針對(duì)TSH受體的自身抗體的檢測(cè)的制作方法

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>測(cè)量裝置的制造及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及能夠在診斷自動(dòng)裝置上施行的用于檢測(cè)針對(duì)甲狀腺激素受體的自身抗體或自身免疫抗體的方法，和至少部分地由包含TSH受體的細(xì)胞外部分的蛋白質(zhì)形成的且固定在順磁性顆粒上的TSH受體嵌合體在橋式測(cè)定法中與另外一個(gè)TSH受體一起在這樣的方法中的用途，以及經(jīng)修飾的TSH受體嵌合體。

發(fā)明的技術(shù)背景

TSH受體(TSH-R)對(duì)于甲狀腺細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能起著關(guān)鍵作用。該受體是G蛋白偶聯(lián)糖蛋白受體亞家族的成員，該亞家族此外還包括關(guān)于黃體生成素/絨毛膜促性腺激素的受體(LH/CGR)和關(guān)于促卵泡激素的受體(FSHR)。該亞家族的受體具有大的N-末端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，其對(duì)于配體結(jié)合具有必要意義并且其已顯示參與信號(hào)傳遞。TSHR信號(hào)的傳遞主要通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶的激活來(lái)介導(dǎo)，這導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的升高。

對(duì)于TSH受體的巨大興趣的一部分歸因于其在伴隨有針對(duì)TSH受體的自身抗體出現(xiàn)的甲狀腺自身免疫疾病中作為首要自身抗原的作用。這樣的甲狀腺自身免疫疾病包括巴澤多病(一種導(dǎo)致甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)的自身免疫疾病)，其總體而言屬于最常見(jiàn)的人自身免疫疾病。巴澤多病是由于腺苷酸環(huán)化酶的激活和結(jié)果發(fā)生的cAMP上升而引起的。由此發(fā)生甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺腫形成和可能地眼睛變化。但是針對(duì)TSH受體的自身抗體還可以具有阻斷性特性，并因此阻礙腺苷酸環(huán)化酶和cAMP。在這種情況下，發(fā)生甲狀腺機(jī)能減退。在所牽涉的患者中同時(shí)出現(xiàn)刺激性和阻斷性自身抗體同樣是可能的，其中刺激性自身抗體的份額通常占優(yōu)勢(shì)。

為了檢測(cè)此類自身抗體，一段時(shí)間以來(lái)存在這樣的生物測(cè)定法，其中測(cè)量cAMP-增加。該測(cè)量方法是非常耗時(shí)的。此外，該生物測(cè)定法是不可靠的，因?yàn)樗赡芴峁┘訇?yáng)性結(jié)果。在本說(shuō)明書(shū)的范圍內(nèi)，該類型的測(cè)量方法被稱為生物測(cè)定法(Bioassay)以便與用于測(cè)定針對(duì)TSH受體的自身抗體的體外方法劃清界限。在一種在市場(chǎng)上存在有的用于自身抗體的體外檢測(cè)方法中，使用從豬甲狀腺膜中提取的TSH受體(第一代體外方法)。在另一種用于檢測(cè)針對(duì)TSH受體的自身抗體的測(cè)試中，在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)試中使用人的完整的重組TSH受體蛋白(野生型)。

Thyroid,第7卷(1997)867-877描述了在TSH受體上的關(guān)于刺激性和阻斷性自身抗體的表位。大多數(shù)關(guān)于刺激性自身抗體的功能性表位存在于受體蛋白的氨基酸8至168的區(qū)域內(nèi)，和關(guān)于阻斷性自身抗體的那些存在于受體蛋白的氨基酸261至370的區(qū)域內(nèi)。對(duì)于活性測(cè)量，使用上面所描述的生物測(cè)定法。

通過(guò)WO 01/27634 A1，首次提供了用于并行地檢測(cè)具有不同特異性的自身抗體的定量方法，其是快速地可重現(xiàn)的和能夠以高精確性施行的。為此目的，使用TSH受體嵌合體，其與野生型受體的區(qū)別在于，自身抗體所結(jié)合的獨(dú)個(gè)序列被替換為來(lái)自G蛋白偶聯(lián)受體這一類別的另一受體的相應(yīng)序列。除此之外，所述TSH受體嵌合體包含完整的TSH受體。然而，測(cè)量費(fèi)用是高的。通過(guò)離心進(jìn)行分離使得該方法對(duì)于常規(guī)使用來(lái)說(shuō)過(guò)于煩瑣。而且，該測(cè)試必須在冰浴中或在4℃下進(jìn)行，這是因?yàn)樗鯰SH受體嵌合體不是非常穩(wěn)定的。相應(yīng)的技術(shù)指導(dǎo)存在于WO 01/63296 A1中，其中建議使用“夾心”技術(shù)用于進(jìn)行檢測(cè)。然而，已表明，通常在用在那里所建議的測(cè)試材料的情況下，非特異性結(jié)合是過(guò)于高的?；谏厦嫠枋龅倪@兩個(gè)專利申請(qǐng)的知識(shí)的用于檢測(cè)自身抗體的測(cè)試在市場(chǎng)上是不可得的。

WO 00/00590 A1描述了在C-末端處經(jīng)截短的TSH受體，和一般而言，其用于診斷和療法的適合性。WO 2007/036511 A1描述了用于檢測(cè)針對(duì)TSH受體的自身抗體的所謂橋式測(cè)定法，其首次能夠在自動(dòng)裝置上施行。為了進(jìn)行該橋式測(cè)定法，使用兩種TSH受體嵌合體，其中給出信號(hào)的受體嵌合體僅包含TSH受體的細(xì)胞外區(qū)域，而所謂的錨受體嵌合體是全酶。從2014年春天開(kāi)始將會(huì)在世界范圍內(nèi)提供該方法以用于自動(dòng)診斷針對(duì)甲狀腺激素受體的自身抗體，并且該方法在所謂的自動(dòng)裝置上施行。錨受體被結(jié)合在作為固相的直徑為例如大約6mm的塑料顆粒上。

發(fā)明概述

值得期望的是，還在以順磁性顆粒作為固相進(jìn)行工作的全自動(dòng)分析設(shè)備上應(yīng)用WO 2007/036511 A1的方法。用WO 2007/036511 A1的TSH受體嵌合體進(jìn)行的測(cè)試和用僅包含TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的兩種TSH受體進(jìn)行的測(cè)試，均不能使在以順磁性顆粒進(jìn)行工作的全自動(dòng)裝置(例如ADVIA Centaur自動(dòng)裝置或ARCHITECT自動(dòng)裝置)上施行檢測(cè)方法成為可能。

使用兩種細(xì)胞外TSH受體嵌合體(經(jīng)截短的TSH受體嵌合體)作為錨受體和作為信號(hào)受體顯示出對(duì)于施行在WO 2007/036511 A1中所描述的橋式測(cè)定法來(lái)說(shuō)過(guò)低的用于檢測(cè)針對(duì)TSH受體的自身抗體的靈敏度和特異性。用該TSH受體嵌合體群集進(jìn)行的測(cè)量經(jīng)證明是不可重現(xiàn)的，這顯示在實(shí)施例3(比較實(shí)施例)中。

但是極其值得追求的是，提供這樣的用于檢測(cè)針對(duì)甲狀腺激素受體的自身抗體的方法，其具有與在WO 2007/036511 A1中所描述的方法完全相同的精確性和效力，并且此外其在使用順磁性顆粒作為固相的全自動(dòng)裝置上是可能的。

該任務(wù)通過(guò)能夠在診斷自動(dòng)裝置上施行的用于檢測(cè)針對(duì)TSH受體的刺激性自身抗體的方法而得到解決，在所述方法中使患者樣品與結(jié)合在固相上的第一TSH受體嵌合體相接觸以便使在所述患者樣品中可能存在的針對(duì)TSH受體的刺激性自身抗體與所述第一TSH受體嵌合體相結(jié)合，讓所獲得的免疫復(fù)合物與第二TSH受體嵌合體進(jìn)行反應(yīng)以便使在所述患者樣品中可能存在的針對(duì)TSH受體的自身抗體額外地與所述第二TSH受體嵌合相結(jié)合，并且進(jìn)行用于檢測(cè)包含所述自身抗體的免疫復(fù)合物的反應(yīng)，其中使用順磁性顆粒作為固相，所述第一和第二TSH受體嵌合體包含關(guān)于針對(duì)TSH受體的刺激性自身抗體(而非阻斷性或中性自身抗體)的結(jié)合表位且在N-末端處與適合于使TSH受體分泌入細(xì)胞外空間中的蛋白質(zhì)相融合，并且所述第二TSH受體嵌合體包含給出信號(hào)的氨基酸序列或其他給出信號(hào)的標(biāo)記試劑以用于檢測(cè)所形成的免疫復(fù)合物。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的目標(biāo)為TSH受體嵌合體，其在N-末端處與適合于使TSH受體分泌入細(xì)胞外空間中的蛋白質(zhì)相融合，包含關(guān)于針對(duì)TSH受體的刺激性自身抗體的結(jié)合表位，但不具有關(guān)于阻斷性和中性自身抗體的結(jié)合表位。示例性的氨基酸序列為這樣的氨基酸序列，其與SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6具有至少85％，優(yōu)選地至少90％，和特別優(yōu)選地至少95％的同一性。

本發(fā)明的目標(biāo)還為固定在順磁性顆粒上的TSH受體嵌合體在診斷自動(dòng)裝置上的橋式測(cè)定法中與另外一個(gè)TSH受體嵌合體一起用于檢測(cè)針對(duì)甲狀腺激素受體(TSH受體)的自身抗體的用途，所述固定在順磁性顆粒上的TSH受體嵌合體在N-末端處與適合于使TSH受體分泌入細(xì)胞外空間中的蛋白質(zhì)相融合，并且包含關(guān)于針對(duì)TSH受體的刺激性自身抗體的結(jié)合表位(而不包含關(guān)于阻斷性或中性自身抗體的結(jié)合表位)。示例性的氨基酸序列為這樣的氨基酸序列，其與SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6具有至少85％，優(yōu)選地至少90％，和特別優(yōu)選地至少95％的同一性。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的目標(biāo)為野生型TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域在用于定量測(cè)定針對(duì)TSH受體的自身抗體的方法中的用途，所述野生型TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域在N-末端處與適合于使TSH受體分泌入細(xì)胞外空間中的蛋白質(zhì)(例如，血清蛋白質(zhì))相融合。

最后，本發(fā)明的目標(biāo)為固定在順磁性顆粒上的融合蛋白在用于測(cè)定針對(duì)甲狀腺激素受體(TSH受體)的自身抗體的橋式測(cè)定法中的用途，所述融合蛋白包含在N-末端或C-末端處與分泌型堿性磷酸酶(SEAP)或其他分泌型蛋白質(zhì)(例如，血清白蛋白)相融合的野生型TSH受體的細(xì)胞外部分。

令人意外地，現(xiàn)在首次可以在用于檢測(cè)針對(duì)TSH受體的自身抗體的橋式測(cè)定法中使用兩種經(jīng)截短的TSH受體嵌合體。因此，首次從完整的TSH受體或完整的TSH受體嵌合體中，在橋式測(cè)定法中基本上僅使用野生型受體或受體嵌合體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步地，令人意外地確定，為了檢測(cè)針對(duì)TSH受體的自身抗體，固定在順磁性顆粒上的經(jīng)結(jié)合的由包含TSH受體的細(xì)胞外部分的蛋白質(zhì)構(gòu)成的第一TSH受體嵌合體適合作為關(guān)于自身抗體的錨受體，和由包含TSH受體的細(xì)胞外部分的蛋白質(zhì)構(gòu)成的第二TSH受體嵌合體適合作為信號(hào)受體，如果將受體的細(xì)胞外部分與適合于使TSH受體分泌入細(xì)胞外空間中的蛋白質(zhì)相融合。根據(jù)本發(fā)明所使用的TSH受體嵌合體具有高的貯存穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，和還具有高的檢定穩(wěn)定性。這些陳述也適用于由在N-末端處與適合于使TSH受體分泌入細(xì)胞外空間中的蛋白質(zhì)相融合的野生型TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的融合蛋白。

優(yōu)選實(shí)施方案的描述

TSH受體從胞質(zhì)通過(guò)細(xì)胞膜延伸入細(xì)胞外空間中。受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞外部分具有關(guān)于TSH和自身抗體的結(jié)合位點(diǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的受體嵌合體從TSH受體蛋白質(zhì)中基本上僅包含TSH受體的細(xì)胞外部分?；旧?，這意味著，存在有TSH受體的膜部分的少于40個(gè)，優(yōu)選地少于30或20個(gè)，特別優(yōu)選地少于10個(gè)，和直至0個(gè)氨基酸。這不僅適用于所謂的第一的在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的TSH受體嵌合體，而且也適用于所謂的第二的額外使用的TSH受體嵌合體。這還適用于使用具有野生型TSH受體的蛋白質(zhì)的情況。所述TSH受體嵌合體可以例如包含從TSH受體的N-末端部分開(kāi)始的氨基酸21至418，優(yōu)選地氨基酸21至380，特別優(yōu)選地所述TSH受體嵌合體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸21至350或330。但是，僅僅包含氨基酸21至260的TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域根據(jù)本發(fā)明也是可使用的。如果使用細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的更少的氨基酸，那么表位的結(jié)合行為和TSH受體嵌合體的穩(wěn)定性會(huì)發(fā)生變化。另一方面，這也適用于具有野生型TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。在該情況下，“野生型”是指這樣的TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，其中用于結(jié)合刺激性、阻斷性或中性自身抗體的氨基酸序列沒(méi)有被替換。

如果根據(jù)本發(fā)明所使用的TSH受體嵌合體的氨基酸數(shù)目過(guò)高，那么在其獲得過(guò)程中，TSH受體嵌合體從為了產(chǎn)生其而使用的重組細(xì)胞中向細(xì)胞外空間中的分泌就會(huì)變差。

所述第一TSH受體嵌合體和任選地所述第二TSH受體嵌合體另外還可以包含受體的胞質(zhì)部分的氨基酸序列。為此，優(yōu)選地考慮TSH受體的胞質(zhì)部分的氨基酸698-725或其部分序列。它是高度免疫原性的氨基酸序列，其已證明對(duì)于將第一TSH受體嵌合體固定在順磁性顆粒上來(lái)說(shuō)是有利的。

已證明對(duì)于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法來(lái)說(shuō)必要的是，使受體嵌合體的細(xì)胞外部分或野生型TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與引起所述受體嵌合體分泌的蛋白質(zhì)相融合。這樣的蛋白質(zhì)為例如哺乳動(dòng)物的血清蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，使用白蛋白。所述融合優(yōu)選地在N-末端處發(fā)生。所述第一的根據(jù)本發(fā)明所使用的TSH受體嵌合體特別優(yōu)選地包含血清蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，使用白蛋白，其在與TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域相融合后使所述TSH受體嵌合體穩(wěn)定化并且導(dǎo)致根據(jù)本發(fā)明所使用的TSH受體嵌合體從在其中產(chǎn)生所述受體嵌合體的細(xì)胞中分泌。這適用于由野生型TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和血清蛋白質(zhì)構(gòu)成的融合蛋白。所述第一的根據(jù)本發(fā)明所使用的TSH受體嵌合體也可以僅包含血清蛋白質(zhì)(特別是白蛋白)的部分序列，只要這些保證TSH受體嵌合體的穩(wěn)定化和從細(xì)胞中的分泌。通過(guò)該措施，賦予所述TSH受體嵌合體以穩(wěn)定性。

所述第二的根據(jù)本發(fā)明所使用的TSH受體嵌合體具有與所述第一的根據(jù)本發(fā)明所使用的TSH受體嵌合體基本上相同的構(gòu)造。由于在根據(jù)本發(fā)明的方法中所述第二TSH受體嵌合體具有信號(hào)給出者的功能，因而它必須在這方面區(qū)別于所述第一TSH受體嵌合體(錨受體)。為此目的，它具有標(biāo)記試劑。所述標(biāo)記試劑可以在N-末端或C-末端處與所述第二TSH受體嵌合體相融合。優(yōu)選地，所述標(biāo)記試劑在C-末端處與所述第二TSH受體嵌合體相融合。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述信號(hào)TSH受體嵌合體在N-末端處具有分泌型堿性磷酸酶。所述分泌型堿性磷酸酶還可以用于檢測(cè)反應(yīng)。那么可以放棄用于檢測(cè)的在所述第二TSH受體嵌合體的C-末端部分上的進(jìn)一步的修飾。除非應(yīng)當(dāng)通過(guò)另一種反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。

因此，優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的TSH受體嵌合體是這樣的TSH受體嵌合體，其完全地或部分地缺少TSH野生型受體的胞質(zhì)部分和優(yōu)選地完全缺少TSH野生型受體的膜部分。進(jìn)一步優(yōu)選地，可以修飾根據(jù)本發(fā)明的TSH受體嵌合體的細(xì)胞外部分，如下面所解釋的那樣。

如果要檢測(cè)刺激性自身抗體，那么優(yōu)選地使用這樣的受體嵌合體，其中結(jié)合針對(duì)TSH受體的阻斷性或中性自身抗體的序列被替換。

為了替換，優(yōu)選地使用另一受體的相對(duì)等的序列，其基本上不具有對(duì)于各自兩種其他類型的自身抗體的結(jié)合。這樣的相對(duì)等的序列可以例如為大鼠LG-CG受體的序列。因此，在根據(jù)本發(fā)明所使用的TSH受體嵌合體的情況下，可以替換刺激性、中性和/或阻斷性自身抗體所結(jié)合的表位。這些受體嵌合體可以根據(jù)Biochem.Biophys.Res.Comun.(1991),179:70-77或WO 01/27634 A2來(lái)進(jìn)行構(gòu)建。關(guān)于TSH受體嵌合體的產(chǎn)生，可參考這兩篇文獻(xiàn)。

在檢測(cè)刺激性自身抗體的情況下，將在TSH受體蛋白質(zhì)中的關(guān)于阻斷性和中性抗體的結(jié)合序列替換為另一受體的不導(dǎo)致各自另一種類型的自身抗體的結(jié)合的序列。在用于檢測(cè)刺激性自身抗體的嵌合體中，優(yōu)選地可以將TSH受體氨基酸261至370基本上替代為大鼠LH-CGR的相應(yīng)的氨基酸261至329。

對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的TSH受體嵌合體和相應(yīng)的具有野生型TSH受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白來(lái)說(shuō)特別有利的是，將它們與用于使TSH受體嵌合體從細(xì)胞中分泌的氨基酸序列相融合，并因此在其在重組細(xì)胞中的產(chǎn)生過(guò)程中它們被分泌入細(xì)胞外空間中。那么，為了獲得TSH受體嵌合體的細(xì)胞裂解不再是必需的了。因此，能夠以高的純度且基本上沒(méi)有被細(xì)胞成分污染地獲得根據(jù)本發(fā)明待使用的TSH受體嵌合體，所述細(xì)胞成分在為了獲得蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解的情況下出現(xiàn)。

為了檢測(cè)可以修飾根據(jù)本發(fā)明所使用的第二TSH受體嵌合體或相應(yīng)的具有野生型TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白(信號(hào)受體)，例如可以依照所希望的測(cè)定法設(shè)計(jì)將其與標(biāo)記試劑相融合。所述標(biāo)記試劑可以是這樣的，即它直接地或間接地提供可檢測(cè)信號(hào)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，直接標(biāo)記為用直接提供用于檢測(cè)免疫復(fù)合物的可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記試劑對(duì)TSH受體嵌合體進(jìn)行標(biāo)記。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，間接標(biāo)記可以例如為將TSH受體嵌合體與免疫原性肽序列相融合，所述免疫原性肽序列被適合于檢測(cè)的第二經(jīng)標(biāo)記的抗體所識(shí)別。

標(biāo)記試劑可以通過(guò)融合或化學(xué)鍵合而與TSH受體嵌合體或相應(yīng)的具有野生型TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白或者第二抗體相連接。合適的標(biāo)記例如通過(guò)酶(例如，堿性磷酸酶(AP)、分泌型堿性磷酸酶(SEAP)、螢火蟲(chóng)或Gaussia螢光素酶和過(guò)氧化物酶)或染料(例如，吖啶染料、熒光材料或生物/化學(xué)發(fā)光材料)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在上面所描述的酶的情況下，優(yōu)選地將編碼所述酶的核苷酸序列與第二TSH受體嵌合體(信號(hào)受體)的核苷酸序列相融合。合適的標(biāo)記例如進(jìn)一步地通過(guò)異硫氰酸熒光素(FITC)、生物素化和鏈霉抗生物素蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以將所述第二TSH受體嵌合體在N-末端處與分泌型堿性磷酸酶相融合以用于檢測(cè)。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述第二TSH受體嵌合體在C-末端處用吖啶染料直接進(jìn)行標(biāo)記。

在根據(jù)本發(fā)明的方法中，在免疫復(fù)合物形成期間，所謂的第一TSH受體嵌合體或相應(yīng)的具有野生型TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白結(jié)合在順磁性固相上。所述TSH受體嵌合體與該固相的結(jié)合可以通過(guò)固定性抗體來(lái)進(jìn)行，所述固定性抗體例如針對(duì)所述TSH受體嵌合體的C-末端表位。這樣的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。例如，所述固定性抗體可以針對(duì)所述第一TSH受體嵌合體的胞質(zhì)部分的氨基酸698-725。

為了檢測(cè)自身抗體與TSH受體嵌合體的結(jié)合，還可以使用第二抗體。除了固定性抗體之外，可以存在第二抗體。它可以是單克隆抗體或多克隆抗體。

合適的固相包括順磁性顆粒，例如順磁性小管、順磁性小片和順磁性微粒，但也可以是其他形態(tài)的順磁性顆粒。這樣的順磁性顆粒是專業(yè)人員已知的，并且例如可以以商標(biāo)從Invitrogen Dynal AS公司商購(gòu)獲得。根據(jù)本發(fā)明作為固相使用的順磁性顆?？梢跃哂欣?.5μm至5μm的直徑。所述顆?？梢允琼槾判缘幕虺槾判缘?。

根據(jù)本發(fā)明的TSH受體嵌合體可以凍干貯存。它們可以以通過(guò)單克隆抗體或多克隆抗體結(jié)合在固相上的狀態(tài)以凍干形式進(jìn)行貯存。對(duì)于檢測(cè)反應(yīng)，通過(guò)溶解在檢定緩沖液中來(lái)進(jìn)行凍干組分的重構(gòu)。

根據(jù)本發(fā)明的TSH受體嵌合體或相應(yīng)的具有野生型TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白(下面稱為野生型變體)在溶解形式的情況下具有高的穩(wěn)定性(檢定穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性)。它們?cè)?℃下在六至七天的時(shí)間長(zhǎng)度下保持穩(wěn)定，并且可以在診斷自動(dòng)裝置的重新校準(zhǔn)后在另外兩至三周的時(shí)間長(zhǎng)度下進(jìn)行使用。在37℃的溫度下，溶解的根據(jù)本發(fā)明的TSH受體嵌合體在六小時(shí)的時(shí)間長(zhǎng)度下保持穩(wěn)定。這些條件適合于在診斷自動(dòng)裝置上施行根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法，在所述診斷自動(dòng)裝置上所述組分在4℃下進(jìn)行貯存，而試驗(yàn)反應(yīng)可以在37℃下無(wú)問(wèn)題地進(jìn)行，和因此特別地也在Advia Centaur自動(dòng)裝置上施行根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法。與此相反，全TSH受體嵌合體在4℃下在直至六天的時(shí)間長(zhǎng)度下保持穩(wěn)定，在24℃下在直至48小時(shí)的時(shí)間長(zhǎng)度下保持穩(wěn)定，和在37℃下僅在三小時(shí)的時(shí)間長(zhǎng)度下保持穩(wěn)定。

為了施行根據(jù)本發(fā)明的方法，將患者樣品各自用第一經(jīng)固定的TSH受體嵌合體(錨受體)和第二TSH受體嵌合體(信號(hào)受體)或其野生型變體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且就相應(yīng)的自身抗體進(jìn)行檢驗(yàn)。

下面通過(guò)參考附圖來(lái)描述根據(jù)本發(fā)明的方法的示例性實(shí)施方案。

圖1和2以圖解方式顯示了固定在順磁性顆粒上的免疫復(fù)合物，其作為根據(jù)本發(fā)明的方法的產(chǎn)物。

圖3，特別是3.1和3.2，以圖解方式顯示了在根據(jù)本發(fā)明的方法中可使用的第一TSH受體嵌合體(錨受體)。它是與人白蛋白序列以及hTSHR錨表位相融合的相關(guān)于大鼠LH/CG受體進(jìn)行了部分序列替換的hTSHR的部分序列的構(gòu)建體。指明了切割位點(diǎn)。氨基酸的編號(hào)涉及全受體的各自的氨基酸或堿基。

圖4顯示了比較實(shí)施例的結(jié)果。在比較實(shí)施例中解釋了所述結(jié)果。

圖5顯示了錨受體(其借助于錨抗體而固定在順磁性顆粒上)于在37℃下和在4℃下無(wú)搖動(dòng)地進(jìn)行溫育的情況下的檢定穩(wěn)定性。分別在3小時(shí)和3.75小時(shí)后，還有大約80％或更多的錨受體是完整的。

圖6顯示了具有66.5IU/L的患者血清的稀釋系列的線性。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法來(lái)進(jìn)行測(cè)量。在Y-軸上指明了相對(duì)光單位RLU，和在X-軸上指明了以“國(guó)際單位/升”表示的所測(cè)量的自身抗體的濃度。

圖7顯示了以用EP 1 929 311 B1的sTRAB-DERA橋式測(cè)定法進(jìn)行了校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行的測(cè)量。所述校準(zhǔn)用在微量滴定板測(cè)試中的值來(lái)進(jìn)行。結(jié)果顯示，用根據(jù)本發(fā)明的橋式測(cè)定法同樣達(dá)到了高的線性。

圖8充當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法的功能靈敏度的確立。所述功能靈敏度在此相應(yīng)于20％的測(cè)定法間差異限度。基于114份血清和17份血清匯集物的測(cè)定(多次測(cè)定，n＝3-7)，臨時(shí)功能靈敏度位于大約1.9MB(磁珠)_U/L?？紤]到由于測(cè)定法的手工實(shí)施而導(dǎo)致的增加的波動(dòng)，所述功能靈敏度可以備選地用30％的測(cè)定法間差異限度來(lái)進(jìn)行評(píng)估；在該情況下，所述值位于大約1.7MB_U/L。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法具有非常好的靈敏度。

圖9顯示了在用磁珠測(cè)定法獲得的結(jié)果(MB值)與sTRAb值(來(lái)自114份血清和17份血清匯集物的463個(gè)單值)之間的良好的相關(guān)性。

SEQ ID No.1顯示了錨受體的核苷酸序列，所述錨受體具有TSH受體嵌合體的細(xì)胞外部分和TSH受體嵌合體的胞質(zhì)氨基酸序列，其在N-末端處與人血清白蛋白(包括非翻譯序列在內(nèi))相融合。

SEQ ID No.2顯示了關(guān)于SEQ ID No.1的氨基酸序列。在SEQ ID No.1和2(第一TSH受體嵌合體或錨受體)中，核苷酸1至618(氨基酸1-206)表示HSA肽序列，核苷酸619至1553(氨基酸207-516)表示該嵌合體的氨基酸21至330的TSHR序列，核苷酸1345至1553(氨基酸446-516)表示該嵌合體的氨基酸261至330的LHR序列，核苷酸1554至1637(氨基酸516-543)表示來(lái)自TSH受體的胞質(zhì)部分的高免疫原性表位(由TSH受體的核苷酸743-763所編碼)。

SEQ ID No.3顯示了TSH受體的細(xì)胞外部分的部分序列。在SEQ ID No.5中氨基酸1至240表示TSH受體的細(xì)胞外部分的氨基酸21至260(ECD260)。

SEQ ID No.4顯示了TSH受體嵌合體的細(xì)胞外部分的另一個(gè)部分序列。在SEQ ID No.4中，氨基酸1至310表示TSH受體的細(xì)胞外部分的氨基酸21至330，其中將氨基酸241至310替代為大鼠LH-CGR的相應(yīng)的氨基酸261至330(ECD330)。

SEQ ID No.5顯示了融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白由在N-末端處與人血清白蛋白(包括非翻譯序列在內(nèi))相融合的野生型TSH受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)氨基酸序列構(gòu)成。

SEQ ID No.6顯示了融合蛋白的氨基酸序列，所述融合蛋白由野生型TSH受體的細(xì)胞外部分和胞質(zhì)氨基酸序列(其在N-末端處與人血清白蛋白(包括非翻譯序列在內(nèi))相融合)構(gòu)成。

下面描述了在微量滴定板上施行根據(jù)本發(fā)明的體外測(cè)定法以用于直接測(cè)定在作為基質(zhì)的順磁性微珠上的刺激性TSH-R自身抗體。

作為在作為固相的順磁性微珠上的錨受體，通過(guò)用于產(chǎn)生融合蛋白的基因技術(shù)來(lái)制備如在圖3中所顯示的構(gòu)建體，其在中央包含具有氨基酸(AA)21-330的TSHR-ECD(細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)。這作為嵌合體存在，在所述嵌合體中AA 261-330被替代為相應(yīng)的LH/CG-R序列，因此不會(huì)一同測(cè)量阻斷性抗體。在C-末端處融合了AA 698-725的胞質(zhì)TSHR序列，在其上結(jié)合單克隆抗體以為了錨定在順磁性微珠上。在N-末端處融合了人血清白蛋白的部分序列(AA 1-206)。該HSA-ECD330-Chim充當(dāng)分泌型蛋白質(zhì)以用于將整個(gè)融合蛋白從培養(yǎng)細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)基中。由此，更簡(jiǎn)單地產(chǎn)生用于結(jié)合自身抗體的錨受體是可能的。該分泌的受體嵌合體與完整的野生型嵌合體的區(qū)別在于其高的純度，所述完整的野生型嵌合體在從細(xì)胞中提取后由于被細(xì)胞成分污染而變得不純。除了分泌的優(yōu)點(diǎn)之外，首次可以顯示，當(dāng)將它與順磁性微珠相偶聯(lián)時(shí)，該融合蛋白在緩沖液中和還在由緩沖液和患者血清組成的混合物中具有明顯更高的穩(wěn)定性。人血清白蛋白(HSA)令人驚訝地具有特別的意義，因?yàn)橛身槾判晕⒅楹屯ㄟ^(guò)抗體而結(jié)合在其上的TSHR構(gòu)建體所組成的偶聯(lián)產(chǎn)物在自動(dòng)裝置上在4℃下以溶解形式在數(shù)天期間保持穩(wěn)定(有功能)。這些是對(duì)于使用順磁性微珠作為固相的測(cè)定法來(lái)說(shuō)必不可少的先決條件。作為提取物存在的完整的嵌合野生型受體在這些溶解條件下非?？斓貑适涔δ苄?，并因此不適合于在自動(dòng)裝置上與在溶液中的順磁性微珠相偶聯(lián)。令人驚訝地，HSA對(duì)于融合構(gòu)建體HSA-ECD330-Chim的穩(wěn)定性負(fù)有責(zé)任。

在第二個(gè)測(cè)定法步驟中，將患者血清與所描述的偶聯(lián)產(chǎn)物HSA-ECD330-Chim一起在緩沖溶液中進(jìn)行溫育。然后，將順磁性微珠結(jié)合到磁體上，因此隨后通過(guò)洗滌來(lái)去除影響測(cè)量靈敏度的因素。

在第三個(gè)測(cè)定法步驟中，在反應(yīng)容器中添加同樣重組地作為融合蛋白存在的檢測(cè)受體。它在中央包含作為嵌合體的ECD，其中氨基酸261-266同樣被替換為相應(yīng)的LH/CG序列。所述檢測(cè)受體在N-末端處與SEAP(AA 1-520)相融合。然后，所形成的免疫復(fù)合物可以看起來(lái)如在圖1和2中以圖解方式所顯示的那樣。然后，當(dāng)應(yīng)當(dāng)從反應(yīng)容器中去除流體(樣品、試劑、洗滌緩沖液)時(shí)，總是激活磁體?？梢酝ㄟ^(guò)經(jīng)由SEAP-激活的化學(xué)發(fā)光來(lái)進(jìn)行定量；備選地，可以用吖啶鎓酯來(lái)標(biāo)記檢測(cè)受體。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，也可以這樣地實(shí)施刺激性自身抗體的測(cè)定，從而使得能夠進(jìn)行測(cè)量，其中作為用于結(jié)合刺激性自身抗體的TSH受體，使用具有野生型受體(而非TSH受體嵌合體)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的TSH受體蛋白?？梢詮挠纱藴y(cè)得的測(cè)量值中減去在用TSH受體嵌合體進(jìn)行的測(cè)量中對(duì)于刺激性自身抗體所測(cè)得的值。以該方式，還捕獲了非刺激性自身抗體，例如阻斷性和中性自身抗體。這對(duì)于臨床診斷可以是重要的。

如果將根據(jù)本發(fā)明的方法用于分析可證明地具有需要治療的嚴(yán)重的甲狀腺機(jī)能減退的患者的具有阻斷性自身抗體的血清，那么這些用根據(jù)本發(fā)明的方法是不可檢測(cè)的。這也涉及根據(jù)本發(fā)明的方法的特異性。

通過(guò)下面的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明。

實(shí)施例1(TSH受體嵌合體的獲得)

材料

為了克隆TSH受體嵌合體，使用來(lái)自D.L.Segaloff博士(The University of Iowa,USA)的質(zhì)粒pcDNA3-rLHR(B9)。

根據(jù)在Biochem Biophys Res Commun.(1991),179:70-77中的描述來(lái)構(gòu)建其中部分序列被大鼠LH-CGR的相應(yīng)序列替代的TSH受體嵌合體。在這種情況下，TSHR的氨基酸261至370被大鼠LH-CGR的相對(duì)等的氨基酸261至329替代。

根據(jù)常用的克隆方法用常用試劑來(lái)制備根據(jù)本發(fā)明的TSH受體嵌合體及其野生型變體。

作為細(xì)胞提取物的融合蛋白HSA2-TSHR-ECD-B-330-mAb1或TSHR/LH-CGR-SEAP的表達(dá)和獲得

在平板中培養(yǎng)匯合的穩(wěn)定的CHO-K1細(xì)胞或HEK293細(xì)胞。收集上清液(大約8mg/ml的總蛋白質(zhì))，并保存于-70℃?？梢詫⑷绱双@得的上清液在測(cè)定方法中分別作為HSA2-TSHR-ECD-B-330-mAb1、TSHR-SEAP或TSHR/LH-CGR-SEAP進(jìn)行使用。

分泌型的細(xì)胞外融合TSHR嵌合體的獲得

所述融合TSH-R嵌合體的截短的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域由表達(dá)它們的細(xì)胞分泌入培養(yǎng)物上清液中。所分泌的受體蛋白質(zhì)以在檢定緩沖液中的確定稀釋物的形式直接在該試驗(yàn)中進(jìn)行使用。例如，每個(gè)測(cè)定使用10μl的細(xì)胞外SEAP-TSH-R嵌合體B，其來(lái)自5ml的以1:10的最終稀釋度的培養(yǎng)物上清液。

將錨抗體偶聯(lián)至順磁性顆粒

取10mg(330μL)經(jīng)甲苯磺?；腗-280(Invitrogen Dynal AS)，每次用1mL的0.1M硼酸鹽緩沖液(pH 9.5)洗滌兩次，然后重懸浮在330μL硼酸鹽緩沖液中。為此，在每個(gè)洗滌步驟中如下進(jìn)行操作：激活磁體，并且從順磁性顆粒上去除溶液。然后，使磁體去激活，并且將1mL的0.1M硼酸鹽緩沖液(pH 9.5)給予順磁性顆粒并充分搖動(dòng)幾秒鐘。在這之后是激活磁體和從順磁性顆粒上去除洗滌溶液。進(jìn)行4.3μg抗體的添加(0.43μg抗體/mg)。為此，取出抗-TSHR克隆3D7，并用硼酸鹽緩沖液稀釋至30μL。此外，添加30μL/100μL的用0.1M硼酸鹽緩沖液(pH 9.5)進(jìn)行調(diào)制的3M硫酸銨溶液，并徹底混合。隨后在室溫下和在頂置式搖動(dòng)器中進(jìn)行搖動(dòng)的情況下溫育超過(guò)20小時(shí)(過(guò)夜)。然后，每次用1mL硼酸鹽緩沖液如上面所描述的那樣洗滌兩次，并添加0.5mL新鮮制備的封閉緩沖液(硼酸鹽緩沖液，0.5％BSA，0.05％Tween 20)。將該分散體在搖動(dòng)下在37℃下溫育2小時(shí)。接著用1mL新鮮制備的洗滌緩沖液(PBS pH 7.4，0.1％BSA，0.1％Tween 20)如上面所描述的那樣洗滌兩次。然后，移除上清液，并將與錨抗體相偶聯(lián)的以20mg/mL的濃度重懸浮在500μL洗滌緩沖液中。

將第一TSH受體嵌合體(錨受體)偶聯(lián)在順磁性顆粒上

將30μL的包含有在緩沖液(PBS pH 7.4，0.1％BSA，0.1％Tween20)中的20mg/mL的與錨抗體相偶聯(lián)的的溶液用1mL洗滌緩沖液(PBS pH 7.4，0.1％BSA)洗滌四次，然后添加100μL的根據(jù)本發(fā)明的錨受體(在N-末端處與HSA相融合和在C-末端處與單克隆抗體相融合的細(xì)胞外TSH受體嵌合體)的培養(yǎng)物上清液。將所產(chǎn)生的溶液在搖動(dòng)下在室溫下溫育1小時(shí)。然后，移除上清液，將用1mL洗滌緩沖液洗滌兩次，重懸浮在30μL洗滌緩沖液中，并貯存于4℃。

實(shí)施例2(根據(jù)本發(fā)明的測(cè)試的施行)

在3小時(shí)之內(nèi)從靜脈血中獲得血清樣品或血漿樣品。在4℃下貯存經(jīng)過(guò)7天的時(shí)間段或在-20℃下貯存1至2年是可能的。將第二抗體(參見(jiàn)上面)保存于-20℃，并在用于該測(cè)試中之前在室溫下進(jìn)行融化。將TSH受體嵌合體在微量滴定板上凍干貯存，并在使用之前在具有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的緩沖液中進(jìn)行重構(gòu)。

每個(gè)2mL的反應(yīng)容器，將30μL的包含有在洗滌緩沖液(PBS pH7.4，0.1％BSA)中的20mg/mL的與錨受體相偶聯(lián)的的溶液用50μL洗滌緩沖液進(jìn)行稀釋。在添加了50μL的患者樣品的血清或血漿后，將反應(yīng)容器在劇烈搖動(dòng)下在37℃下溫育10分鐘。然后，如前面所描述的那樣，通過(guò)磁體的激活/去激活來(lái)進(jìn)行數(shù)個(gè)洗滌步驟，每次用1mL洗滌緩沖液。在添加了100μl的以1:5在洗滌緩沖液中進(jìn)行稀釋的根據(jù)本發(fā)明的信號(hào)受體(在N-末端處與分泌型堿性磷酸酶(SEAP)相融合的細(xì)胞外TSH受體嵌合體)的溶液后，將反應(yīng)容器在劇烈搖動(dòng)下在37℃下溫育10分鐘至最多20分鐘。然后，如前面所描述的那樣，進(jìn)行數(shù)個(gè)洗滌步驟，每次用1mL洗滌緩沖液。此后，進(jìn)行100μl的未稀釋的包含1,2-二氧雜環(huán)丁烷的底物溶液(p·j·k.GmbH(Kleinblittersdorf,Deutschland)的AP-x(AB))的添加，并且將反應(yīng)容器在室溫下以避光方式搖動(dòng)30分鐘。用管式光度計(jì)測(cè)量生物/化學(xué)發(fā)光。為此，激活磁體，從順磁性顆粒上移除溶液，并轉(zhuǎn)移到測(cè)量管中。將測(cè)量管放置在管式光度計(jì)中，并按照管式光度計(jì)的使用說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行生物/化學(xué)發(fā)光的測(cè)量。

經(jīng)sTRAb-DERA校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)系列的行為

為了制成標(biāo)準(zhǔn)系列，使用具有經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的自身抗體濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液WHO 90/672。標(biāo)準(zhǔn)品的起始溶液包含100IU/l，將其進(jìn)行稀釋以為了制成標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的。作為零值，使用在TXBW緩沖液中的沒(méi)有自身抗體的受檢者的血清。

將所使用的用于結(jié)合刺激性自身抗體的TSH受體嵌合體通過(guò)抗體固定在上，凍干貯存，并在使用之前在具有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的緩沖液中進(jìn)行重構(gòu)。Triton X-100洗滌緩沖液(TXWB)包含0.1％TX-100、50mM Tris/HCl pH 8.0、100mM NaCl。血清稀釋緩沖液在TXWB中包含5％葡萄糖和5％奶粉。

將50μl樣品溶液(標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋物和零樣品)/孔用稀釋緩沖液以1:2進(jìn)行稀釋，并在微量滴定板上在室溫(大約22℃)下溫育90分鐘。將它每次用300μl TXWB洗滌四次。然后，進(jìn)行10μl的1:100稀釋物向90μl TXWB中的添加，所述1:100稀釋物來(lái)自5ml的與酶SEAP相融合的細(xì)胞外TSH受體嵌合體的直徑為10cm的培養(yǎng)皿的培養(yǎng)物上清液。然后，在搖動(dòng)(300-400rpm)下在37℃下溫育30分鐘。然后，用300μl TXWB洗滌四次。通過(guò)使用Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)的(用于ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法)的試劑)，用Berthold GmbH(Bad Wildbad,Schwarzwald,Deutschland)的IA LB 296微量滴定板測(cè)量?jī)x來(lái)測(cè)量生物/化學(xué)發(fā)光。

檢測(cè)極限位于大約0.2IU/l。在延伸至至少40IU/l的范圍內(nèi)，關(guān)于刺激性自身抗體，在相對(duì)光單位(RLU＝Relative Light Unit)和標(biāo)準(zhǔn)品的濃度之間存在多項(xiàng)式函數(shù)。

實(shí)施例3(比較實(shí)施例)

在該實(shí)施例中，根據(jù)EP 1 929 311 B1，一方面使用兩個(gè)經(jīng)截短的TSH受體嵌合體，和另一方面使用全受體嵌合體作為錨受體和使用經(jīng)截短的受體嵌合體(ECD)作為信號(hào)受體。將錨受體嵌合體固定在微量滴定板的塑料壁上。

在微量滴定板(MTP 96-孔)上，以10μg/ml，將錨抗體(10.75mM檸檬酸；69mM HEPES；50％甘油；pH 7.0)在碳酸鹽緩沖液(100mM NaCO₃/NaHCO₃pH 9.6)中在4℃下溫育過(guò)夜。在用檢定緩沖液(0.1％Triton X-100；50mM Tris-HCl pH 8.0；100mM NaCl)進(jìn)行四次洗滌(300μl/孔)后，在37℃下用封閉溶液(5％奶粉；5％葡萄糖，在碳酸鹽緩沖液中)對(duì)游離的MTP表面進(jìn)行封閉1小時(shí)。然后，在20-24℃下在搖動(dòng)(300rpm)下用在檢定緩沖液中的錨受體對(duì)固相進(jìn)行包被1小時(shí)。將全受體嵌合體作為細(xì)胞提取物(在1％Triton X-100；150mM NaCl；50mM Tris-HCl pH 8.0；蛋白酶抑制劑中)以500μg/ml(直至2000μg/ml，取決于受體嵌合體)的總蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行使用。在依賴于克隆地限定的上清液產(chǎn)生后，將分泌型ECD-受體嵌合體作為細(xì)胞培養(yǎng)物上清液(在RPMI 1640；10％FCS；1％青霉素/鏈霉素[10,000U，10,000μg/ml]中)以在檢定緩沖液中的10-100％的濃度進(jìn)行使用。接著是用檢定緩沖液來(lái)進(jìn)行的四次洗滌(300μl/孔)。可選地，MTP的凍干干燥是可能的。為此，用檢定緩沖液來(lái)進(jìn)行在錨受體溫育后的洗滌僅兩次，隨后是用凍干緩沖液(50mM HEPES-NaOH pH 6.5；0.1％Triton X-100；5％奶粉；3％山梨糖醇)來(lái)進(jìn)行兩次洗滌。最后一個(gè)洗滌步驟以延長(zhǎng)的MTP溫育時(shí)間(5-10分鐘)來(lái)進(jìn)行。將MTP立刻在氮?dú)庀?-180℃至-130℃)中速凍(最少溫育30分鐘)，然后進(jìn)行凍干(0.011mbar/-60℃，4-24小時(shí)，取決于MTP的數(shù)目)。

患者血清的溫育(任選地在經(jīng)干燥的MTP在檢定緩沖液中重構(gòu)5-10分鐘之后)以在檢定緩沖液中1:2稀釋的形式在20-24℃下在搖動(dòng)(300rpm)下進(jìn)行90分鐘。為了去除未結(jié)合的材料，用檢定緩沖液洗滌四次。檢測(cè)受體的溫育在檢定緩沖液中在搖動(dòng)(300rpm)下進(jìn)行30分鐘，其中在分泌型ECD-受體嵌合體的情況下在37℃下進(jìn)行和在全受體嵌合體的情況下在20-24℃下進(jìn)行。所使用的濃度在全受體嵌合體的細(xì)胞提取物的情況下為1000μg/ml的總蛋白質(zhì)(直至3000μg/ml，取決于受體嵌合體)，和在分泌型ECD-受體嵌合體的情況下為10-100％(取決于克隆)，在依賴于克隆地限定的上清液產(chǎn)生后。然后，每次用300μl檢定緩沖液/孔洗滌四次。通過(guò)添加底物(135μΜ CDP-Star或備選地AP-底物，1:1.5[直至3]，在1.0M二乙醇胺pH 9.8；0.5mM MgCl₂；0.0001％二甲苯腈藍(lán)中)并且在20-24℃下在搖動(dòng)(300rpm)下溫育30分鐘并隨后在微量滴定板光度計(jì)中進(jìn)行定量來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)受體嵌合體的穩(wěn)定性測(cè)量通過(guò)預(yù)溫育經(jīng)過(guò)各種不同的時(shí)間段并隨后在橋式測(cè)定法中使用來(lái)進(jìn)行，其中將錨受體嵌合體如在作為本申請(qǐng)的基礎(chǔ)的橋式測(cè)定法中那樣進(jìn)行處理，即以類似于親和層析的方式結(jié)合在固相上。

所述比較的測(cè)量結(jié)果為微量滴定板試驗(yàn)。結(jié)果顯示在圖5中。將微量滴定板在4℃下用在其上結(jié)合錨受體嵌合體(全受體嵌合體或ECD-受體嵌合體(比較))的抗體進(jìn)行包被。與患者血清一起進(jìn)行的溫育在室溫下進(jìn)行。

最后，在圖4中的所測(cè)得的測(cè)量值曲線為兩個(gè)校準(zhǔn)曲線，其中使用描繪在縱坐標(biāo)上的商“B/B0(結(jié)合的/未結(jié)合的)”，以便排除結(jié)果中的非特異性結(jié)合。在橫坐標(biāo)上，標(biāo)出了經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的樣品的自身抗體單位。

粗線印刷的曲線顯示了具有結(jié)合在固相上的第一TSH受體嵌合體(全受體嵌合體)和僅包含全受體的細(xì)胞外部分的第二的經(jīng)截短的TSH受體嵌合體(ECD-受體嵌合體)(作為信號(hào)受體)的實(shí)施方案。在細(xì)線印刷的曲線的情況下，作為錨受體嵌合體，同樣也使用經(jīng)截短的受體嵌合體(ECD-受體嵌合體)，以代替結(jié)合在固相上的第一TSH受體嵌合體(全受體嵌合體)。

這兩個(gè)曲線線路的比較顯示出在自身抗體與全受體嵌合體或經(jīng)截短的受體嵌合體的結(jié)合行為方面的明顯區(qū)別。采用兩個(gè)ECD-受體嵌合體(錨受體和信號(hào)受體為ECD-受體嵌合體)的樣品的測(cè)量值曲線是“鋸齒狀的”，是不可重現(xiàn)的，并且未提供所需要的靈敏度和特異性。它特別地不適合于寬的濃度范圍。因此，使用一個(gè)作為錨受體的全受體嵌合體和另一個(gè)全受體嵌合體既不適合于微量滴定板試驗(yàn)，也不適合于在自動(dòng)裝置上的測(cè)定。

? 序列表

<110> Ulrich Loos

<120> 針對(duì)TSH受體的自身抗體的檢測(cè)

<130> 111270EP

<160> 6

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 1728

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<222> 1..1728

<223> /mol_type="未分配的DNA"

/note="序列1"

/organism="人工序列"

<400> 1

gatatcctag cttttctctt ctgtcaaccc cacacgcctt tggcacagat atcacaatga 60

agtgggtaac ctttatttcc cttctttttc tctttagctc ggcttattcc aggggtgtgt 120

ttcgtcgaga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcggtt taaagatttg ggagaagaaa 180

atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt ccatttgaag 240

atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgtt gctgatgagt 300

cagctgaaaa ttgtgacaaa tcacttcata ccctttttgg agacaaatta tgcacagttg 360

caactcttcg tgaaacctat ggtgaaatgg ctgactgctg tgcaaaacaa gaacctgaga 420

gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga ttggtgagac 480

cagaggttga tgtgatgtgc actgcttttc atgacaatga agagacattt ttgaaaaaat 540

acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc cttttctttg 600

ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa gctgcctgcc 660

tgttgccaaa gctcactagt ggaatggggt gttcgtctcc accctgcgag tgccatcagg 720

aggaggactt cagagtcacc tgcaaggata ttcaacgcat ccccagctta ccgcccagta 780

cgcagactct gaagcttatt gagactcacc tgagaactat tccaagtcat gcattttcta 840

atctgcccaa tatttccaga atctacgtat ctatagatgt gactctgcag cagctggaat 900

cacactcctt ctacaatttg agtaaagtga ctcacataga aattcggaat accaggaact 960

taacttacat agaccctgat gccctcaaag agctccccct cctaaagttc cttggcattt 1020

tcaacactgg acttaaaatg ttccctgacc tgaccaaagt ttattccact gatatattct 1080

ttatacttga aattacagac aacccttaca tgacgtcaat ccctgtgaat gcttttcagg 1140

gactatgcaa tgaaaccttg acactgaagc tgtacaacaa tggctttact tcagtccaag 1200

gatatgcttt caatgggaca aagctggatg ctgtttacct aaacaagaat aaatacctga 1260

cagttattga caaagatgca tttggaggag tatacagtgg accaagcttg ctggacgtgt 1320

ctcaaaccag tgtcactgcc cttccatcca aaggcctgga gcacctgaag gaactgatag 1380

caagaaacac ctggactctt aagaaaacac tgccctccaa agaaaaattc acgagcctcc 1440

tggtcgccac gctgacctac cccagccact gctgcgcctt caggaatttg ccgaagaaag 1500

aacagaattt ttcattttcc atttttgaaa acttctccaa acaatgcgaa agcacagtta 1560

gaaaagcaga taacgagacg ctttattccg ccatctttga ggagaatgaa gctagcatct 1620

gtaaacgcca ggctcaggca taccgggggc agagggttcc tccaaagaac agcactgata 1680

ttcaggttca aaaggttacc taaggatcca ctagtcagtg tgctggaa 1728

<210> 2

<211> 1570

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列2

<400> 2

Thr Tyr Arg Pro Arg Ser Glu Arg Pro His Glu Ser Glu Arg Leu Glu

1 5 10 15

Leu Glu Ser Glu Arg Thr His Arg Pro Arg His Ile Ser Ala Leu Ala

20 25 30

Pro His Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Thr

35 40 45

His Arg Met Glu Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Pro Val Ala Leu Thr His

50 55 60

Arg Pro His Glu Ile Leu Glu Ser Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro His

65 70 75 80

Glu Leu Glu Pro His Glu Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ala Leu Ala Thr

85 90 95

Tyr Arg Ser Glu Arg Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Val Ala Leu Pro His

100 105 110

Glu Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ala Ser Pro Ala Leu Ala His Ile Ser

115 120 125

Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Gly Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala His Ile

130 135 140

Ser Ala Arg Gly Pro His Glu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Leu Glu Gly

145 150 155 160

Leu Tyr Gly Leu Gly Leu Ala Ser Asn Pro His Glu Leu Tyr Ser Ala

165 170 175

Leu Ala Leu Glu Val Ala Leu Leu Glu Ile Leu Glu Ala Leu Ala Pro

180 185 190

His Glu Ala Leu Ala Gly Leu Asn Thr Tyr Arg Leu Glu Gly Leu Asn

195 200 205

Gly Leu Asn Cys Tyr Ser Pro Arg Pro His Glu Gly Leu Ala Ser Pro

210 215 220

His Ile Ser Val Ala Leu Leu Tyr Ser Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser

225 230 235 240

Asn Gly Leu Val Ala Leu Thr His Arg Gly Leu Pro His Glu Ala Leu

245 250 255

Ala Leu Tyr Ser Thr His Arg Cys Tyr Ser Val Ala Leu Ala Leu Ala

260 265 270

Ala Ser Pro Gly Leu Ser Glu Arg Ala Leu Ala Gly Leu Ala Ser Asn

275 280 285

Cys Tyr Ser Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Leu Glu His Ile

290 295 300

Ser Thr His Arg Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Leu

305 310 315 320

Tyr Ser Leu Glu Cys Tyr Ser Thr His Arg Val Ala Leu Ala Leu Ala

325 330 335

Thr His Arg Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Thr His Arg Thr Tyr Arg

340 345 350

Gly Leu Tyr Gly Leu Met Glu Thr Ala Leu Ala Ala Ser Pro Cys Tyr

355 360 365

Ser Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gly Leu Pro

370 375 380

Arg Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Gly Leu Cys Tyr Ser Pro His

385 390 395 400

Glu Leu Glu Gly Leu Asn His Ile Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ala

405 410 415

Ser Pro Ala Ser Asn Pro Arg Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Ala Arg

420 425 430

Gly Leu Glu Val Ala Leu Ala Arg Gly Pro Arg Gly Leu Val Ala Leu

435 440 445

Ala Ser Pro Val Ala Leu Met Glu Thr Cys Tyr Ser Thr His Arg Ala

450 455 460

Leu Ala Pro His Glu His Ile Ser Ala Ser Pro Ala Ser Asn Gly Leu

465 470 475 480

Gly Leu Thr His Arg Pro His Glu Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser

485 490 495

Thr Tyr Arg Leu Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Ile Leu Glu Ala Leu Ala

500 505 510

Ala Arg Gly Ala Arg Gly His Ile Ser Pro Arg Thr Tyr Arg Pro His

515 520 525

Glu Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Pro Arg Gly Leu Leu Glu Leu Glu Pro

530 535 540

His Glu Pro His Glu Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Thr Tyr

545 550 555 560

Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Leu Ala Pro His Glu Thr His Arg

565 570 575

Gly Leu Cys Tyr Ser Cys Tyr Ser Gly Leu Asn Ala Leu Ala Ala Leu

580 585 590

Ala Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Leu Ala Cys Tyr Ser

595 600 605

Leu Glu Leu Glu Pro Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Thr His Arg Ser Glu

610 615 620

Arg Gly Leu Tyr Met Glu Thr Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ser Glu Arg

625 630 635 640

Ser Glu Arg Pro Arg Pro Arg Cys Tyr Ser Gly Leu Cys Tyr Ser His

645 650 655

Ile Ser Gly Leu Asn Gly Leu Gly Leu Ala Ser Pro Pro His Glu Ala

660 665 670

Arg Gly Val Ala Leu Thr His Arg Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Ser

675 680 685

Pro Ile Leu Glu Gly Leu Asn Ala Arg Gly Ile Leu Glu Pro Arg Ser

690 695 700

Glu Arg Leu Glu Pro Arg Pro Arg Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu

705 710 715 720

Asn Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Glu Ile Leu Glu Gly Leu

725 730 735

Thr His Arg His Ile Ser Leu Glu Ala Arg Gly Thr His Arg Ile Leu

740 745 750

Glu Pro Arg Ser Glu Arg His Ile Ser Ala Leu Ala Pro His Glu Ser

755 760 765

Glu Arg Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Ala Ser Asn Ile Leu Glu Ser

770 775 780

Glu Arg Ala Arg Gly Ile Leu Glu Thr Tyr Arg Val Ala Leu Ser Glu

785 790 795 800

Arg Ile Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Thr His Arg Leu Glu Gly

805 810 815

Leu Asn Gly Leu Asn Leu Glu Gly Leu Ser Glu Arg His Ile Ser Ser

820 825 830

Glu Arg Pro His Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Glu Arg

835 840 845

Leu Tyr Ser Val Ala Leu Thr His Arg His Ile Ser Ile Leu Glu Gly

850 855 860

Leu Ile Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Thr His Arg Ala Arg Gly

865 870 875 880

Ala Ser Asn Leu Glu Thr His Arg Thr Tyr Arg Ile Leu Glu Ala Ser

885 890 895

Pro Pro Arg Ala Ser Pro Ala Leu Ala Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu

900 905 910

Leu Glu Pro Arg Leu Glu Leu Glu Leu Tyr Ser Pro His Glu Leu Glu

915 920 925

Gly Leu Tyr Ile Leu Glu Pro His Glu Ala Ser Asn Thr His Arg Gly

930 935 940

Leu Tyr Leu Glu Leu Tyr Ser Met Glu Thr Pro His Glu Pro Arg Ala

945 950 955 960

Ser Pro Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Thr Tyr Arg

965 970 975

Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Pro His Glu Pro

980 985 990

His Glu Ile Leu Glu Leu Glu Gly Leu Ile Leu Glu Thr His Arg Ala

995 1000 1005

Ser Pro Ala Ser Asn Pro Arg Thr Tyr Arg Met Glu Thr Thr His Arg

1010 1015 1020

Ser Glu Arg Ile Leu Glu Pro Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn Ala Leu

1025 1030 1035 1040

Ala Pro His Glu Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Leu Glu Cys Tyr Ser Ala

1045 1050 1055

Ser Asn Gly Leu Thr His Arg Leu Glu Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr

1060 1065 1070

Ser Leu Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Pro

1075 1080 1085

His Glu Thr His Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Gly Leu Asn Gly Leu

1090 1095 1100

Tyr Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Pro His Glu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr

1105 1110 1115 1120

Thr His Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala

1125 1130 1135

Leu Thr Tyr Arg Leu Glu Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Leu

1140 1145 1150

Tyr Ser Thr Tyr Arg Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu Ile Leu Glu

1155 1160 1165

Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ala Pro His Glu Gly

1170 1175 1180

Leu Tyr Gly Leu Tyr Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Gly Leu

1185 1190 1195 1200

Tyr Pro Arg Ser Glu Arg Leu Glu Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu

1205 1210 1215

Ser Glu Arg Gly Leu Asn Thr His Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr

1220 1225 1230

His Arg Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly

1235 1240 1245

Leu Tyr Leu Glu Gly Leu His Ile Ser Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu

1250 1255 1260

Leu Glu Ile Leu Glu Ala Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ser Asn Thr His

1265 1270 1275 1280

Arg Thr Arg Pro Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Thr

1285 1290 1295

His Arg Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Leu Tyr

1300 1305 1310

Ser Pro His Glu Thr His Arg Ser Glu Arg Leu Glu Leu Glu Val Ala

1315 1320 1325

Leu Ala Leu Ala Thr His Arg Leu Glu Thr His Arg Thr Tyr Arg Pro

1330 1335 1340

Arg Ser Glu Arg His Ile Ser Cys Tyr Ser Cys Tyr Ser Ala Leu Ala

1345 1350 1355 1360

Pro His Glu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Leu Tyr Ser

1365 1370 1375

Leu Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Asn Ala Ser Asn Pro His Glu Ser Glu

1380 1385 1390

Arg Pro His Glu Ser Glu Arg Ile Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Ala

1395 1400 1405

Ser Asn Pro His Glu Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Cys Tyr

1410 1415 1420

Ser Gly Leu Ser Glu Arg Thr His Arg Val Ala Leu Ala Arg Gly Leu

1425 1430 1435 1440

Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ser Pro Ala Ser Asn Gly Leu Thr His Arg

1445 1450 1455

Leu Glu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ile Leu Glu Pro His

1460 1465 1470

Glu Gly Leu Gly Leu Ala Ser Asn Gly Leu Ala Leu Ala Ser Glu Arg

1475 1480 1485

Ile Leu Glu Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Gly Leu Asn Ala

1490 1495 1500

Leu Ala Gly Leu Asn Ala Leu Ala Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Gly Leu

1505 1510 1515 1520

Tyr Gly Leu Asn Ala Arg Gly Val Ala Leu Pro Arg Pro Arg Leu Tyr

1525 1530 1535

Ser Ala Ser Asn Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu

1540 1545 1550

Gly Leu Asn Val Ala Leu Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Val Ala Leu Thr

1555 1560 1565

His Arg

1570

<210> 3

<211> 664

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列3

<400> 3

Gly Leu Tyr Met Glu Thr Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Ser

1 5 10 15

Glu Arg Pro Arg Pro Arg Cys Tyr Ser Gly Leu Cys Tyr Ser His Ile

20 25 30

Ser Gly Leu Asn Gly Leu Gly Leu Ala Ser Pro Pro His Glu Ala Arg

35 40 45

Gly Val Ala Leu Thr His Arg Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Pro

50 55 60

Ile Leu Glu Gly Leu Asn Ala Arg Gly Ile Leu Glu Pro Arg Ser Glu

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Arg Pro Arg Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Asn

85 90 95

Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Glu Ile Leu Glu Gly Leu Thr

100 105 110

His Arg His Ile Ser Leu Glu Ala Arg Gly Thr His Arg Ile Leu Glu

115 120 125

Pro Arg Ser Glu Arg His Ile Ser Ala Leu Ala Pro His Glu Ser Glu

130 135 140

Arg Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Ala Ser Asn Ile Leu Glu Ser Glu

145 150 155 160

Arg Ala Arg Gly Ile Leu Glu Thr Tyr Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg

165 170 175

Ile Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Thr His Arg Leu Glu Gly Leu

180 185 190

Asn Gly Leu Asn Leu Glu Gly Leu Ser Glu Arg His Ile Ser Ser Glu

195 200 205

Arg Pro His Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Glu Arg Leu

210 215 220

Tyr Ser Val Ala Leu Thr His Arg His Ile Ser Ile Leu Glu Gly Leu

225 230 235 240

Ile Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Thr His Arg Ala Arg Gly Ala

245 250 255

Ser Asn Leu Glu Thr His Arg Thr Tyr Arg Ile Leu Glu Ala Ser Pro

260 265 270

Pro Arg Ala Ser Pro Ala Leu Ala Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Pro Arg Leu Glu Leu Glu Leu Tyr Ser Pro His Glu Leu Glu Gly

290 295 300

Leu Tyr Ile Leu Glu Pro His Glu Ala Ser Asn Thr His Arg Gly Leu

305 310 315 320

Tyr Leu Glu Leu Tyr Ser Met Glu Thr Pro His Glu Pro Arg Ala Ser

325 330 335

Pro Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ser

340 345 350

Glu Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Pro His Glu Pro His

355 360 365

Glu Ile Leu Glu Leu Glu Gly Leu Ile Leu Glu Thr His Arg Ala Ser

370 375 380

Pro Ala Ser Asn Pro Arg Thr Tyr Arg Met Glu Thr Thr His Arg Ser

385 390 395 400

Glu Arg Ile Leu Glu Pro Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn Ala Leu Ala

405 410 415

Pro His Glu Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Leu Glu Cys Tyr Ser Ala Ser

420 425 430

Asn Gly Leu Thr His Arg Leu Glu Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser

435 440 445

Leu Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Pro His

450 455 460

Glu Thr His Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Gly Leu Asn Gly Leu Tyr

465 470 475 480

Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Pro His Glu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Thr

485 490 495

His Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu

500 505 510

Thr Tyr Arg Leu Glu Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Tyr

515 520 525

Ser Thr Tyr Arg Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu Ile Leu Glu Ala

530 535 540

Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ala Pro His Glu Gly Leu

545 550 555 560

Tyr Gly Leu Tyr Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr

565 570 575

Pro Arg Ser Glu Arg Leu Glu Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ser

580 585 590

Glu Arg Gly Leu Asn Thr His Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr His

595 600 605

Arg Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu

610 615 620

Tyr Leu Glu Gly Leu His Ile Ser Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Leu

625 630 635 640

Glu Ile Leu Glu Ala Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ser Asn Thr His Arg

645 650 655

Thr Arg Pro Thr His Arg Leu Glu

660

<210> 4

<211> 857

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列4

<400> 4

Gly Leu Tyr Met Glu Thr Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Ser

1 5 10 15

Glu Arg Pro Arg Pro Arg Cys Tyr Ser Gly Leu Cys Tyr Ser His Ile

20 25 30

Ser Gly Leu Asn Gly Leu Gly Leu Ala Ser Pro Pro His Glu Ala Arg

35 40 45

Gly Val Ala Leu Thr His Arg Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Pro

50 55 60

Ile Leu Glu Gly Leu Asn Ala Arg Gly Ile Leu Glu Pro Arg Ser Glu

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Arg Pro Arg Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Asn

85 90 95

Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Glu Ile Leu Glu Gly Leu Thr

100 105 110

His Arg His Ile Ser Leu Glu Ala Arg Gly Thr His Arg Ile Leu Glu

115 120 125

Pro Arg Ser Glu Arg His Ile Ser Ala Leu Ala Pro His Glu Ser Glu

130 135 140

Arg Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Ala Ser Asn Ile Leu Glu Ser Glu

145 150 155 160

Arg Ala Arg Gly Ile Leu Glu Thr Tyr Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg

165 170 175

Ile Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Thr His Arg Leu Glu Gly Leu

180 185 190

Asn Gly Leu Asn Leu Glu Gly Leu Ser Glu Arg His Ile Ser Ser Glu

195 200 205

Arg Pro His Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Glu Arg Leu

210 215 220

Tyr Ser Val Ala Leu Thr His Arg His Ile Ser Ile Leu Glu Gly Leu

225 230 235 240

Ile Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Thr His Arg Ala Arg Gly Ala

245 250 255

Ser Asn Leu Glu Thr His Arg Thr Tyr Arg Ile Leu Glu Ala Ser Pro

260 265 270

Pro Arg Ala Ser Pro Ala Leu Ala Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Pro Arg Leu Glu Leu Glu Leu Tyr Ser Pro His Glu Leu Glu Gly

290 295 300

Leu Tyr Ile Leu Glu Pro His Glu Ala Ser Asn Thr His Arg Gly Leu

305 310 315 320

Tyr Leu Glu Leu Tyr Ser Met Glu Thr Pro His Glu Pro Arg Ala Ser

325 330 335

Pro Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ser

340 345 350

Glu Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Pro His Glu Pro His

355 360 365

Glu Ile Leu Glu Leu Glu Gly Leu Ile Leu Glu Thr His Arg Ala Ser

370 375 380

Pro Ala Ser Asn Pro Arg Thr Tyr Arg Met Glu Thr Thr His Arg Ser

385 390 395 400

Glu Arg Ile Leu Glu Pro Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn Ala Leu Ala

405 410 415

Pro His Glu Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Leu Glu Cys Tyr Ser Ala Ser

420 425 430

Asn Gly Leu Thr His Arg Leu Glu Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser

435 440 445

Leu Glu Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Pro His

450 455 460

Glu Thr His Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Gly Leu Asn Gly Leu Tyr

465 470 475 480

Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Pro His Glu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Thr

485 490 495

His Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu

500 505 510

Thr Tyr Arg Leu Glu Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Tyr

515 520 525

Ser Thr Tyr Arg Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu Ile Leu Glu Ala

530 535 540

Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ala Pro His Glu Gly Leu

545 550 555 560

Tyr Gly Leu Tyr Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr

565 570 575

Pro Arg Ser Glu Arg Leu Glu Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ser

580 585 590

Glu Arg Gly Leu Asn Thr His Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Thr His

595 600 605

Arg Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu

610 615 620

Tyr Leu Glu Gly Leu His Ile Ser Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Leu

625 630 635 640

Glu Ile Leu Glu Ala Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ser Asn Thr His Arg

645 650 655

Thr Arg Pro Thr His Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Thr His

660 665 670

Arg Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Leu Tyr Ser

675 680 685

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690 695 700

Ala Leu Ala Thr His Arg Leu Glu Thr His Arg Thr Tyr Arg Pro Arg

705 710 715 720

Ser Glu Arg His Ile Ser Cys Tyr Ser Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Pro

725 730 735

His Glu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Leu Tyr Ser Leu

740 745 750

Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Asn Ala Ser Asn Pro His Glu Ser Glu Arg

755 760 765

Pro His Glu Ser Glu Arg Ile Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Ala Ser

770 775 780

Asn Pro His Glu Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Cys Tyr Ser

785 790 795 800

Gly Leu Ser Glu Arg Thr His Arg Val Ala Leu Ala Arg Gly Leu Tyr

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Ser Ala Leu Ala Ala Ser Pro Ala Ser Asn Gly Leu Thr His Arg Leu

820 825 830

Glu Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ile Leu Glu Pro His Glu

835 840 845

Gly Leu Gly Leu Ala Ser Asn Gly Leu

850 855

<210> 5

<211> 2012

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<222> 1..2012

<223> /mol_type="未分配的DNA"

/note="序列"

/organism="人工序列"

<400> 5