢測試劑(分別為120和121)的每一個結合，其中所述檢測試劑結合外來體表達的靶蛋白，其中第一和第二檢測試劑中的每一個與核酸探針(122和123，分別為第一和第二核酸探針)連接。外來體可以同時或基本上同時或以序貫的，逐步的方式與捕獲和檢測試劑結合。因此，在表面上形成包括捕獲試劑、外來體以及第一和第二檢測試劑的復合物(124)。使用需要第一和第二探針彼此接近的延伸過程延伸第一探針以形成延伸序列(125)，所述延伸序列包含與錨定序列互補的錨定序列互補體。在倒數(shù)第二步中，將錨定序列與錨定序列互補體雜交并測量結合到表面的延伸序列的量。類似地，可以使用示于圖2(a)-(c)每一個的方法檢測外來體。本發(fā)明的測定法可用于測定樣品中一種或多種，例如兩種或更多種分析物的濃度。如此，可測量同一樣品中兩種或更多種分析物?？稍谕粯悠分袦y量的分析物的組包括，例如與疾病狀態(tài)或生理學狀況有關的分析物或活性的測定的組。某些這類組包括細胞因子和/或其受體(例如TNF-alpha、TNF-beta、ILl-alpha、ILl-beta、IL2、IL4、IL6、IL-10、IL-12、IFN-y等的一種或多種)，生長因子和/或其受體(例如EGF、VGF、TGF、VEGF等的一種或多種)、濫用藥物，治療性藥物，維生素，病原體特異性抗體，自身抗體(例如針對Sm、RNP、SS-A、SS-alpha、J0-1和Scl-70抗原的一種或多種抗體)，過敏原特異性抗體，腫瘤標志物(例如CEA、PSA、CA-125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CYFRA21-1、NSE、AFP等的一種或多種)，心臟病包括充血性心臟病和/或急性心肌梗塞的標志物(例如肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白C、肌紅蛋白、CKMB、髓過氧物酶、谷胱甘肽過氧化物酶、β-利尿鈉蛋白(BNP)、alpha-利尿鈉蛋白質(ANP)、內皮縮血管肽、醛固酮、C-反應性蛋白(CRP)等的一種或多種)，與止血有關的標志物(例如Fibrin單體、D-二聚體、凝血酶-抗凝血酶復合物、凝血酶原片段1&2、抗因子Xa等的一種或多種)，急性病毒性肝炎感染的標志物(例如針對甲肝病毒的IgM抗體，針對乙肝核心抗原的IgM抗體、乙肝表面抗原、針對丙肝病毒的抗體等的一種或多種)，阿耳茨海默病的標志物(alpha-淀粉樣蛋白、beta-淀粉樣蛋白、Aβ42、Aβ40、Aβ38、Aβ39、Aβ37、Aβ34、tau-蛋白質等)，骨質疏松癥的標志物(例如交聯(lián)的NorC-端肽(telopeptide)、總脫氧吡啶諾林(deoxypyridinoline)、游離脫氧吡啶諾林、成骨素(osteocalcin)、堿性磷酸酶、I型膠原的C-末端前肽、骨特異性堿性磷酸酶等的一種或多種)，生育狀態(tài)或生育有關的病癥的標志物(例如雌二醇、孕酮、促卵胞激素(FSH)、黃體化激素(LH)、促乳素、hCG、睪酮等的一種或多種)，甲狀腺病癥的標志物(例如促甲狀腺激素(TSH)、總T3、游離T3、總T4、游離T4和逆T3的一種或多種)，和前列腺癌的標志物(例如總PSA、游離PSA、復合PSA、前列腺酸磷酸酶、肌酸激酶等的一種或多種)。本發(fā)明的某些實施方案包括測量例如與特定疾病狀態(tài)或生理學狀況有關的一種或多種，兩種或更多中，四種或更多種或10種或更多種分析物(例如在組中分組到一起的分析物，如上文列出的那些；例如可用于診斷甲狀腺病癥的組可以包括例如促甲狀腺激素(TSH)、總T3、游離T3、總T4、游離T4和逆T3的一種或多種)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組包括傳統(tǒng)樣品基質中的一種或多種低豐度分析物，例如濃度為低于約100fg/mL，且優(yōu)選地低于約10fg/mL的分析物。可包括在組中的分析物的非限制性表包含，例如IL-17、IL-21、IL-31、Ab-38、Ab-40、Ab-42、Ab-39、Ab-43、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Abeta寡聚體、C-肽、IL-13、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12/23p40、IL-12p70、INF-g、PSA、PSAc、Tau、磷酸-Tau、TNFa、肌鈣蛋白I、心肌肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白C、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、EPO、LC3B、清蛋白、CHO-P、大腸桿菌HCP、IgA、IgE、IgG、IgG1、IgG4、IgM、NSO-P、Per-C6、剩余蛋白(residualprotein)A、IgG2、IgG3、IgG4、AFP、CA125、胱天蛋白酶-3活性、CXCL11/I-TAC、ErbB2/HER2、HGFR/o-MET、IFN-beta、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、beta-NGF、TFF3、TIMP1、Kim-1、alpha-2巨球蛋白、D-二聚體、ICAM-1、髓過氧物酶、肌紅蛋白、PAI-1、PCSK9、血纖維蛋白溶酶原、腎素/原腎素、tPA、CXCL1/GRO-alpha、CCL2/MCP1、CCL3/MIP-1alpha、CCL4/MIP-1beta、CCL5/Rantes、CRP、CXCL9/MIG、CXCL10/IL-10、G-CSF、GM-CSF、IFN-alpha、IFN-gamma、IL1alpha、IL-1beta、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL12(p70)、IL13、IL15、IL18、IL-22、IL-23、IL-33、c-MET、脂聯(lián)素(adiponectin)、FGF21、TSLP、GLP-1、生長激素、IGF1、IGF2、胰島素、瘦素(leptin)、促乳素、HIVp24、HB-EGF、AKT、磷酸-AKT，及其組合。在一個具體的實施方案中，所述組包含傳統(tǒng)樣品基質中的一種或多種低豐度分析物，例如濃度為低于約100fg/mL，且優(yōu)選地低于約10fg/mL的分析物，且所述組包括下述人靶標的一種或多種：G-CDF、GM-CSF、IFNgamma、IL-1beta、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12/23p40、IL12p70、IL-17A、IL21、IL-22、IL-23、IL-31、IL-33、TNFalpha、TSLP、VEGF、復合PSA、游離PSA、Abeta42、Abeta40、Abeta38、tau、心肌肌鈣蛋白I、心肌肌鈣蛋白T、HIVp24、C-肽，和/或FGF21。另外，本文中描述的方法和試劑盒可用于免疫測定以檢測對抗微生物抗性標志物(PBP2a/mecA(金黃色葡萄球菌，革蘭氏陽性)、TEM1(大腸桿菌，革蘭氏陰性)的單生物體敏感性。這些測定可用于在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌兩者中的這類分析物。測定中可包括牽涉對萬古霉素、beta-內酰胺、碳雜青霉烯(carbapenem)、氨基糖苷、和大環(huán)內酯抗生素的抗微生物抗性的一種或多種以下靶蛋白；erm家族、vanA、vanB、aac(6’)-aph(2”)、KPC、NDM、OXA-48、VIM、OXA-23樣、OXA-40樣、OXA-58樣、CTX-M-1和CTX-M-9家族的ESBL基因，及其組合。另外，所述測定中可以包括一種或多種下述蛋白：50S核糖體蛋白L20、30S核糖體蛋白S7、30S核糖體蛋白S2、50S核糖體蛋白L21、50S核糖體蛋白L17、30S核糖體蛋白S4、50S核糖體蛋白L15、30S核糖體蛋白S5、50S核糖體蛋白L16、30S核糖體蛋白S3、50S核糖體蛋白L22、50S核糖體蛋白L4、核糖體蛋白L25、50S核糖體蛋白L5、30S核糖體蛋白S2、核糖體蛋白L30、L31和L32，及其組合。另外，可以單獨或與本文鑒別的一種或多種標記物一同評價一種或多種下述靶，如延長分子EF-TU、ACP、酰基載體蛋白、RolL、核糖體蛋白GroS(MoB，65,000)、分子伴侶系統(tǒng)Gro-EL-Gro-ES和GapA的組分、糖酵解中的酶，及其組合。此外，本文所述的方法和試劑盒還可用于免疫測定以檢測與健康保健相關的感染(HAI生物體)，包括但不限于克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)、鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、腸桿菌屬(Enterobacter)物種。每種HAI生物體的抗性標記物提供在下表中：可以在本文所述的免疫測定中評估特定的外膜蛋白：此外，本文所述的方法和試劑盒可用于免疫測定中以檢測一種或多種以下類別的生物標志物：細胞因子、循環(huán)腫瘤特異性蛋白(circulatingtumor-specificproteins)、與一種或多種感染性疾病相關的蛋白、細胞內標志物等，及其組合。更進一步地，可使用本文所述的方法和試劑盒通過評估以下列出的一種或多種相關抗原的存在或不存在來鑒定以下自身免疫性疾?。涸诰唧w的實施方案中，所述組包含傳統(tǒng)樣品基質中的一種或多種低豐度分析物，例如濃度為低于約100fg/mL，且優(yōu)選地低于約10fg/mL的分析物。所述組優(yōu)選地包含一種或多種以下分析物：IL-17、IL-21、IL-31、IL-22、IL-23、IL-33、心肌鈣蛋白T、及其組合。在具體的實施方案中，在樣品中檢出的分析物的濃度在0.01fM至100fM、0.03fM–50fM、或0.03fM–10fM的范圍內。在一些實施方案中，可以基本準確測定的樣品中分析物分子的濃度是低于約100fM、低于約10fM、低于約3fM、低于約1fM、低于約0.3fM、低于約0.1fM、低于約0.03fM、或更低。樣品中分析物分子的濃度可視為基本準確測定的，如果測量的樣品中分析物分子的濃度在樣品分析物分子的實際濃度的約20％內的話。在某些實施方案中，測量的樣品中分析物分子的濃度可在樣品分析物分子的實際濃度的約10％，約3％或約1％內。該測定的檢測限是產生高于背景信號至少2.5標準差的信號的濃度，且優(yōu)選地該測定可檢測樣品中約10-10,000個分子，或樣品中100-5,000個分子，或樣品中100-1000個分子。在一個別的實施方案中，本文描述的方法可用于檢測由于最近暴露和/或感染處于低豐度的分析物。由于現(xiàn)有技術如ELISA的檢測限(LOD)高于能指示疾病開始的低豐度蛋白質的循環(huán)濃度這一事實，對多種疾病或狀況的早期診斷受到限制，所述疾病或狀況例如癌癥，細菌感染，例如炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)(炭疽)，病毒感染，例如HIV、肝炎、HPV等，毒素暴露，例如蓖麻毒蛋白、肉毒桿菌毒素A、B或E等。所述組可包含傳統(tǒng)樣品基質中的一種或多種低豐度分析物，例如濃度為低于約100fg/mL，且優(yōu)選地低于約10fg/mL的分析物?？杉{入組中的分析物的非限制性表包括，例如HIVgp41、HIVgp120、HIVgp160、HIVp24、HIVp66、HIVp51、HIVp17、HIVp31、Tat、Nef、Viv、肝炎A、B、C、D、或E抗原、HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和/或82、HPV-E6和E7蛋白、IL-17、IL-21、IL-31、IL-22、IL-23、IL-33、心肌鈣蛋白T、及其組合。仍進一步地，該組還可包含一種或多種以下分析物，其由于最近疾病開始、暴露和/或感染可能處于低豐度：Ab-38、Ab-40、Ab-42、Ab-39、Ab-43、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Abeta寡聚體、C-肽、IL-13、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、INF-g、PSA、Tau、磷酸-Tau、TNFa、肌鈣蛋白I、心肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白C、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、EPO、LC3B、清蛋白、CHO-P、大腸桿菌HCP、IgA、IgE、IgG、IgG1、IgG4、IgM、NSO-P、Per-C6、剩余蛋白A、IgG2、IgG3、IgG4、AFP、CA125、胱天蛋白酶-3活性、CXCL11/I-TAC、ErbB2/HER2、HGFR/o-MET、IFN-beta、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、beta-NGF、TFF3、TIMP1、Kim-1、alpha-2巨球蛋白、D-二聚體、ICAM-1、髓過氧物酶、肌紅蛋白、PAI-1、PCSK9、血纖維蛋白溶酶原、腎素/原腎素、tPA、CXCL1/GRO-alpha、CCL2/MCP1、CCL3/MIP-1alpha、CCL4/MIP-1beta、CCL5/Rantes、CRP、CXCL9/MIG、CXCL10/IL-10、G-CSF、GM-CSF、IFN-alpha、IFN-gamma、IL1alpha、IL-1beta、IL-3、IL-7、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-18、c-MET、脂聯(lián)素、FGF21、GLP-1、生長激素、IGF1、IGF2、胰島素、瘦素、促乳素、HB-EGF、AKT、磷酸-AKT、及其組合。本發(fā)明的方法設計為允許檢測很多種生物學和生化試劑，如上文描述的。在一個實施方案中，該方法可用于檢測病原性和/或潛在病原性病毒，細菌和毒素，包括在多種相關臨床和環(huán)境基質中的生物戰(zhàn)劑(“BWA”)，包括但不限于，血液、痰、便、過濾物、拭樣等。可使用本發(fā)明方法分析(單獨或組合)的病原體和毒素的非限制性表是炭疽芽孢桿菌(炭疽)，鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)(瘟疫)，霍亂弧菌(Vibriocholerae)(霍亂)，F(xiàn)rancisellatularensis(兔熱病)，布魯氏菌菌種(布魯氏菌病(Brucellosis))，伯內特考克斯體(Coxiellaburnetii)(Q熱病)，利斯特氏菌(listeria)，沙門氏菌(salmonella)，志賀氏菌(shigella)，V.cholera，沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)，類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderiapseudomallei)，屬正痘(orthopox)病毒包括天花病毒(smallpox)，病毒性腦炎，委內瑞拉馬腦炎(Venezuelanequineencephalitis)病毒(VEE)，西方馬腦炎(westernequineencephalitis)病毒(WEE)，東方馬腦炎(easternequineencephalitis)病毒(EEE)，Alpha病毒，病毒性出血熱，沙粒病毒科(Arenaviridae)，本雅病毒科(Bunyaviridae)，絲狀病毒科(Filoviridae)，黃病毒科(Flaviviridae)，埃博拉(Ebola)病毒，葡萄球菌腸毒素，蓖麻毒蛋白，肉毒桿菌毒素(A，B，E)，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)，真菌毒素，鐮孢菌(Fusarium)，Myrotecium，頭孢霉菌(Cephalosporium)，木霉菌(Trichoderma)，Verticimonosporium，葡萄穗霉菌(Stachybotrys)，鼻疽病(glanders)，小麥真菌，球形芽孢桿菌(Bacillusglobigii)，粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，黃雨(yellowrain)，單端孢霉烯(trichothecene)真菌毒素，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)，黃曲霉毒素，Xenopsyllacheopis，Diamanusmontanus，類天花(alastrim)，猴痘，沙粒病毒，漢坦病毒(Hantavirus)，拉沙熱(Lassafever)，阿根廷出血熱(Argentinehemorrhagicfevers)，玻利維亞出血熱(Bolivianhemorrhagicfevers)，里夫特裂谷熱(RiftValleyfever)病毒，克里米亞-剛果病毒，漢坦病毒，馬爾堡出血熱(Marburghemorrhagicfevers)，黃熱病毒，登革熱病毒，流感(包括人和動物株，包括H5N1禽流感，流感A，流感A，H1特異性，流感A，H3特異性，流感A，H5特異性，流感A，2009-H1N1特異性，流感B)，RSV，人免疫缺陷病毒I和II(HIVI和II)，甲肝，乙肝，丙肝，肝炎(非甲、乙或丙肝)，腸道病毒，Epstein-Barr病毒，巨細胞病毒，單純皰疹病毒，沙眼衣原體，淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)，陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)，人乳頭狀瘤病毒，梅毒螺旋體(Treponemapallidum)，肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumonia)，Borelliaburgdorferi，流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)，肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)，肺炎衣原體(Chlamydophilapneumoniae)，嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，葡萄球菌腸毒素B(SEB)，相思豆毒蛋白，志賀毒素1，志賀毒素2，卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)，釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)，艱難梭菌(Clostridiumdifficile)，腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)，克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)，結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)，組A鏈球菌，大腸桿菌O157，冠狀病毒，柯薩奇(Coxsackie)A病毒，鼻病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒(RSV)，偏肺病毒(metapneumovirus)，牛痘和腺病毒。本文中描述的對結合測定法的改進可用于擴展結合測定的動態(tài)范圍，即可通過系統(tǒng)或方法量化而不需稀釋或濃縮樣品或改變產生類似結果的測定條件(例如采用的試劑濃度等)的流體樣品中分析物分子的濃度范圍，且其中可以基本準確地測定分析物分子的測量濃度。流體樣品中分析物分子的濃度可視為基本準確測定的，如果測量的流體樣品中分析物分子的濃度在流體樣品分析物分子的實際(例如真實)濃度的約10％以內的話。在某些實施方案中，測量的流體樣品中分析物分子的濃度在實施方案中基本準確地測定，其中測量的濃度在流體樣品分析物分子的實際濃度的約5％以內，約4％以內，約3％以內，約2％以內，約1％以內，約0.5％以內，約0.4％以內，約0.3％以內，約0.2％以內，或約0.1％以內。在一些情況中，測定的濃度亮度與真實(例如實際)濃度相差不超過約20％，不超過約15％，不超過約10％，不超過約5％，不超過約4％，不超過約3％，不超過約2％，不超過約1％，或不超過約0.5％。在一些實施方案中，可以確定測定方法的準確度，其通過使用選定的測定方法測定已知濃度的流體樣品中分析物分子的濃度并將測量濃度與實際濃度比較。在一些實施方案中，該系統(tǒng)或方法可以能在超過約1000(3log)、約10,000(4log)、約100,000(5log)、約350,000(5.5log)、1,000,000(6log)、約3,500,000(6.5log)、約10,000,000(7log)、約35,000,000(7.5log)、約100,000,000(8log)或更高的動態(tài)范圍測量流體樣品中分析物分子的濃度。在一些實施方案中，可以基本準確測定的流體樣品中分析物分子的濃度(例如未知濃度)為低于約5000fM(飛摩)、低于約3000fM、低于約2000fM、低于約1000fM、低于約500fM、低于約300fM、低于約200fM、低于約100fM、低于約50fM、低于約25fM、低于約10fM、低于約5fM、低于約2fM、低于約1fM、低于約500aM(attomolar)、低于約100aM、低于約10aM、低于約5aM、低于約1aM、低于約0.1aM、低于約500zM(zeptomolar)、低于約100zM、低于約10zM、低于約5zM、低于約1zM、低于約0.1zM，或更低。在一些情況中，檢測限(例如可在溶液中測定的分析物分子的最低濃度)為約100fM、約50fM、約25fM、約10fM、約5fM、約2fM、約1fM、約500aM(attomolar)、約100aM、約50aM、約10aM、約5aM、約1aM、約0.1aM、約500zM(zeptomolar)、約100zM、約50zM、約10zM、約5zM、約1zM、約0.1zM，或更低。在一些實施方案中，可以基本準確測定的流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度為約5000fM至約0.1fM，約3000fM至約0.1fM，約1000fM至約0.1fM，約1000fM至約0.1zM，約100fM至約1zM，約100aM至約0.1zM，或更低。檢測上限(例如可在溶液中測定的分析物分子的上限濃度)為至少約100fM、至少約1000fM、至少約10pM(皮摩)、至少約100pM、至少約100pM、至少約10nM(納摩)、至少約100nM、至少約1000nM、至少約10uM、至少約100uM、至少約1000uM、至少約10mM、至少約100mM、至少約1000mM，或更大。在一些實施方案中，測定的流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度為低于約50x10-15M、或低于約40x10-15M、或低于約30X10-15M、或低于約20x10-15M、或低于約10x10-15M，或低于約，或低于約1x10-15M。在一些實施方案中，可以基本準確測定的樣品中分析物分子的濃度為低于約100fM,低于約10fM,低于約3fM,低于約1fM,低于約0.3fM,低于約0.1fM,低于約0.03fM，或更低。在一些實施方案中，可以基本準確測定的樣品中分析物分子的濃度為約5000fM至約0.1fM，約3000fM至約0.1fM，約1000fM至約0.1fM，約1000fM至約1fM，約100fM至約1fM，約100fM至約0.1fM。樣品中分析物分子的濃度可視為基本準確測定的，如果測量的樣品中分析物分子的濃度在樣品分析物分子的實際濃度的約20％以內的話。在某些實施方案中，測量的樣品中分析物分子的濃度在樣品分析物分子的實際濃度的約10％以內，約3％以內，或約1％以內。在一些實施方案中，可以確定測定方法的準確度，其通過使用選定的測定方法測定已知濃度的樣品中分析物分子的濃度。優(yōu)選地，測定可檢測樣品中10-10,000個分子，優(yōu)選地樣品中100-5,000個分子，更優(yōu)選地樣品中100-1000個分子。相對于常規(guī)的夾心免疫測定技術，如例如使用相同捕捉抗體和兩種檢測抗體的任一以及相同標記和檢測技術測量的，使用本文中描述的測定形式能將檢測信號和測定靈敏性改進多達10倍，優(yōu)選地多達50倍，100倍，或多達1000倍。優(yōu)選地，使用本文中描述的測定形式能將檢測信號和測定靈敏性相對于標準夾心免疫測定法改進多達100倍。本發(fā)明方法的一個有利的方面，尤其是當與靈敏光學檢測技術偶聯(lián)時，是信號擴增允許檢測單個結合事件為光的亮點。然后，對信號的定量可通過對個體事件計數(shù)(其可對低分析物濃度提供更好的靈敏性，通過提供改進的從背景噪音對結合事件區(qū)分)或通過對于所有結合事件的信號整合(其可提供測量高分析物濃度的更好的動態(tài)范圍)來實施。本發(fā)明的方法可在多種測定裝置和/或形式中使用。測定裝置可包含，例如測定模塊，如測定板、筒、多孔測定板、反應容器、試管、小池、流動池、測定芯片、測流裝置等，具有隨測定進展添加的或預加載在測定模塊的孔、室或測定區(qū)域中的測定試劑(其可包含靶向性試劑或其他結合試劑)。這些裝置可采用多種測定形式用于特異性結合測定法，例如免疫測定或免疫層析測定。下文中描述了例示性的測定裝置和形式。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法可采用以干態(tài)存儲的測定試劑且測定裝置/試劑盒可進一步包含或與干燥劑材料一起供應以維持測定試劑處于干態(tài)。預加載有測定試劑的測定裝置可極大地改進速度和降低測定測量的復雜性，而在存儲期間保持極好的穩(wěn)定性。干燥的測定試劑可以是任何能干燥的測定試劑，然后在測定中使用之前重建。這些包括但不限于，可用于結合測定法的結合試劑，酶，酶底物，指示物染料和其他可用于檢測目的分析物的反應性化合物。測定試劑還可以包含不直接牽涉檢測機制但在測定中起著輔助作用的物質，包括但不限于，封閉劑，穩(wěn)定劑，去污劑，鹽，pH緩沖劑，防腐劑等。試劑可以以游離形式或在固相，包括測定模塊中區(qū)室(例如室、通道、流動池、孔等)的表面或膠體、珠或其他微粒支持物的表面上支持而存在。本發(fā)明的方法可以與多種用于測量分析物的量，特別是測量結合于固相的分析物的量的方法一起使用?？墒褂玫募夹g包括但不限于，本領域中已知的技術如基于細胞培養(yǎng)的測定法，結合測定法(包括凝集測試、免疫測定、核酸雜交測定等)，酶測定法，比色測定法等。其他適宜的技術對于本領域普通技術人員來說將是容易明顯的。一些測量技術允許通過肉眼檢查進行測量，其他技術可能需要或受益于利用儀器來進行測量。用于測量分析物的量的方法包括無標記物技術，其包括但不限于i)測量在分析物結合表面后表面的質量(mass)或折射率的變化的技術(例如表面聲波技術、表面等離振子共振傳感器、橢圓偏振(ellipsometric)技術等)，ii)質譜技術(包括能測量表面上的分析物的技術如MALDI,SELDI等),iii)層析或電泳技術，iv)熒光技術(其可基于分析物的內在熒光)，等等。用于測量分析物的量的方法還包括經由對可能直接或間接(例如經由使用分析物的經標記的結合伴侶)附接于分析物的標記物的檢測來測量分析物的技術。適宜的標記物包括可直接可視化的標記物(例如可肉眼看到的顆粒和生成可測量信號如光散射、光吸光度、熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、放射性、磁場等的標記物)?？墒褂玫臉擞浳镞€包括酶或其他化學反應性種類，其具有產生可測量信號如光散射、吸光度、熒光等的化學活性。使用酶作為標記物在酶聯(lián)免疫吸附測定也稱為ELISA、酶免疫測定或EIA中是確定的。在ELISA形式中，未知量的抗原被附接于表面，然后特異性抗體從表面清洗通過，從而其可以結合抗原。該抗體連接于酶，且在最終步驟中添加物質從而酶將其轉化成提供可檢測信號中變化的產物。產物的形成可以是可檢測的，例如由于在可測量特性如吸光度、熒光、化學發(fā)光、光散射等中相對于底物的差異?？膳c依照本發(fā)明的固相結合方法一起使用的某些(但并非所有)測量方法可能受益于或需要清洗步驟以從固相除去未結合的組分(例如標記物)。因此，本發(fā)明的方法可包含這類清洗步驟。在采用一對可檢測的標記物的那些實施方案中，基于當一對標記物彼此接近，即各自直接或間接結合檢測復合物中的目的分析物時其可被獨立檢測的能力和/或那些物質協(xié)同工作以生成可檢測信號的能力來選擇那些經標記的物質。在一個實施方案中，第一可檢測的標記物是偶聯(lián)酶反應系統(tǒng)的第一酶且第二可檢測的標記是偶聯(lián)酶反應系統(tǒng)的第二酶，且該方法進一步包括添加該反應系統(tǒng)的一種或多種底物的步驟，由此產生酶反應系統(tǒng)的可檢測產物。包含可檢測產物的那些反應容器可與不包含的那些反應容器區(qū)分。在一個優(yōu)選的實施方案中，僅當?shù)谝幻负偷诙附咏?例如低于200nm，理想地低于50nm)時產生可檢測的產物。在一個實施方案中，第一酶是氧化酶，例如葡萄糖氧化酶，第二酶是過氧化物酶，且底物包含氧化酶底物例如葡萄糖，和經標記的酪胺(tyramide)、AmplexRed(10-乙酰-3,7-二羥基吩噁嗪(dihydroxyphenoxazine))、或魯米諾衍生物(本文中統(tǒng)稱為經標記的反應性衍生物且在一個優(yōu)選的實施方案中，經標記的反應性衍生物包含AmplexRed或魯米諾)。在該實施方案中，第一酶與底物反應以生成產物，其與第二酶反應以生成第二產物，該第二產物與經標記的反應性衍生物反應以生成可檢測的種類。優(yōu)選地，由檢測復合物中第一和第二酶催化的反應導致經標記的反應性衍生物在表面上的固定化，可對此測量來測定表面上存在的分析物分子的數(shù)目。在一個實施方案中，經標記的反應性衍生物是生物素-酪胺，其該方法進一步包括添加經標記的鏈霉親合素和測量鏈霉親合素上的標記物?？捎糜谒龇椒ǖ挠忠粋€近端依賴性標記系統(tǒng)是FRET對，例如第一可檢測的標記物是FRET供體而可檢測的標記物是FRET接受體。熒光共振能量轉移(FRET)是兩種染料分子的電子激發(fā)態(tài)之間的距離依賴性相互作用，其中激發(fā)從供體分子轉移至接受體分子而不發(fā)射光子。FRET的效率依賴于分子間間隔的倒數(shù)六次方，使得在與生物大分子尺寸可比的距離中可用。在該標記系統(tǒng)中，近端依賴性信號通過激發(fā)FRET供體和測量從FRET接受體的發(fā)射來測量。供體和接受體分子優(yōu)選緊密接近的，例如約10-100埃，接受體的吸收光譜優(yōu)選與供體的熒光發(fā)射光譜重疊，且供體和接受體躍遷偶極(transitiondipole)取向應大致平行。FRET對的非限制性表在下表1中提供。表1.FRET對例子對于光顯微術有多種FRET檢測方法，例如接受體光漂白、供體光漂白、比率成像、敏化發(fā)射和熒光壽命測量。可用在采用一對檢測標記物的實施方案中的另一個適宜的標記系統(tǒng)是其中可以獨立測量第一和第二可檢測的標記物的系統(tǒng)。例如，第一和第二可檢測的標記物可以是發(fā)光標記物，其彼此的光譜特性不同?；蛘?，第一可檢測的標記物是與第一底物反應以產生第一信號的第一酶，而第二可檢測的標記物是與第二底物反應以產生不同的第二信號的第二酶，且該方法還包括添加第一酶底物和第二酶底物，并計算其中生成第一和第二信號的反應容器的數(shù)目。第一和第二信號可以是光吸光度中的變化和/或具有不同光譜特性的發(fā)光信號。如果第一和第二可檢測的標記物包含第一和第二酶，則它們各自可為水解酶，例如磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶或其組合，且因此，第一和第二底物選自磷酸、硫酸、半乳糖苷和葡糖苷酸修飾的穩(wěn)定化的二氧雜環(huán)丁烷、4-甲基傘形基、熒光素或其組合?；蛘?，第一和第二酶選自辣根過氧化物酶、beta-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶?；蛘?，用于檢測分析物分子的標記物可以是可用于單分子熒光檢測，例如熒光相關光譜和/或熒光交互相關光譜中的熒光種類。單分子熒光檢測包括使包含可檢測的種類的洗脫物流過毛細管，將光源聚焦在毛細管內的某體積上以創(chuàng)建探詢帶，并用光檢測器觀察探詢帶以檢測熒光分子經由探詢帶的通過。在一個實施方案中，可使用基于電化學發(fā)光的測定形式來測量樣品中的一種或多種目的分析物，例如基于電化學發(fā)光(ECL)的免疫測定法。ECL的高靈敏性、較廣的動態(tài)范圍和選擇性是用于醫(yī)學診斷的重要因素。商品化的ECL儀器已顯示出優(yōu)越的性能，且由于其極好的靈敏性、動態(tài)范圍、精度和對復合物樣品基質的容忍性其已被廣泛使用。可誘導以發(fā)出ECL的種類(ECL活性種類)已被用作ECL標記物，例如i)有機金屬化合物，其中金屬來自例如組VIII的貴金屬，包括含Ru和含Os有機金屬化合物如三-聯(lián)吡啶-釕(RuBpy)模塊和ii)魯米諾和相關化合物。在ECL過程中參與ECL標記物的種類在本文中稱為ECL共反應物。常見使用的共反應物包括對于來自RuBpy的ECL為叔胺(例如參見美國專利No.5,846,485)、草酸鹽和過硫酸鹽，對于來自魯米諾的ECL為過氧化氫(參見例如美國專利No.5,240,863)。通過ECL標記物生成的光可用作診斷規(guī)程中的報告信號(Bard等,美國專利No.5,238,808，通過提述并入本文)。例如，ECL標記物可以共價偶聯(lián)于結合劑如抗體、核酸探針、受體或配體；可以通過測量從ECL標記物發(fā)出的ECL來監(jiān)測結合相互作用中結合試劑的參與。或者，來自ECL活性化合物的ECL信號可以指示化學環(huán)境(參見例如美國專利No.5,641,623，其描述了監(jiān)測ECL共反應物的形成或破壞的ECL測定)。對于ECL、ECL標記物、ECL測定法和用于進行ECL測定法的儀器的更多背景，參見美國專利Nos.5,093,268；5,147,806；5,324,457；5,591,581；5,597,910；5,641,623；5,643,713；5,679,519；5,705,402；5,846,485；5,866,434；5,786,141；5,731,147；6,066,448；6,136,268；5,776,672；5,308,754；5,240,863；6,207,369；6,214,552和5,589,136和公開的PCTNos.WO99/63347；WO00/03233；WO99/58962；WO99/32662；WO99/14599；WO98/12539；WO97/36931和WO98/57154，所有均通過提述并入本文。本發(fā)明的方法可應用于單路或其中在單一樣品中進行多種測定測量的多重形式?？捎糜诒景l(fā)明的多重測量包括但不限于，以下多重測量i)牽涉多個傳感器的使用；ii)使用基于表面上位置可區(qū)分的表面(例如陣列)上的離散測定域；iii)牽涉使用在顆粒上包被的試劑，所述顆?；陬w粒特性如大小、形狀和顏色等可區(qū)分；iv)產生基于光學特性(例如吸光度或發(fā)射光譜)可區(qū)分的測定信號或v)基于測定信號的時間特性(例如信號的時間、頻率或相位)。在一些實施方案中，對樣品中分析物分子濃度的量度可至少部分通過比較測量的參數(shù)與校正標準來測定。例如，包含分析物分子的結合表面的分數(shù)可與校正曲線比較以測定樣品中分析物分子濃度的量度。校正曲線可通過在用于分析測試樣品的條件下完成對多個已知濃度的標準化樣品的測定來產生。對于每份標準化樣品可對與分析物分子的檢測/定量有關的信號取讀數(shù)，因此允許形成將分析物分子的檢測與已知濃度的分析物分子相關的校正曲線。然后，測定可以在包含未知濃度的分析物分子的樣品上完成，并將來自該測定的分析物分子的檢測繪制在校正曲線上，因此測定對樣品中分析物分子濃度的量度。在使用成像技術以測量光信號(如熒光、化學發(fā)光或電化學發(fā)光)的一個具體情況中，結合事件可檢測為光的亮點源。當點源的表面密度較低時(例如當在RxR(其中R是檢測系統(tǒng)的空間分辨率)區(qū)域發(fā)現(xiàn)點源的概率低于10％時)，可能任何觀察到的點源是由于單一結合事件。在這些條件下，對事件計數(shù)可以提供最靈敏的測量。當表面密度增加時，解析和計數(shù)各個結合事件變得逐漸困難的。在這些條件下，整合結合表面上的光信號提供更準確的測量。對于熟練技術人員而言明顯的是本文中描述的方法可應用到本領域技術人員已知的大量免疫測定平臺。可以調整免疫測定平臺的多個特征以適合具體的平臺，但那些調整是完全在普通技術人員能力范圍內的。例如，本文中描述的方法可應用于使用編碼顆粒的基于珠的形式。在這類系統(tǒng)中，使用的珠可以是磁性或非磁性的，且珠的表面經修飾以包含捕捉試劑的一個或多個拷貝。該系統(tǒng)中采用的檢測試劑是一對檢測試劑。在一個實施方案中，兩種檢測試劑包含可區(qū)分的熒光標記物?；蛘?，兩種檢測試劑用核酸探針修飾，如本文描述的，在該情況下，免疫測定方法包括延伸過程例如RCA-PLA以生成擴增的產物，其指示可檢測的每種檢測試劑的存在。如果檢測試劑包含兩種可區(qū)分的熒光標記物，那么測量步驟包括將珠引入流動池，且如果珠是磁性的，就在流動池中捕捉珠。如果檢測試劑用核酸探針修飾，則測量步驟包括在珠上形成夾心復合物，實施RCA-PLA和用熒光標記的檢測探針標記擴增子。然后，將經標記的珠引入流動池中且如果珠是磁性的，就在流動池中捕捉珠。在每個實施方案中，可以基于對熒光標記的編碼珠的鑒定來光譜多重化測定。可以使用激發(fā)光源和用于多色檢測的發(fā)射光檢測器來檢測每個實施方案中的結合事件，通過對具有兩種可檢測的標記的珠或包含可檢測的經標記延伸產物的那些珠計數(shù)來實現(xiàn)定量，且定量還通過整合的強度來實現(xiàn)，例如通過對所有結合事件整合信號檢測。因此，可以提供用于上文所述方法的試劑盒，其在一個或多個管形瓶、容器或區(qū)室中包含以下一種或多種：(a)具有捕捉試劑的磁性或非磁性珠；(b)具有可區(qū)分熒光標記物的兩種檢測試劑；和(c)任選的緩沖劑和/或稀釋劑用于測定方案?？捎糜谏衔乃龇椒ǖ牧硪辉噭┖锌稍谝粋€或多個管形瓶、容器或區(qū)室中包含以下一種或多種：(a)具有捕捉試劑的磁性或非磁性珠；(b)用核酸探針修飾的兩種檢測試劑(任選地，分別提供檢測試劑且另外提供近端探針(1和2)，具有用探針修飾檢測試劑的用法說明)；和(c)熒光標記的探針；任選的用近端探針修飾檢測試劑所需的試劑；測定稀釋劑、校正物、環(huán)化寡核苷酸、連接混合物或其組分，例如連接緩沖液、ATP、BSA、Tween20、T4DNA連接酶；RCA混合物或其組分，例如BSA、緩沖液、dNTP、Tween20、Phi29DNA聚合酶。在另一個實施方案中，本文中描述的方法可用于流動池分析的基于珠的惡性是。在這類系統(tǒng)中，使用的珠可以是磁性的且珠表面經修飾以包含捕捉試劑的一個或多個拷貝。該系統(tǒng)中采用的檢測試劑是一對用核酸探針修飾的檢測試劑，如本文描述的，在該情況下，免疫測定方法包括延伸過程例如RCA-PLA以生成擴增的產物，其指示可檢測的每種檢測試劑的存在。測量步驟包括在珠上形成夾心復合物，實施RCA-PLA和用ECL-標記的檢測探針標記擴增子。然后，將經標記的珠引入流動池中且在流動池中捕捉珠。具體地，應用磁場以將磁性顆粒例如珠吸引至電極表面，其可包含多種金屬例如鉑。使用電壓源來對電極應用電壓且可以使用發(fā)射光檢測器來檢測結合事件；通過對具有可檢測經標記的延伸產物的珠計數(shù)來實現(xiàn)定量，且定量還通過整合的強度來實現(xiàn)，例如通過對所有結合事件整合信號檢測?？捎糜谏衔乃龇椒ǖ脑噭┖性谝粋€或多個管形瓶、容器或區(qū)室中可包含以下一種或多種：(a)具有捕捉試劑的磁珠；(b)用核酸探針修飾的兩種檢測試劑(任選地，分別提供檢測試劑且另外提供近端探針(1和2)，具有用探針修飾檢測試劑的用法說明)；和(c)ECL標記的探針；任選的用近端探針修飾檢測試劑所需的試劑；測定稀釋劑、校正物、環(huán)化寡核苷酸、連接混合物或其組分，例如連接緩沖液、ATP、BSA、Tween20、T4DNA連接酶；RCA混合物或其組分，例如BSA、緩沖液、dNTP、Tween20、Phi29DNA聚合酶。在流動池分析的基于珠的形式的一個具體的實施方案中，將樣品與分析物特異性的生物素化單克隆捕捉抗體和分析物特異性單克隆抗體的混合物溫育，所述單克隆抗體各自綴合寡核苷酸，其反應以形成夾心復合物。在添加用鏈霉親合素包被的微顆粒后，復合物經由生物素和鏈霉親合素之間的相互作用變成結合固相。對該混合物添加連接混合物，并將該混合物與連接混合物溫育，清洗以除去過量的環(huán)狀寡核苷酸，并與RCA混合物溫育。清洗混合物并加入生物素-經標記檢測探針的混合物。為了摻入適宜的標記物例如發(fā)光、化學發(fā)光或電化學發(fā)光標記物，例如SULFO-TAG，合成具有末端生物素標記物的檢測探針并與用SULFO-TAG標記的鏈霉親合素預結合。將反應混合物抽吸到測量孔，該處微顆粒被磁性捕捉到電極例如金屬電極(如鉑電極)的表面上。然后用適宜的清洗緩沖液例如ProCell(含TPA的緩沖液)除去未結合的物質。然后對電極應用電壓誘導化學發(fā)光發(fā)射，對此通過光電倍增管測量。電壓施用和所得發(fā)射的測量可在任何適宜的流動池例如Cobas和/或Elecsys儀器(可獲自Hoffmann-LaRocheLTD.)中完成。在又一個實施方案中，本文描述的方法可應用于基于珠的形式，伴有毛細管流動以對個體分子數(shù)字計數(shù)。在這類系統(tǒng)中，使用的珠可以是磁性的且珠的表面修飾為包含捕捉試劑的一個或多個拷貝。該系統(tǒng)中采用的檢測試劑是一對包含可區(qū)分的熒光標記物的檢測試劑。測量步驟包括形成包含捕捉試劑、分析物和檢測試劑的夾心復合物，交聯(lián)檢測試劑，洗脫檢測試劑并將珠引入流動池中?？梢允褂眉ぐl(fā)光源和用于多色檢測的發(fā)射光檢測器來檢測結合事件，通過關聯(lián)流動池中兩種熒光團的檢測來實現(xiàn)定量，且定量還通過整合的強度來實現(xiàn)，例如通過對所有結合事件整合信號檢測。可用于上文所述方法的試劑盒可在一個或多個管形瓶、容器或區(qū)室中包含以下一種或多種：(a)具有捕捉試劑的磁珠；(b)具有可區(qū)分的熒光標記物的兩種可交聯(lián)檢測試劑；和(c)任選的緩沖劑和/或稀釋劑用于測定方案。而且，本文描述的方法可應用于基于珠的形式，其包含將珠分到各個納米孔中。在這類系統(tǒng)中，使用的珠可以是磁性的且珠的表面修飾為包含捕捉試劑的一個或多個拷貝。該系統(tǒng)中采用的檢測試劑是一對包含可區(qū)分的酶標記物的檢測試劑。測量步驟包括形成包含捕捉試劑、分析物和檢測試劑的夾心復合物，和添加兩種酶標記物的底物。然后在各個納米孔中捕捉珠?；诰哂胁煌庾V特性的酶產物的鑒定，測定可以是光譜多重化的。可以使用激發(fā)光源和用于多色檢測的發(fā)射光檢測器來檢測結合事件，通過對具有兩種酶產物的納米孔計數(shù)來實現(xiàn)定量，且定量還通過整合的強度來實現(xiàn)，例如通過對所有納米孔整合信號檢測?？捎糜谏衔乃龇椒ǖ脑噭┖锌稍谝粋€或多個管形瓶、容器或區(qū)室中包含以下一種或多種：(a)具有捕捉試劑的磁珠；(b)各用可區(qū)分的酶標記物修飾的兩種檢測試劑，例如生物素化的檢測試劑和用半抗原綴合的檢測試劑；(c)鏈霉親合素-beta半乳糖苷酶，用抗-半抗原綴合的酶，試鹵靈(resorufin)-beta-d-半乳吡喃糖苷(galactopyranoside)；(d)陣列，例如QuanterixDVD形式陣列；(e)氟碳油；和(f)任選的緩沖劑和/或稀釋劑用于測定方案。在這種具體的實施方案中，通過將納米孔高靈敏性系統(tǒng)與基于近端的檢測系統(tǒng)組合使用來增強可檢測的信號。盡管使用具體的基于近端的檢測系統(tǒng)例示了這一具體的實施方案，但熟練技術人員將領會也可以使用本文描述的其他基于近端的檢測系統(tǒng)來增強測定中的可檢測的信號這一事實，例如FRET供體/接受體系統(tǒng)；就光譜特性而言彼此不同的發(fā)光標記物；或使用如上文描述的為水解酶的第一和第二酶，和適宜的伴隨底物。仍進一步地，本文描述的方法可應用于基于珠-陣列的平臺。在這類系統(tǒng)中，使用的珠可以是非磁性的且珠的表面修飾為包含捕捉試劑的一個或多個拷貝。該系統(tǒng)中采用的檢測試劑是包含第一和第二核酸探針的一對檢測試劑。測量步驟包括形成包含捕捉試劑、分析物和檢測試劑的夾心復合物，延伸一種探針以形成延伸序列，其中該延伸依賴于第一和第二探針在夾心復合物中的共定位，用熒光探針標記延伸序列，并從表面釋放延伸序列至洗脫物中?？梢允褂眉ぐl(fā)光源和用于多色檢測的發(fā)射光檢測器來檢測結合事件，通過對可檢測標記的個體延伸產物計數(shù)來實現(xiàn)定量，且定量還通過整合的強度來實現(xiàn)，例如通過對所有結合事件整合信號檢測?？捎糜谏衔乃龇椒ǖ脑噭┖锌稍谝粋€或多個管形瓶、容器或區(qū)室中包含以下一種或多種：(a)具有捕捉試劑的非磁性珠；(b)用核酸探針修飾的兩種檢測試劑(任選地，分別提供檢測試劑且另外提供近端探針(1和2)，具有用探針修飾檢測試劑的用法說明)；和(c)熒光標記的探針；任選的用近端探針修飾檢測試劑所需的試劑；測定稀釋劑、校正物、環(huán)化寡核苷酸、連接混合物或其組分，例如連接緩沖液、ATP,BSA,Tween20,T4DNA連接酶；RCA混合物或其組分，例如BSA,緩沖液,dNTP,Tween20,Phi29DNA聚合酶。本文描述的改進的結合測定法可使用包含測定法中采用的一組組分的一種或多種試劑盒實施。例如，在檢測樣品中分析物中使用的試劑盒在一個或多個管形瓶、容器或區(qū)室中包含，包含針對分析物的捕捉試劑和錨定試劑的表面；針對分析物的檢測試劑，其連接于核酸探針。這類試劑盒可包含錨定試劑，其包含錨定寡核苷酸序列?？捎糜趯嵤┍疚拿枋龅姆椒ǖ牧硪环N試劑盒在一個或多個管形瓶、容器或區(qū)室中包含，表面，其包含針對分析物的捕捉試劑和包含錨定寡核苷酸序列的錨定試劑；第一檢測試劑，其連接于第一核酸探針；和第二檢測試劑，其連接于第二核酸探針。可用于實施本文描述的結合測定法的再一種試劑盒在一個或多個管形瓶、容器或區(qū)室中包含，包含針對分析物的捕捉試劑和錨定試劑的表面；針對分析物的第一檢測試劑，其包含第一近端探針；針對分析物的第二檢測試劑，其包含第二近端探針；和連接體序列，其包含(i)互補于第二近端探針的內部序列，和(ii)互補于第一近端探針的非重疊性區(qū)域的兩個端序列?；蛘?，試劑盒可改為包含，包含針對分析物的捕捉試劑和錨定試劑的表面；針對分析物的第一檢測試劑，其包含第一近端探針；針對分析物的第二檢測試劑，其包含第二近端探針；和(i)第一連接寡核苷酸，和(ii)第二連接寡核苷酸，其中(x)第一連接體的第一端和第二連接體的第一端互補于第一近端探針的兩個非重疊性區(qū)域，和(y)第一連接體的第二端和第二連接體的第二端互補于第一近端探針的兩個非重疊性區(qū)域。另外，在這些試劑盒的任一或兩者中的錨定試劑可包含錨定寡核苷酸序列。而且，本文描述的方法可使用以下試劑盒實施，其在一個或多個管形瓶、容器或區(qū)室中包含，包含第一可檢測的標記的第一檢測試劑；包含第二可檢測的標記的第二檢測試劑；配置為含有一個或更少的分析物分子的多個反應容器；和任選地，包含捕捉試劑的表面。最后，用于使用本文描述的方法檢測分析物的試劑盒可在一個或多個管形瓶、容器或區(qū)室中包含，表面，其包含固定化的捕捉試劑；包含第一可檢測的標記的第一檢測試劑；包含第二可檢測的標記的第二檢測試劑；和與第一和第二檢測試劑反應性的交聯(lián)劑。交聯(lián)劑可包括多功能交聯(lián)劑，其連接附接于檢測試劑的反應性模塊或附接于檢測試劑的結合模塊的多價結合伴侶。適宜的多功能交聯(lián)劑包括但不限于，胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、馬來酰亞胺、點擊化學試劑及其組合。類似地，多價結合伴侶的例子是多價抗物種抗體，其靶向作為該動物物種的抗體的檢測試劑。當與附接于檢測試劑的伴侶結合配偶成對時，交聯(lián)劑還可包括鏈霉親合素、親合素或生物素。交聯(lián)劑還可以是寡核苷酸，其包含與直接或間接結合試劑盒組分的核酸探針互補的序列。在一個具體的實施方案中，本文描述的方法中使用的試劑盒在一個或多個管形瓶、容器或區(qū)室中包含，表面，其包含固定化的捕捉試劑；具有第一可檢測的標記和第一核酸探針的第一檢測試劑，和；具有第二可檢測的標記和第二核酸探針的第二檢測試劑；和具有互補于第一和第二核酸探針的區(qū)域的第三核酸。本文描述的試劑盒的表面可包含針對一種或多種分析物分子的多種捕捉試劑，其中所述捕捉試劑在位于表面上的多個可解析結合區(qū)域或反應容器上分配，例如在陣列中、多孔板中或微孔或納米孔板中。另外，表面還可以包含多個顆粒，其各自包含針對分析物分子的多種捕捉試劑。上文描述的試劑盒可進一步包含一種或多種以下物質：一種或多種另外的試劑、緩沖液、聚合酶、連接酶、和/或dNTP(經標記或未經標記的)。另外，如果一種或多種檢測試劑包含可檢測的標記，則試劑盒還可包含試劑盒中采用的可檢測的標記的共反應物?；蛘撸绻环N或多種檢測試劑是偶聯(lián)的酶反應系統(tǒng)的組分時，則每種檢測試劑包含第一和第二酶且試劑盒還在一個或多個管形瓶、容器或區(qū)室中包含，偶聯(lián)酶反應系統(tǒng)的一種或多種底物，和任選地，配置為結合偶聯(lián)酶反應系統(tǒng)的產物的經標記組分。例如，第一酶可以是氧化酶，第二酶是過氧化物酶，且試劑盒還包含氧化酶底物和經標記的酪胺衍生物。在另一個實施方案中，第一和第二可檢測的試劑可包含近端依賴性檢測系統(tǒng)的組分，例如FRET供體和FRET接受體，或彼此就光譜特性而言不同的發(fā)光標記物。其他的備選實施方案圖7中例示了一個另外的實施方案。小圖(a)中夾心免疫測定復合物中每個近端探針的一部分被雜交于各區(qū)段的RNA短鏈暫時保護。酶法除去RNA鏈從而使得每個近端探針可彼此雜交且使用生物素化的dNTP通過聚合酶延伸來延伸鏈(小圖(b))。摻入鏈中的每個生物素化的堿基結合于用可檢測的標記物標記的鏈霉親合素(小圖(c))。另一種方法在圖8中例示。近端探針可附接于錨定試劑和檢測試劑(如小圖(a)中顯示)或每種近端探針可附接于兩種檢測試劑，如上文描述的(未顯示)。與圖7中例示的方法大部分類似，每個近端探針的一部分被雜交于各區(qū)段的RNA短鏈暫時保護。酶法除去RNA鏈從而使得每個近端探針可彼此雜交且使用生物素化的dNTP通過聚合酶延伸來延伸鏈(小圖(b))。摻入鏈中的每個生物素化的堿基結合于用可檢測的標記物標記的鏈霉親合素(小圖(c))。另外的實施方案在圖18中示出。在該實施方案中，使用多種短寡核苷酸作為U形序列(staplesequences)(1801)與擴增子的一部分雜交，并從而將產物折疊成易于成像的緊湊結構。每個U形序列包含至少兩個序列(分別為1802和1803)，其每一個與擴增子的序列互補，且當每個U形序列與其互補體雜交時，所述擴增子如圖18所示被折疊回自身上。另外，擴增子也可以通過與如上所述的錨定試劑(1804)的錨定相互作用而粘附到表面。通過在擴增步驟期間將U形序列添加到反應混合物中，可以原位(insitu)進行裝訂(stapling)過程。因此，隨著每個擴增循環(huán)的完成，U形序列自由地與新形成的擴增子雜交并使其折疊。也可以在擴增過程完成之后添加U形序列，使得線性擴增子折疊成線圈或平片，這取決于U型序列及其相應的互補體的設計。標記分子，例如ECL或熒光，可以摻入到U型序列中(或者其可以如上所述并入到擴增子中)。該實施方案將在表面上產生三維結構，產生更高信號密度的更小特征，其允許表面上擴增子的更為容易地成像。實施例實施例1：用于近端連接和滾環(huán)擴增的一般方案通過如下添加近端探針1和2修飾針對靶分析物的一對檢測抗體：對100uL緩沖液中的200ug第一檢測抗體，添加在150mM磷酸鹽緩沖液中稀釋的1.74uL23mM磺基-SMCC，且在室溫溫育30分鐘。通過大小排阻層析除去游離的磺基-SMCC。檢測抗體的最終濃度為2mg/mL或稍微更低。將九十五(95)uL的300uM用硫醇修飾的寡核苷酸(近端探針1和2)用5uL的100mM磷酸鹽緩沖液中1mMDTT，0.5mMEDTA，pH8.4在室溫還原1小時。近端探針1和2的序列為：硫醇修飾的近端探針1:SH-AAAAAAAAAAGACGCTAATAGTTAAGACGCTTUUU(SEQIDNO:1；其中3個U殘基為2’O-甲基RNA)硫醇修飾的近端探針2:SH-AAAAAAAAAATATGACAGAACTAGACACTCTT(SEQIDNO:2)。除去過量的磺基-SMCC和DTT，例如通過使用三次旋轉柱分離，并合并抗體和DNA用于共價綴合。將溶液在室溫溫育1小時伴隨混合。純化抗體-近端探針綴合物，例如通過大小排阻層析以除去未綴合的抗體和寡核苷酸。將MSDMULTI-板用適宜的封閉溶液封閉1小時并清洗。板上的每個結合域包含捕捉抗體和錨定模塊(固定化為BSA-寡核苷酸綴合物，選擇寡核苷酸為特異于滾環(huán)擴增子)。本實施例中使用的錨定寡核苷酸的序列為5’-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAAAAAAAAAAAA-/3ThioMC3-D/-3’(SEQIDNO:3)。對每個孔添加二十五(25)μl的每種測定稀釋劑和校正物，或樣品(按適宜的稀釋)(產生50ul總體積)。將板伴隨振動溫育1-3小時并清洗每個孔。將如上文描述制備的用近端探針1和2標記的檢測抗體的溶液添加到每個孔(25uL每孔)，并伴隨振動溫育1-2小時(或者，每一種檢測抗體可以序貫添加，每次添加后是1小時溫育)。對每個孔添加包含以下組分的連接混合物：(i)環(huán)化寡核苷酸1(4nM),環(huán)化寡核苷酸2(4nM),連接緩沖液,ATP(1mM),T4DNA連接酶(0.15U/uL)，其中每種環(huán)化寡核苷酸為：環(huán)化寡核苷酸1：磷酸根-CTATTAGCGTCCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTAGAGCAGCCGTCAAGAGTGTCTA(SEQIDNO：4)。環(huán)化寡核苷酸2：磷酸根-GTTCTGTCATATTTAAGCGTCTTAA(SEQIDNO：5)。將板與連接混合物在室溫溫育30分鐘，清洗以除去過量的環(huán)化寡核苷酸，并在37C與RCA混合物溫育1.5小時，其中所述RCA混合物含有RCA緩沖液,dNTP(各250uM),Phi29DNA聚合酶(0.125U/ml)。清洗板和添加檢測探針的混合物并在37C溫育30分鐘，其中檢測探針混合物包含：20mMTris,1mMSDTA,250mMNaCl,0.01％Triton,BSA(200ug/ml),Tween20(0.05％),檢測探針(6.25nM)。檢測探針為序列CAGTGAATGCGAGTCCGTCT(SEQIDNO:6)。為了摻入電化學發(fā)光標記物SULFO-TAG(MesoScaleDiagnostics)，檢測探針合成為具有末端生物素標記物且與用SULFO-TAG標記的鏈霉親合素預結合。清洗板并用150μlMSD讀數(shù)緩沖液填充且立即在MSD6000讀數(shù)器上讀數(shù)(板和讀數(shù)器由MesoScaleDiscovery,Rockville,MD提供)。使用此一般性規(guī)程來檢測以下分析物：肌鈣蛋白I、Akt(總)、磷酸-Akt(473)、磷酸-Akt(308)、流感A核蛋白(NP)、IL-12p40、IL-12p70、Abeta1-42，使用TNFalpha模式系統(tǒng)的橋接和同種型分析(bridgingandisotyping)Ig測定，使用乙肝表面抗原的橋接和同種型分析Ig測定，和使用LymeC6的橋接和同種型分析Ig測定。相對于標準夾心免疫測定在ECL信號和測定靈敏性中的增加在測定法之間變化，但觀察到高達100倍的改進。對于測試的某些測定，例如肌鈣蛋白-I、Akt(總)、IL-12p40、IL-12p70和Abeta1-42，錨定模塊的存在改進了信號和/或稀釋線性，其通過防止擴增步驟期間檢測復合物的解離。根據(jù)上述規(guī)程進行的IL-10測定的校正曲線顯示于圖9。另外，表2(下面)顯示根據(jù)上述規(guī)程進行的一組代表性測定的LOD(第2列，“3-ABRCA/PLA測定”)相對于來自MesoScaleDiagnostics(MSD),Rockville,MD，www.mesoscale.com(第3欄，“MSDV-Plex2-AB免疫測定方案”)的標準兩抗體免疫測定方案的LOD。表2.實施例2.有和無錨定試劑的測定方案如上文實施例1描述的將MSD7-spotMULTI-SPOT板各用肌鈣蛋白I捕捉抗體(220ug/mL)包被。將捕捉抗體在有或無錨定模塊BSA的情況下共打點(co-spotted)，BSA共價附接有特異于擴增子的寡核苷酸(5ug/mL錨定物，若存在的)。對每個孔添加二十五(25)μl的每種測定稀釋劑和校正物，或樣品(按適宜的稀釋)(總共50ul)。將板伴隨振動溫育2小時并清洗每個孔。將如上文描述制備的用近端探針1和2標記的檢測抗體的溶液添加到每個孔(25uL每孔)，并伴隨振動溫育1小時。對每個孔添加如在上文實施例1中描述的連接混合物。將板與連接混合物在室溫溫育30分鐘，清洗以除去過量的環(huán)化寡核苷酸，并在37C與RCA混合物溫育1.5小時，如在上文實施例1中描述的。清洗板并添加檢測探針的混合物且在37C溫育30分鐘，如在上文實施例1中描述的。清洗板并用150μlMSD讀數(shù)緩沖液填充且立即在MSD6000讀數(shù)器上讀數(shù)。從板頂部移去MSD電極用于熒光成像并用PBS和蓋片保持濕潤。使用Zyla照相機觀察表面，20x物鏡，2x2面元(binning)，客戶過濾集(customerfilterset)，具有2二次曝光(secondexposure)。如表3(下面)中顯示的，ECL值在存在錨定試劑的情況下高4-5倍，且檢測限低3倍(更靈敏)。表3圖10(a)和(b)顯示具有(小圖(a))和沒有(小圖(b))5ug/mL錨定試劑的板表面的熒光顯微鏡圖像。該圖像顯示與個體結合事件有關的亮熒光點，且確認了在存在錨定試劑的情況下RCA擴增對于生成可觀察的結合事件更有效率。實施例3.一種相對于兩種連接子寡核苷酸的比較使用具有一個連接位點以形成環(huán)狀模板的單一線性連接子寡核苷酸而不是具有兩個分別的連接位點的兩種連接子寡核苷酸重復實施例2中描述的測定。如圖11(a)中顯示的，制備單一線性連接子寡核苷酸，其在連接位點1或連接位點2處打開。使用實施例1和2中使用的寡核苷酸Circ-1和Circ-2的組合，并排測試兩種單一線性連接子寡核苷酸。采用實施例2中描述的方案，另外，以三種濃度測試該單一線性連接子寡核苷酸：125nM、62.5nM和31nM，而以125nM測試使用Circ-1和Circ-2寡核苷酸的組合的標準測定。如圖11(b)中顯示的，將兩種單一線性連接子寡核苷酸以大致相同的效率成功地摻入RCA擴增產物中作為兩部分連接子寡核苷酸混合物(Circ-1和Circ-2)?；谛盘枏姸?、非特異性背景和總體靈敏性，在連接位點1打開的單一線性連接子寡核苷酸具有與兩部分連接子混合物可比的性能。如預期的，在連接位點2打開的單一線性連接子寡核苷酸具有更高的非特異性背景和更低的靈敏性。在后一情況中，連接和引發(fā)兩者均僅依賴于近端探針#1的存在；因此失去了近端擴增辦法的一些特異性益處。實施例4.使用備選的近端探針、錨定寡核苷酸和連接子序列進行的三抗體測定使用實施例1中列出的方案進行測定，其使用下列備選的試劑組：表4下表5中的結果針對肌鈣蛋白測定，其中肌鈣蛋白的濃度為500pg/mL且MULTI-SPOT板的每個孔包含一個捕獲點，其具有來自表4中列出的組之一的錨定寡核苷酸。測定使用一種近端探針(1)和一種近端探針(2)，以與實施例1中描述的相同的濃度。組(a)-(c)的非特異性結合更高，因為它們相比于實施例1中描述的濃度具有高9倍的檢測寡核苷酸-SA-STAG濃度。檢測寡核苷酸-SA-STAG的更高濃度來自于對預結合的復合物總體的滴定，而非對單獨SA-STAG的滴定，如實施例1中的。表5.PLA組(a)(b)(c)實施例1肌鈣蛋白178,560138,540189,166273,261無肌鈣蛋白41231454588實施例5.在另外的免疫測定平臺上進行的三抗體測定(a)使用編碼顆粒的基于珠的免疫測定形式所有測定步驟均在96孔過濾板中進行。用真空歧管(不超過10In.的Hg)從板除去液體。從不翻轉板。如果發(fā)生堵塞，使用15ml錐形管的尖端以輕柔按壓堵塞孔下面的區(qū)域，然后使用1mlPasteur吸耳球(pipetterubberbulb)或將拇指放在堵塞孔上以通過生成壓力除去堵塞。在最后吸出步驟后，在一堆紙巾上輕敲板底部，然后用Kimwipe輕擦過濾板底部以除去殘余液體/液滴。清洗溶液制備：通過將20x工作洗滌液瓶的全部內容物用285ml去離子水稀釋來制備1x工作洗滌液。測定標準制備：在100％測定稀釋劑(血清和血漿樣品)或50％測定稀釋劑/50％組織培養(yǎng)基(組織培養(yǎng)上清)中重建凍干標準；重建體積：(i)1管形瓶：1ml；(ii)2管形瓶：0.5ml每管形瓶。在室溫再水合8-10分鐘。輕柔顛倒管形瓶幾次和允許管形瓶再放置3-5分鐘以確保完全水合。如果使用超過1種標準，組合等體積的每種標準并輕柔混合。實施重建標準的3倍系列稀釋以制備七點標準曲線。分析物捕獲：(1)渦旋(30sec)和超聲處理(30sec)10x捕獲珠儲液。在箔包裹的管中，將10x捕獲珠儲液(2.5μl每孔)在工作洗滌液(WorkingWashSolution)(25μl每孔～2,000至5,000珠/測定)中稀釋。對于更高的多重化，調整工作洗滌液的體積以適應保留的10x捕獲珠儲液的額外體積。(2)用200μl的工作洗滌液預濕潤標準和樣品孔。(3)渦旋(30sec)和超聲處理(30sec)稀釋的捕獲珠溶液。立即向每個測定孔添加25μl，接著是200μL的1x洗滌液。用200μL的工作洗滌液抽吸和重復清洗。按需要輕敲和輕擦過濾板的底部。(4)對所有測定孔添加50μl的溫育緩沖液。(5)將100μl標準添加到指定孔中。對于指定用于樣品的孔，添加50μl測定稀釋劑接著是50μl樣品。覆蓋板和在定軌式板振動器上(500-600rpm)室溫溫育板2小時。在所有溫育期間用不透明蓋覆蓋測定板以避光。根據(jù)定軌振動器的半徑可能需要調整速度。分析物檢測(6)制備熒光標記的檢測抗體的1x混合物：在稀釋劑(100μl每孔)中稀釋10x檢測抗體混合物(10μl每孔)?；旌衔锇禺愑谀康姆治鑫锏囊粚z測抗體，一種用AlexaFluor350(藍色熒光標記物)標記，另一種用AlexaFluor594(紅色熒光標記物)標記(這些熒光標記物的每種可獲自LifeTechnologies,GrandIsland,NY,www.lifetechnologies.com)。對于更高的多重化，調整稀釋劑的體積以適應需要的10x抗體混合物儲液的額外體積。用200μL的工作洗滌液抽吸和清洗測定孔兩次。向每個測定孔添加100μl稀釋的檢測抗體混合物。覆蓋板并在板振動器(500-600rpm)上溫育1小時。測定讀數(shù)(8)用200μl工作洗滌液抽吸和清洗測定孔3次。用干凈紙巾干燥過濾板的底部以完全除去所有殘余液滴。向每個測定孔添加100μl工作洗滌液并將板置于板振動器(500-600rpm)上2-3分鐘。(9)在多色熒光顆粒分析儀(如FACS系統(tǒng)或改動的xMAP儀)中分析珠懸液，該分析儀包含針對每種熒光標記物的顏色通道。為了最大靈敏性，測定在以下條件下運行，其中任何顆粒可能具有僅0個或1個結合的分析物且通過對顆粒數(shù)目計數(shù)來對分析物的量定量，所述顆粒特異于包含兩種熒光標記物的給定分析物(基于顆粒編碼)。任選地，可在多重形式中運行測定，其使用編碼珠和針對每種分析物的另外的檢測抗體對，其中編碼指示珠上捕獲抗體的分析物特異性。在確定編碼時，如使用摻入珠中的另外熒光色在xMAP中的，分析儀應具有另外的檢測通道用于測量另外的顏色并鑒定珠編碼。(b)使用包含錨定部分的編碼顆粒，使用用核酸探針修飾的兩種檢測試劑的基于珠的免疫測定形式如實施例5(a)中所述的，所有測定步驟在96孔過濾板中進行。清洗溶液和測定標準如實施例5(a)中描述的制備，且如實施例1中描述的通過添加近端探針1和2修飾針對靶分析物的一對檢測抗體。分析物被捕獲到捕獲珠上，如實施例5(a)中描述的。捕獲珠包含錨定模塊，固定化于珠表面為BSA-寡核苷酸綴合物，其中寡核苷酸選擇為特異于滾環(huán)擴增子。使用的錨定寡核苷酸的序列為SEQIDNO：3。將二十五(25)μl的測定稀釋劑、校正物、或樣品(按適宜的稀釋)與捕獲珠的混合物混合。將混合物伴隨振動溫育1-3小時并清洗。將如上文描述制備的用近端探針1和2標記的檢測抗體的溶液添加到混合物，并伴隨振動溫育1-2小時(或者，每一種檢測抗體可以序貫添加，每次添加后是1小時溫育)。添加如實施例1中描述的連接混合物。將該混合物與連接混合物在37C溫育30分鐘，清洗以除去過量的環(huán)化寡核苷酸，并在37C與RCA混合物溫育1.5小時，其中RCA混合物在上文實施例1中描述。清洗混合物，添加熒光素-經標記檢測探針的混合物并在37C溫育30分鐘，其中所述檢測探針混合物在上文描述。清洗混合物并將顆粒抽吸到多通道熒光顆粒分析儀中。(c)基于珠的形式和將捕獲分析物分子分到各個納米孔中樣品在100ul25％牛血清(2-4倍稀釋)中制備，且將用捕獲抗體包被的500K珠(順磁2.7um，任選地熒光編碼地)添加到樣品中。將樣品在23℃溫育約2hr。將樣品用PBS(5X，0.1％Tween-20)清洗3次，且添加經標記檢測抗體的混合物(包含第一生物素化的檢測抗體和綴合有半抗原的抗體的混合物)。將混合物在23℃溫育約1hr。將混合物用PBS(5X，0.1％Tween-20)清洗3次，添加酶標記物，還添加鏈霉親合素-beta-半乳糖苷酶(40pM)，抗半抗原綴合的酶，并將混合物在23℃溫育約30min(或在Simoaanalyzer中3min)。將混合物用PBS(5X，0.1％Tween-20)清洗七次并添加酶底物15ul的試鹵靈-beta-d-半乳吡喃糖苷(100uM，在加載緩沖液中)。引導混合物通過納米孔的陣列(由Quanterix以DVD形式提供，從cyclicolefin聚合物制備，具有24-樣品每盤)，允許放置約2分鐘。將陣列用緩沖液沖洗，陣列用氟碳油密封，在23℃溫育2-5min，并在多色熒光成像儀上讀出結果。使用圖像分析來對含有兩種熒光酶產物的納米孔的數(shù)目計數(shù)，由此提供與樣品中分析物的濃度相關的值。(d)流動池分析的基于珠的免疫測定形式第一溫育：10ul樣品，生物素化的分析物特異性單克隆捕獲抗體(工作溶液為2.6mg/l)，和各綴合于寡核苷酸的分析物特異性單克隆抗體的混合物(工作溶液為0.3mg/l)反應以形成夾心復合物。分析物特異性單克隆抗體的混合物如實施例1中制備，且該混合物包含綴合于近端探針1和2的一對抗體，如上文實施例1中描述的。第二溫育：在添加用鏈霉親合素包被的微顆粒(DynalM280，2.8um，0.72mg/ml，對生物素的結合能力470ng/mg)后，復合物經由生物素和鏈霉親合素之間的相互作用變得結合于固相。將連接混合物添加到混合物，其中連接混合物依照實施例1中所述方案制備。將該混合物與連接混合物在37C溫育30分鐘，清洗以除去過量的環(huán)化寡核苷酸，并與RCA混合物，如實施例1中描述的。清洗混合物和添加用生物素標記的檢測探針的混合物，并在37C溫育30分鐘，其中檢測探針混合物如實施例1中所述制備。為了摻入電化學發(fā)光標記物SULFO-TAG(MesoScaleDiagnostics)，檢測探針合成為具有末端生物素標記物且與用SULFO-TAG標記的鏈霉親合素預結合。將反應混合物抽吸到測量孔，該處微顆粒被磁性捕獲到電極的表面上。然后用ProCell(含TPA的緩沖液)除去未結合的物質。然后對電極應用電壓誘導化學發(fā)光發(fā)射，對此通過光電倍增管測量。結果經由儀器特異地由2點校正生成的校正曲線和經由試劑條形碼提供的主曲線(mastercurve)測定。實施例6.HIV-1P24的檢測材料、方法和結果：將實施例1中描述的規(guī)程用于檢測HIV-1p24。從混合HIV-1的滴定性能組(可獲自SeracareLifeSciences,www.seracarecatalog.com)、HIV-1血清轉化組(也可獲自SeracareLifeSciences)、HIV抗體陽性樣品(可獲自ProMedDx,LLC,www.promeddx.com)、和正常匹配的樣品(可獲自Bioreclamation,www.bioreclamation.com)測試約64份血清或血漿樣品。依照上文所述規(guī)程進行的HIV-1p24測定的校正曲線顯示于圖12。發(fā)現(xiàn)測定的LOD為1.3fg/mL，LLOQ為3.0fg/mL且ULOQ為37,500fg/mL。對于25uL樣品1.3fg/mL的檢測限對應于約650個p24分子，且每個病毒顆粒(分子)產生約2000個p24蛋白拷貝?；旌系牡味ㄐ阅芙MPRA204(B)由具有通過商品化測定法(bioMerieux、PerkinElmer和Zeptometrix)對HIVp24抗原的反應性范圍從較弱到較強陽性的10份標本的組組成。將兩份陰性的標本包含在該組中。測定的結果顯示于下表6：表6.對于大多數(shù)樣品，HIVp24水平較高且高于ULOQ。所有10份陽性樣品均為可檢測的且與商品化的p24試劑盒是可比的，而陰性樣品(基于商業(yè)測定法，分別為PRA204(B)-10和-20)相當?shù)?，分別為約3和2fg/mL。血清轉化組的分析結果顯示于圖13。發(fā)現(xiàn)3抗體測定形式與PCR一樣靈敏且第一陽性樣品的檢測前時間中估測的延遲和來自PRB948和PRB962組的兩種樣品中的p24水平與PCR試劑盒可比，且比其他商業(yè)p24測定性能更好。數(shù)據(jù)顯示于表7。表7.AbbottBBI指AbbottBBIHIV-1抗原測試。CoulterBBI指CoulterBBIHIV-1抗原測試。DuPontBBI指DuPontBBIHIV-1抗原測試。Inno.指InnogeneticsR129HIV-1抗原測試。RochePCR指RochePCRHIVRNABBItest。Coulter指CoulterELISAHIV-1抗原測試。PE指PerkinElmerELISAHIV-1抗原測試。Zepto.指ZeptometrixELISAHIV-1抗原測試。RocheUltra指RocheUltrasensitiveHIV-1RNA測試。Rochestandard指theRochestandardHIV-1RNA測試。BLD＝低于檢測限和NT＝未測試。結論：新近感染HIV的患者不成比例地促進該疾病的傳播。病毒負載在感染后頭幾周較高，而且新感染的患者不太可能知曉他們被感染且可能將疾病傳給他人。因此，對急性HIV感染的早期檢測對于公共健康具有極大重要性。PCR方法就靈敏性而言是金標準；它們能檢測少至60個HIVRNA拷貝每mL血清或血漿(30病毒顆粒每mL)。然而，PCR技術是復雜且昂貴的，因此不適用于所有背景。免疫測定法是更簡單和便宜的，但目前第4代p24免疫測定法的檢測限僅為約10pg/mL，或約250百萬殼體蛋白質每mL。在按病毒的基礎上，這些免疫測定法比PCR測試靈敏性低幾千倍，盡管事實上有約2,000p24個殼體蛋白質每病毒。如本文描述的，開發(fā)了基于MSD的MULTI-技術的下一代電化學發(fā)光測定形式并表征了其性能。這一新的p24免疫測定法的檢測限為約1fg/mL，比目前的p24免疫測定法靈敏10,000倍。1fg/mL的靈敏度對應于我們25uL的樣品體積中低于1個病毒顆粒。定量的下限和上限分別為3fg/mL和38,000fg/mL。板內CV為7％，且總CV為15％。加標回收(Spikerecovery)和稀釋線性為80％至120％。p24在32名明顯健康的供體的血清或血漿中未檢出?；旌蟨24的滴定組顯示3-ABHIVp24測定與商業(yè)p24免疫測定之間的較好相關性。測試了兩個血清轉化組：SeraCarePRB948(第0和18天，PCR陰性；第22和23天，PCR陽性)和PRB962(第0和2天，PCR陰性；第7、9、14和17天，PCR陽性)。在兩種情況中，3ABHIVp24測定結果對于所有PCR陰性樣品為陰性且對于所有PCR陽性樣品為陽性，且感染在常規(guī)p24免疫測定之前很早就檢測到。結論是，本文中描述的3-ABHIVp24免疫測定比目前的p24ELISA的限度靈敏10,000倍，且與PCR測定的靈敏性是可比的。該測定法不需要專門的設備且可在MESOTMQuickPlexSQ120和成像儀上運行。實施例7.分析物的濃縮，隨后是3-ABRCA/PLA測定(a)實驗條件顯示于如下表8(a)中：表8(a).對于捕獲相對短的寡核苷酸近端探針序列(例如9-13個核苷酸長)而言，制備與近端探針序列的一部分互補的捕獲寡核苷酸并在3’末端生物素化。表8(b)顯示了近端探針和捕獲寡核苷酸序列的細節(jié)：表8(b).計算的解鏈溫度示于圖8(c)中：以如下方式制備用捕獲寡核苷酸修飾的珠子：渦旋后，將五十(50)ul的DynalMyOne鏈霉親和素T1珠漿(beadslurry)加入到五個1.5mL的Eppendorf管中，每個具有用于分到兩個結合條件實驗所需的兩倍的量。用1mlDiluent100(獲得自MesoScaleDiscovery，Rockville，MD)洗滌三次珠子，且將1.2mL的每種捕獲寡核苷酸，每種以200pmol/ml的濃度加入到每個小瓶中，所述每種捕獲寡核苷酸溶于含有EDTA的Diluent100中。通過在室溫下旋轉1小時孵育溶液，并向每個管的溶液中摻入溶于含EDTA的Diluent100中的游離生物素至5nmol/mL。通過在室溫下旋轉15分鐘孵育溶液，并用1mL的0.5MNaCl/BSA溶液洗滌珠子三次。將1mL0.5MNaCl/BSA加入管中，混合，且將每個捕獲寡核苷酸-珠子混合物等分到2個小瓶中，總共10個小瓶。從所有小瓶中吸出溶液，并向每個捕獲管中加入1mL溶于0.5M中以及1MNaCl/BSA中的1ug/mL(6.7pmol/mL)PP1(PP1序列，其結合到特異性針對HIVp24的檢測抗體)。將溶液在室溫下旋轉孵育40分鐘。每個管用鹽溶液洗滌三次(不包括捕獲寡核苷酸的對照不洗滌)。將7pg/mL的1mLHIVp24加入到四個管中，而將抗原從儲液中加入到無捕獲物的對照管中。將溶液在4℃下旋轉孵育過夜，并將每個具有捕獲寡核苷酸的管用鹽溶液(各1mL)洗滌三次。將每個管用洗滌緩沖液(0.1XPBS，500mMNaCl，1mMEDTA，0.1％TritonX-100，2mg/mLBSA)充入至1/3，混合，然后將400uL珠子的等分試樣加入到兩個小瓶中用于2種釋放鹽條件，總共18個管。除了沒有捕獲物的對照管之外，從所有小瓶除去洗滌緩沖液，并向管中加入400uL0.0M和10mM鹽緩沖液。將管的內容物混合，且將來自每個管(包括不含捕獲物的對照(beans))的100ul的等分試樣加入到三個基質板中以用于分析三種溫度釋放條件。所述板分別在25C、30C和37C下在熱振蕩器(thermoshaker)中混合5分鐘。磁力分離珠子，且將25uL的上清液加入到測定板的孔中，所述板加入有包括mIgG的5uL6XPBS(每個條件三個重復)。將板在室溫下振蕩溫育1小時，并在PBS緩沖液中洗滌三次。如實施例1所述，每個位于板上的結合域包括捕獲抗體和錨定部分，并且在孵育步驟之后，在每個結構域上形成復合物，其包括結合抗原的抗體，其結合具有PP1序列的檢測抗體(除對照結合域外)。將用PP2(或對于對照的PP1+PP2)標記的檢測抗體的溶液加入每個孔(25uL每孔)中，并震蕩孵育1小時，之后洗滌。如實施例1所述，將連接混合物添加到每個孔并將板與連接混合物在室溫下孵育30分鐘，洗滌以去除多余的環(huán)化寡核苷酸，并與RCA混合物在37C下孵育1.5小時。洗滌所述板，并加入檢測探針的混合物，并在37C下孵育30分鐘。洗滌所述板并加入150μlMSD讀數(shù)緩沖液(readbuffer)且立即在MSDSECTOR讀數(shù)器上讀數(shù)。該實驗的結果顯示于圖14中。(b)進行另外的實驗以進一步評價分析物的濃縮條件。一般實驗條件描述于表9(a)中：渦旋后，將五十(50)ul的DynalMyOne鏈霉親和素T1珠漿加入到微量離心管。用1mlDiluent100洗滌珠子三次，并將1mL的捕獲寡核苷酸Cap1:9加入到包含EDTA的Diluent100中。溶液在室溫下旋轉孵育1小時，且在向溶液中摻入(spike)游離的生物素至10X過量，所述生物素溶于包含EDTA的Diluent100中。通過在室溫旋轉30分鐘孵育所述溶液，并用1mL的洗滌緩沖液洗滌珠子三次。將一(1.0)mLPP1加入到結合緩沖液中，且在溶液室溫下旋轉孵育40分鐘。用洗滌緩沖液洗滌所述管三次，且將1mLDiluent2加到珠子，混合，且所述珠子溶液被分配到12個管中用于抗原水平2-4的1X、0.5X、0.25X、和0.125X珠子-PP1濃度。將珠子-PP的所需體積轉移到對照管。將HIVp24和Diluent2以所需的抗原和珠子-PP的終濃度加入到珠子溶液中，且總體積為5mL。加入(spike)無珠子對照管以包括僅1X濃度的游離的PP1和所有4種水平的抗原在4℃旋轉過夜孵育所述管，并通過每次轉移1mL的方式將5mL珠子緩沖液轉移至1.5mLEppendorf管。用洗滌緩沖液洗滌每個管(洗滌三次)。不洗滌不含珠子的對照管。第三次洗滌后，將100uL的0鹽緩沖液加入到測試管，并將500uL的0鹽緩沖液加入到對照管，并將管在25℃下孵育6分鐘。將上清液轉移至測定板，并如實施例7(a)中那樣分析。所述結果示于表9(b)-(c)中：表9(b)：表9(c)：在用磁珠分析物濃縮后觀察到信號增加約50倍。非濃縮樣品#1顯示與對照#1信號相似的結果，這表明PP-抗原復合物的釋放具有最高的效率。使用分析物預濃縮，實現(xiàn)了低于0.1fg/mL的檢測，其與1病毒粒子/mL病毒載量(viralload)相當。相反，商業(yè)病毒測定可合理地檢測約50個拷貝/mL，相當于25個病毒/mL。具有和不具有用于該實驗的預濃縮的校正曲線顯示在圖15中。實施例8.使用珠子沉降(Settling)方案的3-ABRCA/PLA基于珠子的測定如實施例7所述進行IL-4的3-ABRCA/PLA測定，除了使用二氧化硅珠子(獲得自_____)替代Dynabeads。RCA和檢測溫育在MSD大點多孔測定板(可得自MesoScaleDiscovery，Rockville，MD)中進行，在37℃靜置。所述珠子不包括錨定試劑。在RCA孵育步驟期間，允許珠子通過重力緩慢沉降到孔的表面上，取決于溶液體積，大約沉降時間為5-8分鐘。通過在搖擺斗離心機(swingingbucketcentrifuge)中旋轉板來洗滌所述板。初步測試表明，在旋轉后珠子均勻分散，只有很小的梯度穿過孔表面。用15對(vs.)90分鐘的RCA孵育測試所述方案。發(fā)現(xiàn)了與磁力捕獲相比，使用珠沉降方案的15分鐘RCA孵育后測定的靈敏度和動態(tài)范圍提高約10倍。使用90分鐘的RCA孵育步驟進一步改善靈敏度(高達約50-100倍)?；蛘?，如本文所述進行3-ABRCA/PLA測定，其中珠子包括錨定試劑，并在連接步驟期間加入封閉劑(約2.5mg/ml)以減少非特異性結合。可以使用多種封閉劑，包括但不限于，mBSA、剪切的多聚(A)、多聚BSA-I、mIgG、Tween、多聚BSA-II、酵母RNA、mBSA+多聚(a)，和/或多聚BSA+多聚(A)。實施例9.修飾的橋接免疫測定形式如上所述，實施例1中所述的方法用于使用TNFalpha模型系統(tǒng)的橋接和同種型Ig測定，使用HepB表面抗原的橋接和同型Ig測定，以及使用LymeC6的橋接和同種型Ig測定。對該程序的修改如圖19所示，其中使用如下檢測自身抗體(1901)：(i)PP2修飾的抗人Ig抗體(1902)，和(ii)PP1-標記的自身抗原(1903)，之后進行如實施例1所述的PLA-RCA。示于圖19的形式還顯示了使用靶向部分(1904)及其與自身抗原結合的互補體(1905)作為將捕獲部分(在這種情況下為自身抗原)粘附到表面(1906)的手段。同樣地，可以如實施例1所述進行抗體(例如自身抗體)的免疫測定，其中該抗體的抗原用作捕獲部分(直接附接到表面或通過靶向部分及其互補體)，且兩種檢測物種是附接于PP1的同種型抗體，和附接于PP2的抗原(反之亦然)。形成夾心復合物，然后如實施例1所述的PLA-RCA。這些修飾的測定形式還可以包括錨定部分，以將擴增子粘附到表面。實施例10.用于產生接近連接滾環(huán)模板的生物合成方法可以生物合成生成接近連接滾環(huán)模板。該方法利用最初高度純化和良好表征的模板，以在有效的基于溶液的連接和RCA反應系列中產生RCA產物。該方法也可以在珠子上進行以增強反應的選擇性。在種子RCA模板的擴增后，使用獨特的限制酶與短的合成序列組合對單鏈產物進行位點特異性切割。因此，RCA模板從其自身產物產生。對生物合成產生的RCA模板進行HPLC或凝膠純化以產生包含100％正確的5’和3’末端的產物。該方法示于圖20(a)中。該方法需要在RCA模板中添加限制性位點以在所需的連接位點處引導切割。限制酶，例如那些切割從距離限制性位點14-20個堿基的酶是優(yōu)選的?；蛘?，也可以使用該方法與來自M13噬菌體的單鏈DNA或類似物組合以毫克量產生單鏈模板。該方法可以避免進行RCA模板的基于RCA的擴增的需要，僅需要將模板克隆到M13載體中用于DNA的產生產。這在圖20(b)中示出。實施例11.樣品多重化(Multiplexing)本文所述方法用于基于使用光譜簽名的多重化樣品。多重化樣品為使用者提供了進行內部校正和對照、降低成本和增加通量的能力。通過基于空間和光譜簽名的獨特簽名(該分析物的編碼)的對分析物進行多重化的能力也可以用于多重化樣品。使用成像擴增產物的熒光染料比率編碼(fluorescentdyeratiecoding)來多重化樣品。對于樣品中的每種分析物，使用能夠產生獨特的滾環(huán)產物的一組獨特的測定試劑，每種可以用獨特的檢測寡核苷酸檢測。一組獨特的測定試劑的合成和使用可以根據(jù)描述的方法，例如實施例1中所述的方法進行。如圖21所示，將含有感興趣分析物的每個樣品A和B與特異于該分析物的兩種檢測抗體孵育，每種具有獨特的近端探針。該孵育步驟將一組獨特的近端探針與該樣品中的分析物連接，從而與分析物形成雙抗體復合物并“編碼(coding)”樣品。在該溫育后，合并編碼樣品，作為混合物加入到單個捕獲抗體表面，孵育并洗滌。在洗滌步驟之后，加入捕獲的三抗體復合物、用于每組近端探針的線性滾環(huán)模板，并使混合物進行如實施例1所述的雜交條件。連接該混合物以產生滾環(huán)模板、洗滌、進行滾環(huán)擴增，和洗滌。每個滾環(huán)擴增子與互補且獨特的檢測寡核苷酸雜交，所述檢測寡核苷酸用基于兩種或更多種熒光標記比例的獨特的光譜特征編碼。在檢測探針雜交后，對測定表面進行成像，并且基于其光譜特征(例如2種或更多種熒光標記物的比率)對每個滾環(huán)產物進行解碼，并計數(shù)。這允許確定多個樣品中的分析物水平。使用這種方法，用戶可以組合樣品和分析物多重化，允許在測試和對照樣品中同時測試多種分析物。實施例12.脂蛋白復合物的檢測本文所述的方法用于檢測和定量存在于脂蛋白復合物(例如HDL和LDL)中的蛋白質復合物組。例如，使用實施例1中描述的方法，在脂蛋白復合物內檢測三種不同的蛋白質和/或表位，并因此可以分析患者脂蛋白內的蛋白質譜。在人體中，血液脂蛋白分為5個主要組，HDL、LDL、IDL、VLDL和乳糜微粒。其中，HDL和LDL級分作為心血管健康的風險標志物已經獲得了最多的臨床興趣。這些關鍵脂蛋白由多種蛋白質和脂質的復合物組成。與這些脂蛋白相關的蛋白質由對其功能構成所必需的蛋白質以及乘客蛋白(passengerproteins)組成。這些脂蛋白也可以進行修飾，例如氧化，其修飾個體的風險特征(profile)。例如，較高水平的氧化HDL和LDL與不良心血管事件的風險增加相關。LDL通常由兩種核心蛋白Apo(a)和ApoB以及脂質組成。升高的Apo(a)與心臟病的風險增加相關；此外，Apo(a)蛋白的長度變化也與改變的風險特征相關。Apo(a)蛋白的尺寸由于尺寸多態(tài)性而不同，這是由LPA基因中可變數(shù)目的所謂的kringle重復引起的。LDL顆粒中的ApoB攜帶配體，其針對各種組織中的LDL受體。高水平的ApoB也與斑塊形成相關，導致心血管疾病。HDL通常由一組核心蛋白組成，包括；ApoA1、ApoE、ApoC和ApoA-II。除了這些核心蛋白，還已知HDL與也具有臨床價值的另外的蛋白質相關。例如，HDL相關的SAA和SP-B已經被證明與心臟事件和死亡率相關。通過升高的ApoA-II的HDL組成的變化也已經與致動脈粥樣硬化風險相關。下列步驟描述于圖1中，用于脂蛋白復合物的多重化接近測定如圖22所示進行。圖22例示了HDL脂蛋白復合物的檢測，其中對每種核心蛋白特異性的捕獲抗體固定到表面以將脂蛋白復合物結合到表面。添加對其他核心蛋白特異性的檢測抗體，每種檢測抗體帶有近端探針。如實施例1中所述完成測定。本發(fā)明在范圍上不受本文描述的具體實施方案的限制。事實上，除了本文描述的那些以外的對方法的多種修改將是本領域技術人員從前述說明和所附附圖來看明顯的。這類修改意圖落入權利要求的范圍內。本文中引用了多種出版物，其公開內容通過提述完整并入本文。參考文獻1.美國專利No.7,306,9042.美國專利No.7,320,8603.美國專利No.7,351,5284.美國專利No.7,192,7035.美國專利No.6,878,5156.Zhou等,GenomeBiology(2004),5:R287.Dean等,GenomeResearch(2001),11:1095-10998.Soderberg等,Methods(2008),45:227-2329.Fredriksson等,NatureBiotech(2002),20:473-47710.Fredriksson等,NatureMethods(2007),4(4):327-32911.Vincent等,EMBOReports(2005),5(8):795-80012.Gajadjar等,Biotechniques(1010),48(22):145-15213.Schallmeiner等,NatureMethods(2007)4(2):135-13714.Ericsson等,Nucl.AcidsResearch(2008),36(8):e4515.Darmanis等,Biotechniques(2007),43:443-45016.Dahl等,Proc.Natl.Acad.Sci.(2004),101(13):4548-455317.Weibrecht等,ExpertRev.Proteomics(2010),7(3):401-40918.Spits等,NatureProtocols(2005),1(4):1965-197019.Nordengrahn等,Vet.Microbio(2008),127:227-23620.Vuoriluoto等,Mol.Oncology(2011),5:105-11121.Zhang等,ClinicaChimicaActa(2006),363:61-7022.Andras等,Mol.Biotech.(2001),19:29-4423.Schweltzer等,Proc.Natl.Acad.Sci.(2000),97(18):10113-1011924.Jeong,等,Cell.Mol.LifeSci.(2009),66:3325-333625.Gill等,Nucleosides,Nucleotides,andNucleicAcids(2008),27:224-24526.Gullberg,等,CurrentOp.inBiotech.(2003),14:82-8627.Gustafsdottir,等,ClinicalChemistry(2006),52(6):1152-116028.美國專利公開No.2010007586229.美國專利No.8,222,04730.美國專利No.8,236,57431.美國專利No.8,338,77632.美國專利公開No.2011021253733.美國專利公開No.2012019677434.美國專利公開No.2012028942835.Kopecky,C.,等,Clin.J.Am.Soc.Nephrol.2014Nov.2536.Watanabe,J.,等,ArthritisRheum.2012Jun；64(6):1828-3737.Ribas,V.,等,Circ.Res.2004Oct.15:95(8):789-97序列表<110>中尺度技術有限責任公司<120>改進的測定方法<130>31085<150>61/993,581<151>2014-05-15<150>62/013,823<151>2014-06-18<150>62/048,489<151>2014-09-10<150>62/049,520<151>2014-09-12<150>62/055,093<151>2014-09-25<160>22<170>PatentInversion3.5<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>Thiol-修飾的近端探針1<220><221>修飾的堿基<222>(33)..(35)<223>um<400>1aaaaaaaaaagacgctaatagttaagacgcttuuu35<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>Thiol-修飾的近端探針2<400>2aaaaaaaaaatatgacagaactagacactctt32<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>錨定寡核苷酸<400>3aagagagtagtacagcagccgtcaaaaaaaaaaaa35<210>4<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-1<400>4ctattagcgtccagtgaatgcgagtccgtctaagagagtagtagagcagccgtcaagagt60gtcta65<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-2<400>5gttctgtcatatttaagcgtcttaa25<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>檢測探針<400>6cagtgaatgcgagtccgtct20<210>7<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>檢測寡核苷酸<400>7acatcggtagtt12<210>8<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸<220><221>polyA_位點<222>(1)..(10)<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>gm<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(36)<223>um<400>8aaaaaaaaaacactaagctgttagtccattaccguuu37<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸2<220><221>polyA_位點<222>(1)..(10)<400>9aaaaaaaaaagctggaggttcagacgattttgcg34<210>10<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-1a<400>10aacagcttagtgacatcggtagttaacagattgatcttgacacatcggtagttcgcaaaa60tcgtc65<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-2a<400>11tgaacctccagctttcggtaatggact27<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>錨定寡核苷酸<400>12acagattgatcttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa35<210>13<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸1<220><221>polyA_位點<222>(1)..(10)<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>tm<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(36)<223>um<400>13aaaaaaaaaaagagtccagaggcaaagcgtgaatuuu37<210>14<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸2<220><221>polyA_位點<222>(1)..(10)<400>14aaaaaaaaaagataaggaaggggccttagcgaca34<210>15<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-1b<400>15cctctggactctacatcggtagtttggaacattttattctaacatcggtagtttgtcgct60aaggc65<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-2b<400>16cccttccttatctttattcacgctttg27<210>17<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>錨定寡核苷酸<400>17ggaacattttattctaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa35<210>18<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸1<220><221>polyA_位點<222>(1)..(10)<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>tm<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(36)<223>um<400>18aaaaaaaaaaaacaactccgattgcttgcttcttuuu37<210>19<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸2<220><221>polyA_位點<222>(1)..(10)<400>19aaaaaaa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