1.一種貓弓形蟲(chóng)血清抗體的間接ELISA試劑盒,其特征在于主要由以下部分組成:
包被抗原、包被液、封閉液、樣品稀釋液及洗滌液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗、底物顯色液、試驗(yàn)終止液、陽(yáng)性參照血清、陰性參照血清、96孔可拆聚苯乙烯塑料反應(yīng)板構(gòu)成:
包被抗原為弓形蟲(chóng)表面蛋白SAG3,蛋白濃度為3.7μg/μL;
包被液為0.05M碳酸鹽緩沖液pH 9.6;
封閉液為5%的脫脂奶粉;
樣品稀釋液及洗滌液為0.5% Tween-20的磷酸鹽緩沖液;
辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗為山羊抗貓IgG;
底物顯色液為T(mén)MB溶液;
終止液為2mol/L 的硫酸溶液;
參照陽(yáng)性血清和陰性參照血清。
2.如權(quán)利要求1所述的貓弓形蟲(chóng)血清抗體的間接ELISA試劑盒的制備方法,包括以下步驟:
1)抗原制備:利用基因工程技術(shù)將目的基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),鑒定出表達(dá)正確后挑取菌落,擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行保菌;對(duì)鑒定正確的重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)后,離心收集菌體,用PBS將菌體重懸,超聲儀破碎菌體后,1200rpm離心10min中后取沉淀;用2M尿素充分吹打沉淀后8000rpm離心10min 后棄上清取沉淀,如此反復(fù)進(jìn)行5次,用8M尿素將沉淀充分溶解,8000rpm離心10min,取上清,棄沉淀;上清便為純化的SAG3蛋白;
2)SAG3蛋白的透析與復(fù)性:將透析袋放入蒸餾水中浸泡10min進(jìn)行活化;把純化后的蛋白放入活化好的透析袋中,用密封夾子將其夾緊;取燒杯分別加入6M 、4M 、2M、1M、0M尿素透析液,置于磁力攪拌器上,4℃透析6h以上;透析結(jié)束后吸取透析袋中的蛋白,12000rpm離心5min后,吸取上清,棄掉沉淀;上清液便為SAG3蛋白,-20℃保存;
3)包被液:取1.59g NaCO3、2.93g NaHCO3、加入80ml水,玻璃棒攪拌溶解,PH值調(diào)節(jié)至9.6,取100ml容量瓶定容至100ml,4℃保存;
4)封閉液:取脫脂奶粉5g,加入100ml PBST溶解,封閉液需要先用現(xiàn)配;
5)樣品稀釋液及洗滌液(PBST):取NaCl 8g、KCl 0.2g、NaHPO4.12H2O 2.9g、KH2PO40.2g、Tween-20 0.5ml加入800ml水?dāng)嚢枞芙?,?000ml容量瓶定容;
6)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗:商品化的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗貓IgG;
7)底物顯色液:底物顯色液A:醋酸鈉13.6g、檸檬酸1.6g、30%雙氧水0.3ml加入蒸餾水定容至500ml;底物顯色液B:二胺四乙酸二鈉0.2g、檸檬酸0.95g、甘油50ml、TMB溶于3mlDMSO加蒸餾水定容至500ml;
8)終止液:取H2SO4 22.2ml,水178.8ml,室溫保存。