本發(fā)明涉及一種電致化學發(fā)光有機氯傳感器的制備方法。屬于新型納米功能材料與生物傳感器技術領域。
背景技術：
有機氯農藥是用于防治植物病、蟲害的組成成分中含有有機氯元素的有機化合物。其中以苯為原料的有機氯農藥，如殺蟲劑DDT、殺螨劑三氯殺螨砜、殺菌劑五氯硝基苯等，這類有機氯農藥結構較穩(wěn)定，生物體內酶難于降解，所以積存在動、植物體內的有機氯農藥分子消失緩慢。由于這一特性，它通過生物富集和食物鏈的作用，使得環(huán)境中的殘留農藥會進一步得到富集和擴散。通過食物鏈進入人體的有機氯農藥能在肝、腎、心臟等組織中蓄積，特別是由于這類農藥脂溶性大，所以在體內脂肪中的積累儲存更突出。蓄積的殘留農藥也能通過母乳排出，或轉入卵蛋等組織，影響后代。
目前，檢測有機氯農藥的方法主要有色譜法、質譜法等。此類方法儀器貴重、操作復雜，化驗人員需要專業(yè)培訓后才能進行檢測。因此，研發(fā)成本低、檢測快、靈敏度高、特異性強的有機氯農藥傳感器具有重要意義。
電致化學發(fā)光傳感器由于其靈敏度高、特異性好、操作簡便等優(yōu)點被廣泛應用于臨床診斷、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測等領域。制備性能優(yōu)越的電致化學發(fā)光傳感器，其最關鍵技術就是發(fā)光強度及穩(wěn)定性和免疫分子的有效固定及重現(xiàn)性等性能的提高。二氧化鈦是應用最為廣泛的一種光催化劑材料，由于片狀二氧化鈦納米材料能夠暴露更多的高指數(shù)晶面，具有更高的光催化活性，二氧化鈦納米片具有比納米粒子更好地應用前景，對于二氧化鈦納米片的研究也備受關注。同時，二氧化鈦導電性差也限制了由單一二氧化鈦納米材料構建的電致化學發(fā)光傳感器的靈敏度普遍不高，不利于實際應用。但是，在半導體納米材料上修飾或復合特殊的納米材料，可以有效提高半導體表面的共振能量轉移，產生更強的發(fā)光強度，并大大提高檢測靈敏度。因此，設計、制備高效、穩(wěn)定的二氧化鈦納米片及其修飾物是制備電致化學發(fā)光傳感器的關鍵技術。
二硫化鉬（化學式為MoS2）納米材料，具有二維層狀結構，是應用最廣泛的固體潤滑劑之一。其剝離后的片狀二維納米材料，是性能優(yōu)異的半導體納米材料，除了具有大的比表面積，可以作為催化劑和生物抗體的載體，提高負載量，同時作為助催化劑也具有優(yōu)良的電子傳遞性能。
目前，大多數(shù)的合成手段都是分開合成后，再將催化劑與載體進行復合，過程繁瑣，產率不高。因此，對于原位復合制備具有優(yōu)良電致化學發(fā)光性能的二維納米復合材料具有廣泛的應用前景和重要的科學意義。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種制備簡單、靈敏度高、檢測快速、特異性強的電致化學發(fā)光生物傳感器的制備方法，所制備的傳感器，可用于有機氯農藥的快速、靈敏檢測?；诖四康模景l(fā)明首先制備了一種新型二維納米復合材料——二氧化鈦/二硫化鉬復合材料，即鐵、錳共摻雜二氧化鈦納米方塊與二硫化鉬原位復合的二維納米復合材料FeMn-TiO2/MoS2，利用該材料的良好的生物相容性和大的比表面積，負載上有機氯農藥抗體，在進行檢測時，由于鐵、錳共摻雜二氧化鈦可以催化過氧化氫原位生成O2，并與底液中的K2S2O8進行電化學反應，產生電致化學發(fā)光信號，再利用抗體與抗原的特異性定量結合對電子傳輸能力的影響，使得電流強度降低，從而降低發(fā)光強度，最終實現(xiàn)了采用無標記的電致化學發(fā)光方法檢測有機氯農藥的電致化學發(fā)光傳感器的構建。
本發(fā)明采用的技術方案如下：
1. 一種檢測有機氯農藥的電致化學發(fā)光生物傳感器的制備方法，其特征在于所述的電致化學發(fā)光生物傳感器由工作電極、FeMn-TiO2/MoS2、有機氯農藥抗體、牛血清白蛋白組成；所述的FeMn-TiO2/MoS2為鐵、錳共摻雜二氧化鈦納米方塊與二硫化鉬原位復合的二維納米復合材料；
其特征在于，所述的制備方法包括以下制備步驟：
a. 制備FeMn-TiO2/MoS2；
b. 制備電致化學發(fā)光生物傳感器；
其中，步驟a制備FeMn-TiO2/MoS2的具體步驟為：
（1）取0.6 g二硫化鉬粉末、0.2 ~ 2.0 mmol鐵鹽和0.2 ~ 2.0 mmol錳鹽共同加入到3~10 mL正丁基鋰溶液中，在氮氣保護和30 ~ 60 ℃下，攪拌12 ~ 48小時，得到反應后的溶液；
（2）利用非極性溶劑洗滌步驟（1）中反應后的溶液，然后在30 ~ 60 ℃下進行水浴超聲處理，處理完后，再利用非極性溶劑洗滌處理后的溶液，真空干燥，得到鐵、錳共插層的二硫化鉬納米材料；
（3）取10 ~ 500 mg步驟（2）制得的鐵、錳共插層的二硫化鉬納米材料加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌1小時后，邊攪拌邊緩慢加入0.5 ~ 0.8 mL氫氟酸，然后160~200 ℃下在反應釜中反應18 ~ 24小時；
（4）將步驟（3）所得的反應產物，用超純水和無水乙醇離心洗滌三次后，50 ℃下真空干燥，即制得FeMn-TiO2/MoS2；
所述的正丁基鋰溶液為正丁基鋰的己烷溶液，濃度為1.6 mol/L；
所述的鐵鹽選自下列之一：硫酸鐵、氯化鐵、硝酸鐵、乙酸鐵、有機鐵化合物；
所述的錳鹽選自下列之一：硫酸錳、氯化錳、硝酸錳、乙酸錳、有機錳化合物；
所述的非極性溶劑選自下列之一：己烷、環(huán)己烷、四氯化碳、苯、甲苯；
所述的水浴超聲處理，處理時間為1小時；
步驟b制備電致化學發(fā)光生物傳感器的具體步驟為：
（1）以ITO導電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂8~12 μL的FeMn-TiO2/MoS2溶膠，室溫下晾干；
（2）將步驟（1）中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂8~12 μL 10 μg/mL的有機氯農藥抗體溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（3）將步驟（2）中得到的電極用PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂8~12 μL 濃度為100 μg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（4）將步驟（3）中得到的電極用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得有機氯農藥傳感器；
所述的FeMn-TiO2/MoS2溶膠為將50 mg 的FeMn-TiO2/MoS2粉末溶于10 mL超純水中，并超聲30 min后制得的水溶膠；
所述的PBS為10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4。
2. 本發(fā)明所述的制備方法所制備的電致化學發(fā)光生物傳感器的應用，其特征在于，包括如下應用步驟：
a. 標準溶液配制：配制一組包括空白標樣在內的不同濃度的有機氯農藥標準溶液；
b. 工作電極修飾：將如權利要求1所述的制備方法所制備的電致化學發(fā)光生物傳感器為工作電極，將步驟a中配制的不同濃度的有機氯農藥標準溶液分別滴涂到工作電極表面，4 ℃ 冰箱中保存；
c. 工作曲線繪制：將Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極，與步驟b所修飾好的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接到電致化學發(fā)光檢測設備上；在電解槽中先后加入15 mL的K2S2O8溶液和100 μL 的H2O2溶液；用循環(huán)伏安法對組裝的工作電極施加循環(huán)電壓；根據(jù)所得的電致化學發(fā)光的光信號強度與有機氯農藥抗原標準溶液濃度之間的關系，繪制工作曲線；空白標樣的光信號強度記為D0，含有不同濃度的有機氯農藥標準溶液的光信號強度記為Di，響應光信號強度降低的差值為ΔD = D0-Di，ΔD 與有機氯農藥標準溶液的質量濃度C 之間成線性關系，繪制ΔD －C 工作曲線；
d. 有機氯農藥的檢測：用待測樣品代替步驟a中的有機氯農藥標準溶液，按照步驟b和c中的方法進行檢測，根據(jù)響應光信號強度降低的差值ΔD 和工作曲線，得到待測樣品中有機氯農藥的含量；
所述的K2S2O8溶液由1 mol K2S2O8和1 mol KCl溶于10 L 的pH=6.5緩沖溶液中制備得到，所述的pH=6.5緩沖溶液為pH值為6.5的磷酸鹽緩沖溶液；
所述的H2O2溶液為過氧化氫水溶液，所述的過氧化氫水溶液的濃度為10%。
3. 本發(fā)明所述的檢測有機氯農藥的電致化學發(fā)光生物傳感器的制備方法和應用，所述的有機氯農藥選自下列之一：三氯殺螨砜、三氯殺螨醇、五氯硝基苯。
本發(fā)明的有益成果
（1）本發(fā)明所述的電致化學發(fā)光生物傳感器制備簡單，操作方便，實現(xiàn)了對有機氯農藥的快速、靈敏、高選擇性檢測，并且成本低，可應用于便攜式檢測，具有市場發(fā)展前景；
（2）本發(fā)明首次采用原位復合的方法制備了二維納米材料FeMn-TiO2/MoS2，該方法主要有三個優(yōu)勢：一是，由于鐵、錳共同在二氧化鈦納米方塊上的原位生長而充分與二氧化鈦納米方塊接觸，利用鐵、錳的金屬表面等離子體作用以及二者的協(xié)同作用，有效提高了半導體基質共振能量轉移能力，解決了二氧化鈦納米片雖然比表面積比較大及介孔特性適用于電致化學發(fā)光基質材料，但是電致化學發(fā)光信號不穩(wěn)定的技術問題；二是，由于二硫化鉬片狀二維納米材料的負載特性和二氧化鈦納米方塊在其上的充分分散，極大地增大了電致化學發(fā)光強度，解決了二氧化鈦納米片導電性差和電致化學發(fā)光強度弱而不利于制備電致化學發(fā)光傳感器的技術問題；三是，由于鐵、錳離子在該過程中既作為插層材料又作為反應摻雜材料，最后采用原位復合的方法實現(xiàn)了該復合材料的一鍋制備，不但節(jié)省了時間、材料損耗，而且使得制備的鐵、錳共摻雜的二氧化鈦納米方塊能夠更好地均勻分散到二硫化鉬片狀二維納米材料上面。因此，該材料的有效制備，具有重要的科學意義和應用價值；
（3）本發(fā)明首次將FeMn-TiO2/MoS2應用于電致化學發(fā)光生物傳感器的制備中，顯著提高了電致化學發(fā)光的強度和穩(wěn)定性，大大提高了電致化學發(fā)光傳感器的檢測靈敏度，使得電致化學發(fā)光生物傳感器實現(xiàn)了在實際工作中的應用；該材料的應用，也為相關生物傳感器，如光電化學傳感器、電化學傳感器等提供了技術參考，具有廣泛的潛在使用價值。
具體實施方式
實施例1 FeMn-TiO2/MoS2的制備
（1）取0.6 g二硫化鉬粉末、0.2 mmol鐵鹽和0.2 mmol錳鹽共同加入到3mL正丁基鋰溶液中，在氮氣保護和60 ℃下，攪拌12小時，得到反應后的溶液；
（2）利用非極性溶劑洗滌步驟（1）中反應后的溶液，然后在60 ℃下進行水浴超聲處理，處理完后，再利用非極性溶劑洗滌處理后的溶液，真空干燥，得到鐵、錳共插層的二硫化鉬納米材料；
（3）取500 mg步驟（2）制得的鐵、錳共插層的二硫化鉬納米材料加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌1小時后，邊攪拌邊緩慢加入0.5 mL氫氟酸，然后160 ℃下在反應釜中反應18小時；
（4）將步驟（3）所得的反應產物，用超純水和無水乙醇離心洗滌三次后，50 ℃下真空干燥，即制得FeMn-TiO2/MoS2；
所述的正丁基鋰溶液為正丁基鋰的己烷溶液，濃度為1.6 mol/L；
所述的鐵鹽為硫酸鐵；
所述的錳鹽為硫酸錳；
所述的非極性溶劑為己烷；
所述的水浴超聲處理，處理時間為1小時。
實施例2 FeMn-TiO2/MoS2的制備
（1）取0.6 g二硫化鉬粉末、1.0 mmol鐵鹽和1.0 mmol錳鹽共同加入到5 mL正丁基鋰溶液中，在氮氣保護和30 ℃下，攪拌24小時，得到反應后的溶液；
（2）利用非極性溶劑洗滌步驟（1）中反應后的溶液，然后在30 ℃下進行水浴超聲處理，處理完后，再利用非極性溶劑洗滌處理后的溶液，真空干燥，得到鐵、錳共插層的二硫化鉬納米材料；
（3）取200 mg步驟（2）制得的鐵、錳共插層的二硫化鉬納米材料加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌1小時后，邊攪拌邊緩慢加入0.6 mL氫氟酸，然后180 ℃下在反應釜中反應20小時；
（4）將步驟（3）所得的反應產物，用超純水和無水乙醇離心洗滌三次后，50 ℃下真空干燥，即制得FeMn-TiO2/MoS2；
所述的正丁基鋰溶液為正丁基鋰的己烷溶液，濃度為1.6 mol/L；
所述的鐵鹽為氯化鐵；
所述的錳鹽為氯化錳；
所述的非極性溶劑為四氯化碳；
所述的水浴超聲處理，處理時間為1小時。
實施例3 FeMn-TiO2/MoS2的制備
（1）取0.6 g二硫化鉬粉末、2.0 mmol鐵鹽和2.0 mmol錳鹽共同加入到10 mL正丁基鋰溶液中，在氮氣保護和50 ℃下，攪拌48小時，得到反應后的溶液；
（2）利用非極性溶劑洗滌步驟（1）中反應后的溶液，然后在50 ℃下進行水浴超聲處理，處理完后，再利用非極性溶劑洗滌處理后的溶液，真空干燥，得到鐵、錳共插層的二硫化鉬納米材料；
（3）取10 mg步驟（2）制得的鐵、錳共插層的二硫化鉬納米材料加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌1小時后，邊攪拌邊緩慢加入0.8 mL氫氟酸，然后200 ℃下在反應釜中反應24小時；
（4）將步驟（3）所得的反應產物，用超純水和無水乙醇離心洗滌三次后，50 ℃下真空干燥，即制得FeMn-TiO2/MoS2；
所述的正丁基鋰溶液為正丁基鋰的己烷溶液，濃度為1.6 mol/L；
所述的鐵鹽為乙酸鐵；
所述的錳鹽為乙酸錳；
所述的非極性溶劑為苯；
所述的水浴超聲處理，處理時間為1小時。
實施例4 電致化學發(fā)光生物傳感器的制備方法
（1）將寬為1 cm、長為4 cm的ITO導電玻璃作為工作電極，在電極表面滴涂8 μL的FeMn-TiO2/MoS2溶膠，室溫下晾干；
（2）將步驟（1）中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂8 μL 10 μg/mL的有機氯農藥抗體溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（3）將步驟（2）中得到的電極用PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂8 μL 濃度為100 μg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（4）將步驟（3）中得到的電極用PBS清洗，4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得有機氯農藥傳感器；
所述的Mn-TiO2/MoS2溶膠為將50 mg 的FeMn-TiO2/MoS2粉末溶于10 mL超純水中，并超聲30 min后制得的水溶膠；
所述的PBS為10mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4，所述的有機氯農藥為三氯殺螨砜。
實施例5 電致化學發(fā)光生物傳感器的制備方法
（1）將寬為1 cm、長為4 cm的ITO導電玻璃作為工作電極，在電極表面滴涂10 μL的FeMn-TiO2/MoS2溶膠，室溫下晾干；
（2）將步驟（1）中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂10 μL 10 μg/mL的有機氯農藥抗體溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（3）將步驟（2）中得到的電極用PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂10 μL 濃度為100 μg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（4）將步驟（3）中得到的電極用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得有機氯農藥傳感器；
所述的FeMn-TiO2/MoS2溶膠為將50 mg 的Mn-TiO2/MoS2粉末溶于10 mL超純水中，并超聲30 min后制得的水溶膠；
所述的PBS為10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4，所述的有機氯農藥為三氯殺螨醇。
實施例6 電致化學發(fā)光生物傳感器的制備方法
（1）將寬為1 cm、長為4 cm的ITO導電玻璃作為工作電極，在電極表面滴涂12 μL的FeMn-TiO2/MoS2溶膠，室溫下晾干；
（2）將步驟（1）中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂12 μL 10 μg/mL的有機氯農藥抗體溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（3）將步驟（2）中得到的電極用PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂12 μL 濃度為100 μg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（4）將步驟（3）中得到的電極用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得有機氯農藥傳感器；
所述的Mn-TiO2/MoS2溶膠為將50 mg 的FeMn-TiO2/MoS2粉末溶于10 mL超純水中，并超聲30 min后制得的水溶膠；
所述的PBS為10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4，所述的有機氯農藥為氯硝基苯。
實施例7 實施例1~6制備的電致化學發(fā)光生物傳感器，應用于有機氯農藥的檢測，步驟如下：
（1）標準溶液配制：配制一組包括空白標樣在內的不同濃度的有機氯農藥標準溶液；
（2）工作電極修飾：將如權利要求1所述的制備方法所制備的電致化學發(fā)光生物傳感器為工作電極，將步驟（1）中配制的不同濃度的有機氯農藥標準溶液分別滴涂到工作電極表面，4 ℃ 冰箱中保存；
（3）工作曲線繪制：將飽和甘汞電極作為參比電極，鉑絲電極作為輔助電極，與步驟（2）所修飾好的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接到電致化學發(fā)光檢測設備上；在電解槽中先后加入15 mL的K2S2O8溶液和100 μL 的H2O2溶液；用循環(huán)伏安法對組裝的工作電極施加循環(huán)電壓；根據(jù)所得的電致化學發(fā)光的光信號強度與有機氯農藥抗原標準溶液濃度之間的關系，繪制工作曲線；空白標樣的光信號強度記為D0，含有不同濃度的有機氯農藥標準溶液的光信號強度記為Di，響應光信號強度降低的差值為ΔD = D0-Di，ΔD 與有機氯農藥標準溶液的質量濃度C 之間成線性關系，繪制ΔD －C 工作曲線；有機氯農藥的線性檢測范圍為：0.003~100 ng/mL，檢出限為：1.1 pg/mL；
（4）有機氯農藥的檢測：用待測樣品代替步驟a中的有機氯農藥標準溶液，按照步驟b和c中的方法進行檢測，根據(jù)響應光信號強度降低的差值ΔD 和工作曲線，得到待測樣品中有機氯農藥的含量；
所述的K2S2O8溶液由1 mol K2S2O8和1 mol KCl溶于10 L 的pH=6.5緩沖溶液中制備得到，所述的pH=6.5緩沖溶液為pH值為6.5的磷酸鹽緩沖溶液；
所述的H2O2溶液為過氧化氫水溶液，所述的過氧化氫水溶液的濃度為10%。