本發(fā)明涉及一種檢測(cè)貓弓形蟲血清抗體檢測(cè)試劑盒及其制備方法，屬于獸醫(yī)生物技術(shù)領(lǐng)域。應(yīng)用于檢測(cè)貓弓形蟲病。

背景技術(shù)：

貓弓形蟲病是一種重要的人畜共患寄生蟲病。貓是該病的終末宿主，幾乎能感染所有溫血?jiǎng)游铮蓪?dǎo)致孕婦(畜)流產(chǎn)，死胎、畸形、胎兒(幼畜)生長(zhǎng)發(fā)育受阻、死亡。人類呈隱性感染。人群中的感染率較高，全球有約六分之一的人感染弓形蟲病。弓形蟲的感染會(huì)對(duì)免疫力低下的人群造成嚴(yán)重影響，因其會(huì)對(duì)人類的健康造成嚴(yán)重的威脅，所以在人醫(yī)上是一種重要的疾病。

已有研究發(fā)現(xiàn)，兔、鼠、狗、貓等十幾種動(dòng)物身上發(fā)現(xiàn)了弓形蟲。貓是弓形蟲的終末宿主，貓弓形蟲的感染率為14.04％～78％?；疾?dòng)物和帶蟲動(dòng)物都可成為傳染源。其中患病的貓科動(dòng)物的糞便中存在大量的卵囊。因?yàn)槠浠顒?dòng)范圍較廣泛可對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，所以對(duì)貓科動(dòng)物弓形蟲的檢測(cè)是控制該病的重點(diǎn)。近年來(lái)，由于人們生活水平的提高，家庭飼養(yǎng)貓、狗等寵物的數(shù)量逐年增加伴隨而來(lái)的便是人類的感染率逐漸上升。為了避免這種現(xiàn)象的繼續(xù)發(fā)展，建立一種靈敏、特異的檢測(cè)貓類動(dòng)物弓形蟲的方法顯得尤其重要。

目前診斷弓形蟲的方法主要包括:病原學(xué)、分子生物學(xué)及免疫學(xué)等方法。病原學(xué)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、敏感性低。分子生物學(xué)技術(shù)具有較高的敏感性和特異性,但需要昂貴的儀器設(shè)備,操作過(guò)程較復(fù)雜。免疫學(xué)檢測(cè)方法包括染色試驗(yàn)(DT)、間接熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)、直接凝集試驗(yàn)(DAT)、改良凝集實(shí)驗(yàn)(MAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),綜合比對(duì)各種檢測(cè)方法，ELISA是最合適的檢測(cè)方法，因其敏感性和特異性均較高，且危險(xiǎn)性較低，所以適用于大量樣本的檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種貓弓形蟲血清抗體間接ELISA診斷試劑盒。本試劑盒以原核表達(dá)的重組蛋白為基礎(chǔ)，通過(guò)酶聯(lián)免疫技術(shù)研發(fā)而成。具有安全，高效，操作簡(jiǎn)便，快速，可商品化大量生產(chǎn)，制造成本低，易于推廣等特點(diǎn)。本發(fā)明可應(yīng)用于貓弓形蟲病的檢測(cè)。

技術(shù)方案

本發(fā)明的目的是以原核表達(dá)的重組蛋白為基礎(chǔ),通過(guò)酶聯(lián)免疫技術(shù)研制一種檢測(cè)貓弓形蟲血清抗體的試劑盒。首先是貓弓形表面蛋白SAG3的表達(dá)及；重組蛋白包被酶標(biāo)板；間接ELISA最佳反應(yīng)條件的確定；試劑盒的組裝；試劑盒阻斷試驗(yàn)、特異性、敏感性、重復(fù)性試驗(yàn)；初步應(yīng)用；最后成功制成貓弓形蟲抗體檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明所述的一種貓弓形蟲血清抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于主要由以下部分組成：

包被抗原、包被液、封閉液、樣品稀釋液及洗滌液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗、底物顯色液、試驗(yàn)終止液、陽(yáng)性參照血清、陰性參照血清、96孔可拆聚苯乙烯塑料反應(yīng)板構(gòu)成：

包被抗原為弓形蟲表面蛋白SAG3，蛋白濃度為3.7μg/μL；

包被液為0.05M碳酸鹽緩沖液pH 9.6；

封閉液為5％的脫脂奶粉；

樣品稀釋液及洗滌液為0.5％Tween-20的磷酸鹽緩沖液；

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗為山羊抗貓IgG；

底物顯色液為TMB溶液；

終止液為2mol/L的硫酸溶液；

參照陽(yáng)性血清和陰性參照血清。

本發(fā)明所述的貓弓形蟲血清抗體的間接ELISA試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

1、抗原制備：利用基因工程技術(shù)將目的基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，鑒定出表達(dá)正確后挑取菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行保菌；對(duì)鑒定正確的重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)后，離心收集菌體，用PBS將菌體重懸，超聲儀破碎菌體后，1200rpm離心10min中后取沉淀；用2M尿素充分吹打沉淀后8000rpm離心10min后棄上清取沉淀，如此反復(fù)進(jìn)行5次，用8M尿素將沉淀充分溶解，8000rpm離心10min，取上清，棄沉淀；上清便為純化的SAG3蛋白；

2、SAG3蛋白的透析與復(fù)性：將透析袋放入蒸餾水中浸泡10min進(jìn)行活化；把純化后的蛋白放入活化好的透析袋中，用密封夾子將其夾緊；取燒杯分別加入6M、4M、2M、1M、0M尿素透析液，置于磁力攪拌器上，4℃透析6h以上；透析結(jié)束后吸取透析袋中的蛋白，12000rpm離心5min后，吸取上清，棄掉沉淀；上清液便為SAG3蛋白，-20℃保存；

3、包被液：取1.59g NaCO₃、2.93g NaHCO₃、加入80ml水，玻璃棒攪拌溶解，PH值調(diào)節(jié)至9.6，取100ml容量瓶定容至100ml，4℃保存；

4、封閉液：取脫脂奶粉5g，加入100ml PBST溶解，封閉液需要先用現(xiàn)配；

5、樣品稀釋液及洗滌液(PBST)：取NaCl 8g、KCl 0.2g、NaHPO₄.12H₂O 2.9g、KH₂PO₄0.2g、Tween-20 0.5ml加入800ml水?dāng)嚢枞芙猓?000ml容量瓶定容；

6、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗：商品化的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗貓IgG；

7、底物顯色液：底物顯色液A：醋酸鈉13.6g、檸檬酸1.6g、30％雙氧水0.3ml加入蒸餾水定容至500ml；底物顯色液B：二胺四乙酸二鈉0.2g、檸檬酸0.95g、甘油50ml、TMB溶于3mlDMSO加蒸餾水定容至500ml；

8、終止液：取H₂SO₄ 22.2ml，水178.8ml，室溫保存。

本發(fā)明將純化好的SAG3蛋白包被96孔聚乙烯板，建立間接ELISA方法，對(duì)貓血清抗體進(jìn)行檢測(cè)。解決了目前貓血清抗體檢測(cè)弓形蟲的這一空白，本方法克服了已有檢測(cè)弓形蟲方法的特異性弱，敏感性低等缺點(diǎn)，對(duì)檢測(cè)貓弓形蟲病的提供了方法。

本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理：將弓形蟲表面抗原SAG3蛋白包被于96孔聚乙烯酶標(biāo)板，使其形成固相載體，PBST進(jìn)行洗板清除孔內(nèi)游離的抗體，加入待檢血清，血清中的抗體可與固相載體上的抗原結(jié)合，洗板清除游結(jié)合不牢固的部分，加入HRP標(biāo)山羊抗貓IgG，與酶標(biāo)板上的抗原-抗體復(fù)合物相結(jié)合，再次洗板。加入TMB底物顯色液，放入37℃溫箱進(jìn)行孵育。加入硫酸溶液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)的吸光度值(OD_450nm值)，OD_450nm值大小與相應(yīng)的待檢血清抗體的含量呈正相關(guān)。

本發(fā)明積極效果在于：利用弓形蟲表面蛋白SAG3作為包被抗原，檢測(cè)血清中弓形蟲抗體，經(jīng)過(guò)HRP標(biāo)記的山羊抗貓IgG作為檢測(cè)抗體，建立間接了ELISA方法，具有較強(qiáng)的特異性、敏感性和重復(fù)性；本發(fā)明主要試劑除洗滌液是粉末狀以外，水溶解后可直接應(yīng)用，用于本試劑盒主要面對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)洗滌液為基本溶液，其余均以液體工作液的形式存在，使用方便；本發(fā)明為大樣本檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查提供了一種既方便又可靠的免疫學(xué)診斷方法；為貓弓形蟲病的診斷提供了依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1為DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但實(shí)施例不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做出局限。

實(shí)施例1：

包被抗原SAG3蛋白的制備

利用基因工程技術(shù)將目的基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，鑒定出表達(dá)正確后挑取菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行保菌。對(duì)鑒定正確的重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)后，離心收集菌體，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)觀察表達(dá)結(jié)果(見(jiàn)圖1)；

1)配置300mL的LB培養(yǎng)基，高壓滅菌；

2)將搖菌過(guò)夜的5mL菌液移入(1)中的培養(yǎng)基中，并加入500μl的卡那霉素置于37℃搖床中培養(yǎng)1.5～2h隨時(shí)觀察；

3)加入300μl IPTG，繼續(xù)置于搖床中誘導(dǎo)4～5h隨時(shí)觀察；

4)收集菌液，4℃8000rpm×10min離心(下同)；

5)PBS將沉淀重懸，超聲破碎。離心，棄上清；

6)用2M尿素重懸沉淀，離心，棄上清，反復(fù)此步驟3～4次；

7)用8M尿素將沉淀重懸，且要盡快溶解沉淀；

8)測(cè)定蛋白濃度；

9)配制6M；4M；2M；1M；0M尿素進(jìn)行梯度透析。

實(shí)施例2：

間接ELISA方法的建立

1、抗原包被濃度及血清稀釋度

抗原的包被量為0.375μg/孔和血清稀釋倍數(shù)1：800；

2、酶標(biāo)二抗工作濃度

標(biāo)二抗最佳工作濃度為1:5000；

3、最佳封閉劑的選擇

封閉劑為5％脫脂奶粉；

4、酶標(biāo)二抗的最佳孵育時(shí)間

二抗孵育時(shí)間為45min；

5、性能的測(cè)定

(1)敏感性試驗(yàn)

敏感性為1:25600(見(jiàn)表1)；

表1

敏感性試驗(yàn)結(jié)果

(2)特異性試驗(yàn)

應(yīng)用已建立好的間接ELISA方法，對(duì)貓杯狀病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和貓傳染性胃腸炎病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該方法與兩種標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)，特異性較好(見(jiàn)表3)；表2

特異性試驗(yàn)結(jié)果

(3)重復(fù)性試驗(yàn)

選用11份血清經(jīng)建立的雙抗夾心ELISA方法進(jìn)行批間批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)后得到，批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)最大值為4.32％，批間變異系數(shù)最大值為5.51％，表明該方法重復(fù)性較好；

批內(nèi)批間重復(fù)性試驗(yàn)

實(shí)施例3

檢測(cè)貓弓形蟲血清抗體間接ELISA試劑盒成份的組裝

檢測(cè)試劑盒包括以下組分：

1、弓形蟲表面抗原SAG3蛋白(-20℃保存)；

2、包被液(0.05M碳酸鹽緩沖液)PH(9.6)：秤取NaCO₃1.59g；NaHCO₃2.93g；蒸餾水80mL，待其溶解后，調(diào)PH值9.6，定容至100mL；

3、封閉液：稱取5g脫脂奶粉加入PBST溶解后定容至100mL；

4、洗滌液及樣品稀釋液(PBST)：稱取NaCl 8g；KCl 0.2g；NaHPO₄.12H₂O 2.9g；KH₂PO₄0.2g；吐溫-200.5Ml；

5、TMB底物顯色液：按底物A液(稱取TMB 200mg，加入無(wú)水乙醇100mL，調(diào)PH值5.0，加雙蒸水定容至1000mL)，與底物B液(稱取檸檬酸9.33g，Na₂HPO₄14.60g，加入6.4mLH₂O₂，調(diào)PH值5.0，加雙蒸水定容至1000mL)1:1加入顯色；

6、終止液：吸取濃硫酸22.2mL后加入蒸餾水178.8mL；

7、陽(yáng)性參照血清(-20℃)；

8、陰性參照血清(-20℃)；

以上材料便是本發(fā)明的所有組分。

保存條件：參照血清及蛋白為-20℃保存。其余組分的保存溫度為4℃保存。

實(shí)施例4

間接ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)貓血清中弓形蟲抗體的檢測(cè)

利用本發(fā)明試劑盒對(duì)96份樣品進(jìn)行弓形蟲血清抗體的檢測(cè)，其步驟如下：

(1)取包被液對(duì)SAG3蛋白進(jìn)行稀釋，使蛋白濃度為0.375μg/孔包被96孔聚乙烯酶標(biāo)板，4℃包被過(guò)夜，洗板3次每次5min；

(2)加入封閉液，100uL/孔，37℃溫箱孵育2h；

(3)洗板同上；

(4)加待檢血清樣品：按1:800稀釋血清待檢樣品，100uL/孔，37℃溫箱孵育2h；

(5)洗板同上；

(6)加酶標(biāo)二抗：按1:5000稀釋，100uL/孔，37℃溫箱孵育45min；

(8)洗板同上；

(9)顯色：加入TMB底物顯色液，100uL/孔，37℃溫箱孵育15min；

(10)終止：加入終止液，100uL/孔；

(11)測(cè)OD值：酶標(biāo)儀測(cè)定OD₄₅₀值；

(12)結(jié)果判定：測(cè)定OD_450nm值后，依據(jù)臨界值來(lái)判斷樣品值；

對(duì)蘭州地區(qū)96份樣品檢測(cè)后，陽(yáng)性率為61％。