本發(fā)明屬于藥物分析
技術領域：
，特別涉及一種枳實藥材指紋圖譜及其建立方法。具體地，本發(fā)明涉及一種枳實藥材的高效液相色譜（HPLC）切換波長法指紋圖譜及其建立方法，以及枳實的標準指紋圖譜。本發(fā)明還涉及一種枳實藥材質(zhì)量優(yōu)劣的鑒別方法。
背景技術：
：枳實為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種甜橙C.Sinensis（L）Osbeck的干燥幼果，主產(chǎn)于江西、四川、福建、江蘇等地。2015年版《中國藥典》記載枳實具有破氣除痞、化痰消積的功效，近代臨床用于治療胃擴張、胃下垂、子宮下垂、脫肛等臟器下垂病癥，是中醫(yī)臨床常用藥物。枳實藥材來源于酸橙和甜橙，由于各產(chǎn)地的地理環(huán)境、氣候、土壤等生長條件不同以及采收后加工炮制方法不同，使枳實藥材在化學成分組成及含量上差異很大，因而直接影響到藥材質(zhì)量。枳實中的主要活性成分為揮發(fā)油、黃酮類化合物和少量生物堿類化合物，其藥理作用應該是多種成分綜合作用的結果。因此僅以單一成分或幾個主要有效成分來控制和評價枳實的質(zhì)量是不全面的。而指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的評價中藥質(zhì)量的檢測手段，恰好適用于對中藥多成分的質(zhì)量評價。2015版藥典規(guī)定，以辛弗林作為枳實質(zhì)量控制的指標（國家藥典委員會編，中華人民共和國藥典2015年版，北京：中國醫(yī)藥工業(yè)出版社，2015，一部：247），采用單一成分進行中藥質(zhì)量控制的方法不能全面反映中藥內(nèi)在化學成分的種類和數(shù)量，存在一定局限性，不能全面控制藥材質(zhì)量。針對枳實的研究主要涉及提取、炮制等研究，質(zhì)量檢測方法公開較少，如中國專利200410077903.6（公開號CN100486586C）涉及的是枳實提取物中總黃酮總類成分的檢測，不是對枳實藥材進行檢測，也并未對質(zhì)量進行全面控制；中國專利200710120306.0（公開號CN101366849B）涉及的是采用紅外光譜對枳實藥材進行質(zhì)量控制，僅檢測三個指標成分，有一定的局限性；中國專利201410106425.0（公開號CN103837621B）涉及的是枳實藥材HPLC指紋圖譜，僅采用單一波長檢測，枳實供試品制備方法復雜?！吨袊幏俊?011年第39期《酸橙和甜橙2種枳實藥材HPLC指紋圖譜研究及其柚皮苷和辛弗林含量分析》記載了一種應用高效液相（HPLC）測定枳實的指紋圖譜方法，但僅指認柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林等四個指標成分；《海峽藥學》2004年第2期《綠衣枳實指紋圖譜的研究》記載了一種應用氣相色譜（GC）測定綠衣枳實中揮發(fā)油指紋圖譜的方法；《現(xiàn)代中藥研究與實踐》2004年第18卷增刊《化學模式識別在中藥積實分類中的應用》記載了一種應用高效液相（HPLC）測定枳實指紋圖譜的方法，但采用單一波長檢測，僅有8個共有峰且僅指認柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等三個指標成分?，F(xiàn)有技術中，鑒定的指標成分少，不能全面反映藥材的質(zhì)量優(yōu)劣，保證用藥的療效，因此，建立枳實藥材的指紋圖譜檢測方法及標準指紋圖譜方法具有非常重要的意義。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種枳實指紋圖譜的測定方法，該方法在控制枳實的質(zhì)量，有效的指導臨床和生產(chǎn)中使用、保證用藥的有效、安全和可靠具有積極作用。建立的方法和枳實藥材HPLC標準指紋圖譜能夠用于鑒定或者鑒別枳實藥材質(zhì)量真?zhèn)蝺?yōu)劣，具有較高的可信度和極高的靈敏度。由此提供了下述發(fā)明：本發(fā)明的一種枳實藥材指紋圖譜的檢測方法，包括以下步驟：（1）供試品溶液的制備：取枳實藥材中粉，精密稱定，加入甲醇，超聲或回流提取，提取液以微孔膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；（2）對照品溶液的制備：分別取蕓香柚皮苷對照品、柚皮苷對照品、橙皮苷對照品、新橙皮苷對照品、川陳皮素對照品、橘紅素對照品，精密稱定，分別加入甲醇制成對照品溶液；（3）高效液相色譜檢測：分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀測定，即得枳實指紋圖譜；其中，色譜條件為：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，4.6×250mm，5μm；柱溫：20~40℃；檢測波長為280nm、215nm，切換時間為0min、24.01min；進樣量為10μl；流速：1.0ml/min；分析時間為70min；流動相為流動相A為乙腈，流動相B為0.1％磷酸溶液；采用梯度洗脫方式：0min→25min→25.01min→35min→60min→70min，乙腈20%→24%→30%→40%→95%→100%。根據(jù)權利要求1所述的一種枳實藥材指紋圖譜的檢測方法，其特征在于：所述步驟（1）的枳實中粉與甲醇的比例為0.2g:50ml。根據(jù)權利要求1所述的一種枳實藥材指紋圖譜的檢測方法，其特征在于：所述步驟（1）的超聲或回流提取時間為1小時。根據(jù)權利要求1所述的一種枳實藥材指紋圖譜的檢測方法，其特征在于：所述步驟（2）中的對照品溶液具體為：每1ml各含蕓香柚皮苷70ng、柚皮苷80ng、橙皮苷40ng、新橙皮苷80ng、川陳皮素80ng、橘紅素60ng的混合溶液。一種如權利要求1所述的枳實指紋圖譜的檢測方法所建立的枳實藥材的指紋圖譜，其特征在于：枳實指紋圖譜中17個色譜峰被確定為共有峰，通過與對照品保留時間的比較，確定峰3為蕓香柚皮苷，峰4為柚皮苷，峰5為橙皮苷，峰6為新橙皮苷，峰14為川陳皮素，峰15為橘紅素，所述指紋圖譜的17個共有指紋峰的相對保留時間范圍及相對標準偏差如下：1號峰：0.266～0.279，RSD為0.95%；2號峰：0.637～0.648，RSD為0.45%；3號峰：0.862～0.889，RSD為0.61%；4號峰：1，RSD為0%；5號峰：1.095～1.115，RSD為0.39%；6號峰：1.268～1.284，RSD為0.85%；7號峰：1.617～1.635，RSD為0.53%；8號峰：2.278～2.301，RSD為1.03%；9號峰：2.386～2.406，RSD為0.81%；10號峰：2.697～2.714，RSD為0.96%；11號峰：2.824～2.835，RSD為0.72%；12號峰：2.923～2.944，RSD為0.88%；13號峰：3.229～3.245，RSD為0.47%；14號峰：3.357～3.379，RSD為0.55%；15號峰：3.562～3.602，RSD為0.83%；16號峰：4.475～4.496，RSD為1.08%；17號峰：4.545～4.569，RSD為0.61%。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下有益效果：（1）本發(fā)明建立的切換波長指紋圖譜能夠較單波長指紋圖譜更全面的反應中藥的物質(zhì)信息，克服了枳實質(zhì)量檢測方法所檢測的有效成分單一，不能全面反應枳實質(zhì)量的缺陷。通過波長的轉(zhuǎn)換，增強了指紋峰的可視化比較，指認了6個指標成分，匹配共有峰17個，更有效的表征了枳實的質(zhì)量信息，更有利于增強對藥材的質(zhì)量監(jiān)控；（2）本發(fā)明獲得的標準指紋圖譜比較指紋圖譜中共有峰的有無，能有效地監(jiān)控枳實藥材的質(zhì)量，完善了枳實藥材的質(zhì)量評價體系，為枳實藥材質(zhì)量的全面、有效控制提供了理論和實踐基礎；（3）本發(fā)明方法適用于枳實藥材真?zhèn)魏推焚|(zhì)的鑒別，有利于指導投料、規(guī)范生產(chǎn)操作，真正確保臨床用藥的安全、有效、可控；（4）本發(fā)明方法操作簡便、穩(wěn)定、重復性好，結論客觀、準確。附圖說明圖1為枳實藥材標準指紋圖譜，其中峰3為蕓香柚皮苷，峰4為柚皮苷，峰5為橙皮苷，峰6為新橙皮苷，峰14為川陳皮素，峰15為橘紅素。圖2為10個批次枳實藥材指紋圖譜。圖3為6個對照品混合溶液圖譜。圖4為實施例2中檢測到的兩批質(zhì)量有問題的藥材與標準指紋圖譜對比圖。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。本發(fā)明藥材、對照品來源如下：新橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院、111857-201102）；橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院、110738-201337）；柚皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院、110721-201316）；川陳皮素對照品（上海純優(yōu)生物科技有限公司、487013-201393）；橘紅素對照品（研域化學試劑有限公司、481538-2015422）；蕓香柚皮苷對照（南京景竹生物科技有限公司）。10批次采自不同產(chǎn)區(qū)的枳實藥材中包括湖南沅江、湖南漢壽、四川遂寧、浙江金華、浙江蘭溪、江西新干、江西上高、江西新余；各枳實藥材供試樣品來源等基本信息如表1：實施例1：枳實切換波長指紋圖譜的建立和驗證。1.1儀器與試藥：安捷倫1260高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機器（G-1311C）、二元泵（G-1311C）、標準自動進樣器（G-1329B）、智能化柱溫箱（G-1316A）、DAD檢測器（G-1314B）、Agilent1260Infinity色譜工作站（美國安捷倫科技有限公司）；SB-5200D超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；FAZ004B分析天平（上海佑科）；BT125D電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）。1.2色譜條件的選擇。（1）流動相的選擇選擇乙腈-0.01%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-4%磷酸溶液、乙腈-0.01%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、、乙腈-4%甲酸溶液、乙腈-0.01%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液、、乙腈-4%冰醋酸溶液、等為流動相進行試驗，結果表明，上述各溶液為流動相時，色譜峰的峰形均較理想，各峰分離較完全，其中乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相時效果最好，故選用乙腈-0.1%磷酸溶液作為最佳流動相。由于樣品中成分復雜，在恒流條件下，樣品中的各個成分分離度差，較難體現(xiàn)指紋圖譜的整體特性；流動相以如下梯度運行，樣品中各組分均有較好的分離，基線平穩(wěn)，故選用該梯度為最佳洗脫梯度，見表2。表2梯度運行表（2）檢測波長的選擇通過對供試品進行全波長測定比較，當程序切換波長的程序為0~24min選擇300nm波長，24.01~70min選擇215nm波長時，極大的增強了指紋峰的可視化，使樣品特征峰最豐富。（3）色譜柱的選擇通過比較AgilentZORBAXXDB-C18（5μm，4.6×250mm），ThermoSyncronis-C18（5μm，4.6×250mm），Unitary-C18，（5μm，4.6mm×250mm），迪馬Diamonsil-C18（5μm，4.6×250mm）4種不同型號規(guī)格的色譜柱，結果表明，以上4種品牌的色譜柱均可達到保留時間適中，峰數(shù)目較多，分離度好的較理想的色譜效果。（4）柱溫的選擇考察了不同柱溫20℃、25℃、30℃、35℃、40℃時對同一樣品的分離效果。結果表明，不同溫度對色譜峰的分離影響較小，以20℃~40℃時分離效果都較理想。（5）不同流速的選擇在其他色譜條件相同的情況下，分別考察流速為0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min對同一樣品色譜峰分離的影響。結果表明，當流速為1.0ml/min時，色譜峰保留時間適中，分離度最好，重復性最好。1.3對照品溶液的制備分別精密稱取蕓香柚皮苷對照品、柚皮苷對照品、橙皮苷對照品、新橙皮苷對照品、川陳皮素對照品、橘紅素對照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋制成每1ml含40ug、70ug、40ug、80ug、40ug、80ug的混合溶液，即得對照品溶液。1.4供試品溶液的制備分別取枳實藥材中粉0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密甲醇50ml，密塞，稱定重量，回流提取1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。1.5測定法分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液10μl，注入高效液相色譜儀，測定。1.6分析時間的確定在上述色譜條件下進樣考察120分鐘，結果表明，在70分鐘內(nèi)，樣品中所有峰均可被完全洗脫出，故分析時間確定為70分鐘。1.7枳實方法學考察。（1）穩(wěn)定性試驗分別取枳實同一供試品溶液，在上述液相色譜條件下，分別在0、2、4、6、12、24小時進行檢測，每次進樣10μl，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果枳實主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3%，表明供試品溶液24小時內(nèi)較穩(wěn)定。（2）精密度試驗取同一份枳實供試品溶液，在上述液相色譜條件下，重復進樣6次，每次進樣10μl，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果枳實主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3%，表明儀器精密度良好。（3）重復性試驗取枳實同一批樣品，按供試品制備方法制備6份供試品溶液，在上述液相色譜條件下，進樣分析，考察主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果枳實主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3%，表明該方法重復性好。1.8枳實準指紋圖譜的制定按擬定的方法制備10批次枳實藥材供試品，依法測定，記錄色譜圖；用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)以十批成品指紋圖譜為基礎獲得標準指紋圖譜。見圖1、2。通過軟件匹配，確定17個共有峰，與對照品溶液比較，其中3號峰為蕓香柚皮苷，4號峰為柚皮苷，5號峰為橙皮苷，6號峰為新橙皮苷，14號峰為川陳皮素，15號峰為橘紅素，本發(fā)明的標準指紋圖譜中包含了枳實中已知的多個化合物，具有高度的可靠性，見附圖3。1.9枳實藥材相似度評價以中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件生成的枳實標準指紋圖譜為參照，計算相似度，10批枳實藥材的相似度大于0.90，相似度較好，因此確定為與標準指紋圖譜比較，枳實藥材的限度標準定為相似度應大于0.9。結果見表3。表310批枳實藥材HPLC指紋圖譜相似度評價結果表S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10對照圖譜S11.0000.9090.9420.9230.9450.9170.9350.9510.9510.9020.946S20.9091.0000.9160.9920.9840.9040.9940.9750.9750.9360.978S30.9420.9161.0000.9240.9460.9450.9260.9080.9160.9130.975S40.9230.9920.9241.0000.9690.9160.9180.9200.9800.9580.951S50.9450.9840.9460.9691.0000.9070.9720.9530.9530.9620.961S60.9170.9040.9450.9160.9071.0000.9180.9460.9580.9070.958S70.9350.9940.9260.9180.9720.9181.0000.9120.9270.9110.982S80.9510.9750.9080.9200.9530.9460.9121.0000.9020.9150.939S90.9510.9750.9160.9800.9530.9580.9270.9021.0000.9060.943S100.9020.9360.9130.9580.9620.9070.9110.9150.9061.0000.917對照圖譜0.9460.9780.9750.9510.9610.9580.9820.9390.9430.9171.000實施例2：標準指紋圖譜在鑒別枳實藥材中的用途。1.1儀器與試藥：安捷倫1260高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機器（G-1311C）、二元泵（G-1311C）、標準自動進樣器（G-1329B）、智能化柱溫箱（G-1316A）、DAD檢測器（G-1314B）、Agilent1260Infinity色譜工作站（美國安捷倫科技有限公司）；SB-5200D超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；FAZ004B分析天平（上海佑科）；BT125D電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）。1.2枳實藥材HPLC指紋圖譜的測定。（1）供試品溶液的制備分別取枳實藥材中粉0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲提取1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。（2）色譜條件分析色譜柱為Unitary-C18，（5μm，4.6mm×250mm）；柱溫：30℃；檢測波長為280nm、215nm，切換時間為0min、24.01min；進樣量為10μl；流速：1.0ml/min；分析時間為70min；流動相為流動相A為乙腈，流動相B為0.1％磷酸溶液；采用梯度洗脫方式：0min→25min→25.01min→35min→60min→70min，乙腈20%→24%→30%→40%→95%→100%。（3）測定結果分析測定了多批隨機購買的枳實藥材，檢測到其中2批與枳實標準指紋圖譜比對有明顯的共有峰缺失（如附圖4，其中2號峰、4號峰、6號峰、7號峰、8號峰、10號峰、11號峰、12號峰、13號峰、16號峰、17號峰缺失）。另外，采用國家藥監(jiān)局頒布的指紋圖譜相似度評價軟件的相似度評價。結果表明這兩批藥材與標準指紋圖譜的相似度在0.2以下。因此，可以判斷該批次枳實藥材質(zhì)量不合格。根據(jù)根據(jù)實施例1與對照品溶液比對的色譜峰定性鑒別結果，其中4號峰為柚皮苷，6號峰為新橙皮苷，這些指標成分是枳實中非常重要的活性成分，這從另一個方面驗證了上述“該批次枳實藥材質(zhì)量不合格”的結論是正確的。因此，通過構建HPLC指紋圖譜及分析，可以有效評價枳實藥材的質(zhì)量狀況，達到監(jiān)控枳實藥材的質(zhì)量及鑒別真?zhèn)蔚哪康?。當前?頁1 2 3