本發(fā)明屬于免疫診斷領(lǐng)域，具體涉及一種檢測血清淀粉樣蛋白的試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
：血清淀粉樣蛋白A(SerumamyloidA，SAA)是一種急性時相反應(yīng)蛋白，屬于載脂蛋白家族中的異質(zhì)類蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量約為12000。在急性時相反應(yīng)中，經(jīng)白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)和腫瘤壞死因子(Tumornecrosisfactors，TNF)刺激，SAA在肝臟中由被激活的巨噬細(xì)胞和纖維母細(xì)胞合成，可升高到最初濃度的100～1000倍。與C反應(yīng)蛋白(C-ReactiveProtein，CRP)類似，SAA是反映感染性疾病早期炎癥的敏感指標(biāo)，有助于診斷炎癥、評估其活性、監(jiān)控其活動及治療。目前，已有許多方法應(yīng)用于血清SAA的檢測，包括放射性免疫檢測法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫速率散射比濁法和微粒捕獲酶免疫法等。這些方法具有較好的敏感度和特異性，可用于自動化分析。但是，目前通過中國食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)審批的SAA試劑盒只有少數(shù)廠家，而且檢測范圍，靈敏度，特異性等標(biāo)準(zhǔn)都不高，難以滿足市場需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種檢測血清淀粉樣蛋白的試劑盒及其用途，基于膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法(PETIA)，可普遍用于各類全自動生化分析儀分析，使用時所需的測定時間短，特異性高，精密度好，準(zhǔn)確度高。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種檢測血清淀粉樣蛋白的試劑盒，包括試劑R1和試劑R2，所述試劑R1包括緩沖液，無機(jī)鹽，表面活性劑，防腐劑，穩(wěn)定劑及干擾消除蛋白；所述試劑R2包括緩沖液，無機(jī)鹽，表面活性劑，防腐劑，穩(wěn)定劑及聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔?；所述聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔锝宦?lián)有抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體；所述聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔餅榇笾睆骄郾揭蚁┠z乳顆粒和小直徑聚苯乙烯膠乳顆粒的混合物，所述大直徑聚苯乙烯膠乳顆粒平均粒徑為180nm～500nm，所述小直徑聚苯乙烯膠乳平均粒徑為32nm～82nm，大直徑聚苯乙烯膠乳顆粒:小直徑聚苯乙烯膠乳顆粒＝1:(2-4)。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述大直徑聚苯乙烯膠乳顆粒平均粒徑為180nm，所述小直徑聚苯乙烯膠乳平均粒徑為82nm，大直徑聚苯乙烯膠乳顆粒:小直徑聚苯乙烯膠乳顆粒＝1:2。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述聚苯乙烯膠乳顆粒混合物交聯(lián)抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體時采用的方法包括如下步驟：(1)在緩沖液中清洗羧基化的大直徑聚苯乙烯膠乳顆粒和小直徑聚苯乙烯膠乳顆粒，用所述緩沖液重懸得到膠乳微粒；(2)在所述膠乳微粒中加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽EDC和N-羥基硫代琥珀酰亞胺sulfo-NHS，混勻使溶解，室溫反應(yīng)，用緩沖液清洗反應(yīng)后的所述微粒，用所述緩沖液重懸；(3)采用緩沖液溶解抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體；(4)將經(jīng)步驟(2)得到的所述微粒和經(jīng)步驟(3)得到的所述抗體進(jìn)行混合，室溫反應(yīng)；(5)用緩沖液清洗經(jīng)步驟(4)處理后的所述微粒，并懸浮于含親水猝滅分子的偶聯(lián)緩沖液以封閉過量的反應(yīng)位點(diǎn)；(6)清洗經(jīng)步驟(5)處理后的所述微粒，在緩沖液中重懸，得到偶聯(lián)上抗體的膠乳顆粒。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，在所述步驟(1)中，所述重懸時加入分散劑以防止聚團(tuán)，所述分散劑為陰離子表面活性劑。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述分散劑為0.005％SDS(十二烷基硫酸鈉)或LAS(直鏈烷基苯磺酸鈉)。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(2)中，所述EDC和sulfo-NHS的使用濃度分別為20mg/mL和15mg/mL-18mg/mL。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(2)中，室溫反應(yīng)10-20min，所述步驟(4)中，室溫反應(yīng)2-4小時。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(4)中，所述親水猝滅分子為乙醇胺或Tris，濃度為100mM。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述緩沖液選自3-嗎啉-2-羥基丙磺酸、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸和3-[N-N-雙(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸；所述表面活性劑選自曲拉通X-100，月桂酸聚氧乙烯酯，油酸聚氧乙烯酯和十二胺聚氧乙烯醚；所述穩(wěn)定劑選自蔗糖、金屬絡(luò)合劑和抗氧化劑；所述干擾消除蛋白為Scantibodies公司的HBR阻斷劑；所述無機(jī)鹽選自氯化鈉，氯化鉀及硫酸鎂；所述防腐劑選自疊氮鈉、硫柳汞和Proclin300。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，每1升試劑R1中各組分的用量為：緩沖液7-15g，表面活性劑1-5mL，防腐劑0.1-0.4mL，穩(wěn)定劑8-12g，干擾消除蛋白1-5mL，無機(jī)鹽5-15g，余量為水；每1升試劑R2中各組分的用量為：包被SAA抗體的膠乳顆粒0.5-5g，緩沖液5-20g，表面活性劑1-4mL，防腐劑0.1-0.4mL，穩(wěn)定劑5-20g，無機(jī)鹽8-12g。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，每1升試劑R1中各組分的用量為：緩沖液9.76g，表面活性劑3.6mL，防腐劑0.2mL，穩(wěn)定劑10g，干擾消除蛋白4mL，無機(jī)鹽9g，余量為水；每1升試劑R2中各組分的用量為：包被SAA抗體的膠乳顆粒2.2g，緩沖液9.76g，表面活性劑2mL，防腐劑0.2mL，穩(wěn)定劑10g，無機(jī)鹽9g，余量為水。一種檢測血清淀粉樣蛋白的試劑盒的用途，用于檢測血清淀粉樣蛋白。本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明試劑盒利用膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法測定血清淀粉樣蛋白，放大了檢測信號，提高了檢測靈敏度，縮短了檢測時間。(2)本發(fā)明采用混合粒徑的膠乳試劑，其中小粒徑的膠乳顆粒比例大，提高了線性；同時含有一定比例的大粒徑的膠乳顆粒，靈敏度也比較高。(3)本發(fā)明試劑盒特別加入了防止干擾的物質(zhì)，抗干擾性能好。同時，表面活性劑的添加也提高了精密度。(4)使用全自動生化分析儀測定血清淀粉樣蛋白，不僅使操作更為簡便，提高自動化程度，而且還節(jié)約了少量樣品檢測實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)成本。全自動生化分析儀在多批次對少量樣品進(jìn)行檢測，和單批次對大量樣品檢測的成本幾乎相同；因此，全自動生化分析儀可以適用于對少量樣品的檢測，并且不提高經(jīng)濟(jì)成本。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1-5的試劑盒檢測SAA樣品時得到的吸光度變化曲線示意圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例通過提供一種檢測血清淀粉樣蛋白的試劑盒及其用途，解決了現(xiàn)有技術(shù)中試劑盒檢測范圍，靈敏度，特異性等標(biāo)準(zhǔn)都不高的缺陷，本發(fā)明試劑盒基于膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法(PETIA)，可普遍用于各類全自動生化分析儀分析，使用時所需的測定時間短，特異性高，精密度好，準(zhǔn)確度高。為了解決上述缺陷，本發(fā)明實(shí)施例的主要思路如下：本發(fā)明實(shí)施例檢測血清淀粉樣蛋白的試劑盒，包括試劑R1和試劑R2，所述試劑R1包括緩沖液，無機(jī)鹽，表面活性劑，防腐劑，穩(wěn)定劑及干擾消除蛋白；所述試劑R2包括緩沖液，無機(jī)鹽，表面活性劑，防腐劑，穩(wěn)定劑及聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔?；所述聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔锝宦?lián)有抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體；所述聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔餅榇笾睆骄郾揭蚁┠z乳顆粒和小直徑聚苯乙烯膠乳顆粒的混合物，所述大直徑聚苯乙烯膠乳顆粒平均粒徑為180nm～500nm，所述小直徑聚苯乙烯膠乳平均粒徑為32nm～82nm，大直徑聚苯乙烯膠乳顆粒:小直徑聚苯乙烯膠乳顆粒＝1:(2-4)。所述聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔锝宦?lián)抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體時采用的方法包括如下步驟：(1)在緩沖液中清洗羧基化的大直徑聚苯乙烯膠乳顆粒和小直徑聚苯乙烯膠乳顆粒，用所述緩沖液重懸得到膠乳微粒；(2)在所述膠乳微粒中加入EDC和sulfo-NHS，混勻使溶解，室溫反應(yīng)，用緩沖液清洗反應(yīng)后的所述微粒，用所述緩沖液重懸；(3)采用緩沖液溶解抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體；(4)將經(jīng)步驟(2)得到的所述微粒和經(jīng)步驟(3)得到的所述抗體進(jìn)行混合，室溫反應(yīng)；(5)用緩沖液清洗經(jīng)步驟(4)處理后的所述微粒，并懸浮于含親水猝滅分子的偶聯(lián)緩沖液以封閉過量的反應(yīng)位點(diǎn)；(6)清洗經(jīng)步驟(5)處理后的所述微粒，在緩沖液中重懸，得到偶聯(lián)上抗體的膠乳顆粒。為了讓本發(fā)明之上述和其它目的、特征、和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉數(shù)實(shí)施例，來說明本發(fā)明所述之檢測血清淀粉樣蛋白的試劑盒及其用途。實(shí)施例1試劑R1由以下成分組成：緩沖液(MES)，無機(jī)鹽(氯化鈉)，表面活性劑(曲拉通X-100)，防腐劑(Proclin300)，穩(wěn)定劑(蔗糖)及干擾消除蛋白(HBR阻斷劑)。試劑R2由以下成分組成：緩沖液(MES)，無機(jī)鹽(氯化鈉)，表面活性劑(曲拉通X-100)，防腐劑(Proclin300)，穩(wěn)定劑(蔗糖)及聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔?，所述聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔锝宦?lián)有抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體，偶聯(lián)抗體的膠乳制備步驟包括活化，偶聯(lián)，混合步驟，具體步驟如下：1.在偶聯(lián)緩沖液(50mMMES，pH6.0)中分別清洗各100mg羧基化的兩種平均粒徑為82nm和180nm膠乳微粒，然后按以下步驟對兩種膠乳進(jìn)行偶聯(lián)抗體反應(yīng)，用5mL偶聯(lián)緩沖液重懸，同時加入0.005％SDS以防止聚團(tuán)，偶聯(lián)緩沖液中避免加入含羧基，巰基和氨基的化合物。2.在上述微粒中加入100mg的EDC和75mg的sulfo-NHS，混勻使溶解。3.室溫反應(yīng)15分鐘。4.用偶聯(lián)緩沖液離心方法快速清洗微粒2次，后用5mL偶聯(lián)緩沖液超聲重懸。5.溶解抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體在5mL的偶聯(lián)緩沖液中，抗體蛋白濃度以提供微粒單層表面積基團(tuán)的1到10倍過量的配基為準(zhǔn)。6.立即將抗體蛋白和微粒粒子進(jìn)行混合。7.混合后室溫反應(yīng)2-4小時。8.用偶聯(lián)緩沖液清洗微粒，并再懸浮于含有100mM含親水猝滅分子(即乙醇胺或Tris)的偶聯(lián)緩沖液以封閉過量的反應(yīng)位點(diǎn)。9.清洗微粒，并在適當(dāng)?shù)木彌_液中重懸。10.混合，將偶聯(lián)好抗體的兩種82nm和180nm膠乳顆粒，按照1:2比例混合；加入一定量無機(jī)鹽，緩沖液，表面活性劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，得到試劑R2。每1升試劑R1中各組分的用量為：緩沖液9.76g，表面活性劑3.6mL，防腐劑0.2mL，穩(wěn)定劑10g，干擾消除蛋白4mL，無機(jī)鹽9g，余量為水；每1升試劑R2中各組分的用量為：包被SAA抗體的膠乳顆粒2.2g，緩沖液9.76g，表面活性劑2mL，防腐劑0.2mL，穩(wěn)定劑10g，無機(jī)鹽9g，余量為水。實(shí)施例2試劑R1由以下成分組成：緩沖液(3-嗎啉-2-羥基丙磺酸)，無機(jī)鹽(氯化鉀)，表面活性劑(月桂酸聚氧乙烯酯)，防腐劑(Proclin300)，穩(wěn)定劑(金屬絡(luò)合劑)及干擾消除蛋白(HBR阻斷劑)。試劑R2由以下成分組成：緩沖液(3-嗎啉-2-羥基丙磺酸)，無機(jī)鹽(氯化鉀)，表面活性劑(月桂酸聚氧乙烯酯)，防腐劑(Proclin300)，穩(wěn)定劑(金屬絡(luò)合劑)及聚苯乙烯膠乳顆粒混合物，所述聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔锝宦?lián)有抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體，偶聯(lián)抗體的膠乳制備步驟包括活化，偶聯(lián)，混合步驟，具體步驟如下：1.在偶聯(lián)緩沖液(50mM，pH6.0)中分別清洗各100mg羧基化的兩種平均粒徑為82nm和180nm膠乳微粒，然后按以下步驟對兩種膠乳進(jìn)行偶聯(lián)抗體反應(yīng)，用5mL偶聯(lián)緩沖液重懸，同時加入0.005％SDS以防止聚團(tuán)，偶聯(lián)緩沖液中避免加入含羧基，巰基和氨基的化合物。2.在上述微粒中加入100mg的EDC和90mg的sulfo-NHS，混勻使溶解。3.室溫反應(yīng)15分鐘。4.用偶聯(lián)緩沖液離心方法快速清洗微粒2次，后用5mL偶聯(lián)緩沖液超聲重懸。5.溶解抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體在5mL的偶聯(lián)緩沖液中，抗體蛋白濃度以提供微粒單層表面積基團(tuán)的1到10倍過量的配基為準(zhǔn)。6.立即將抗體蛋白和微粒粒子進(jìn)行混合。7.混合后室溫反應(yīng)2-4小時。8.用偶聯(lián)緩沖液清洗微粒，并再懸浮于含有100mM含親水猝滅分子(即乙醇胺或Tris)的偶聯(lián)緩沖液以封閉過量的反應(yīng)位點(diǎn)9.清洗微粒，并在適當(dāng)?shù)木彌_液中重懸。10.混合，將偶聯(lián)好抗體的兩種82nm和180nm膠乳顆粒，按照1:2比例混合；加入一定量無機(jī)鹽，緩沖液，表面活性劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，得到試劑R2。每1升試劑R1中各組分的用量為：生物緩沖劑7g，表面活性劑1mL，防腐劑0.1mL，穩(wěn)定劑8g，干擾消除蛋白1mL，無機(jī)鹽5g，余量為水；每1升試劑R2中各組分的用量為：包被SAA抗體的膠乳顆粒0.5g，生物緩沖劑5g，表面活性劑1mL，防腐劑0.1mL，穩(wěn)定劑5g，無機(jī)鹽8g，余量為水。實(shí)施例3試劑R1由以下成分組成：緩沖液(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)，無機(jī)鹽(硫酸鎂)，表面活性劑(油酸聚氧乙烯酯)，防腐劑(硫柳汞)，穩(wěn)定劑(抗氧化劑)及干擾消除蛋白(HBR阻斷劑)。試劑R2由以下成分組成：緩沖液(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)，無機(jī)鹽(硫酸鎂)，表面活性劑(油酸聚氧乙烯酯)，防腐劑(硫柳汞)，穩(wěn)定劑(抗氧化劑)及聚苯乙烯膠乳顆粒混合物，所述聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔锝宦?lián)有抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體，偶聯(lián)抗體的膠乳制備步驟包括活化，偶聯(lián)，混合步驟，具體步驟如下：1.在偶聯(lián)緩沖液(50mM，pH6.0)中分別清洗各100mg羧基化的兩種平均粒徑為82nm和500nm膠乳微粒，然后按以下步驟對兩種膠乳進(jìn)行偶聯(lián)抗體反應(yīng)，用5mL偶聯(lián)緩沖液重懸，同時加入0.005％SDS以防止聚團(tuán)，偶聯(lián)緩沖液中避免加入含羧基，巰基和氨基的化合物。2.在上述微粒中加入100mg的EDC和90mg的sulfo-NHS，混勻使溶解。3.室溫反應(yīng)10分鐘。4.用偶聯(lián)緩沖液離心方法快速清洗微粒2次，后用5mL偶聯(lián)緩沖液超聲重懸。5.溶解抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體在5mL的偶聯(lián)緩沖液中，抗體蛋白濃度以提供微粒單層表面積基團(tuán)的1到10倍過量的配基為準(zhǔn)。6.立即將抗體蛋白和微粒粒子進(jìn)行混合。7.混合后室溫反應(yīng)2-4小時。8.用偶聯(lián)緩沖液清洗微粒，并再懸浮于含有100mM含親水猝滅分子(即乙醇胺或Tris)的偶聯(lián)緩沖液以封閉過量的反應(yīng)位點(diǎn)9.清洗微粒，并在適當(dāng)?shù)木彌_液中重懸。10.混合，將偶聯(lián)好抗體的兩種82nm和500nm膠乳顆粒，按照2:1比例混合；加入一定量無機(jī)鹽，緩沖液，表面活性劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，得到試劑R2。每1升試劑R1中各組分的用量為：緩沖液15g，表面活性劑5mL，防腐劑0.4mL，穩(wěn)定劑12g，干擾消除蛋白5mL，無機(jī)鹽15g，余量為水；每1升試劑R2中各組分的用量為：包被SAA抗體的膠乳顆粒5g，緩沖液20g，表面活性劑4mL，防腐劑0.4mL，穩(wěn)定劑20g，無機(jī)鹽12g，余量為水。實(shí)施例4試劑R1由以下成分組成：緩沖液(3-[N-N-雙(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸)，無機(jī)鹽(氯化鈉)，表面活性劑(十二胺聚氧乙烯醚)，防腐劑(疊氮鈉)，穩(wěn)定劑(抗氧化劑)及干擾消除蛋白(HBR阻斷劑)。試劑R2由以下成分組成：緩沖液(3-[N-N-雙(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸)，無機(jī)鹽(氯化鈉)，表面活性劑(十二胺聚氧乙烯醚)，防腐劑(疊氮鈉)，穩(wěn)定劑(抗氧化劑)及聚苯乙烯膠乳顆粒混合物，所述聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔锝宦?lián)有抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體,偶聯(lián)抗體的膠乳制備步驟包括活化，偶聯(lián)，混合步驟，具體步驟如下：1.在偶聯(lián)緩沖液(50mM，pH6.0)中分別清洗各100mg羧基化的兩種平均粒徑為32nm和180nm膠乳微粒，然后按以下步驟對兩種膠乳進(jìn)行偶聯(lián)抗體反應(yīng)，用5mL偶聯(lián)緩沖液重懸，同時加入0.005％SDS以防止聚團(tuán)，偶聯(lián)緩沖液中避免加入含羧基，巰基和氨基的化合物。2.在上述微粒中加入100mg的EDC和95mg的sulfo-NHS，混勻使溶解。3.室溫反應(yīng)20分鐘。4.用偶聯(lián)緩沖液離心方法快速清洗微粒2次，后用5mL偶聯(lián)緩沖液超聲重懸。5.溶解抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體在5mL的偶聯(lián)緩沖液中，抗體蛋白濃度以提供微粒單層表面積基團(tuán)的1到10倍過量的配基為準(zhǔn)。6.立即將抗體蛋白和微粒粒子進(jìn)行混合。7.混合后室溫反應(yīng)2-4小時。8.用偶聯(lián)緩沖液清洗微粒，并再懸浮于含有100mM含親水猝滅分子(即乙醇胺或Tris)的偶聯(lián)緩沖液以封閉過量的反應(yīng)位點(diǎn)。9.清洗微粒，并在適當(dāng)?shù)木彌_液中重懸。10.混合，將偶聯(lián)好抗體的兩種32nm和180nm膠乳顆粒，按照1:3比例混合；加入一定量無機(jī)鹽，緩沖液，表面活性劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，得到試劑R2。每1升試劑R1中各組分的用量為：緩沖液12g，表面活性劑3mL，防腐劑0.3mL，穩(wěn)定劑10g，干擾消除蛋白4mL，無機(jī)鹽12g，余量為水；每1升試劑R2中各組分的用量為：包被SAA抗體的膠乳顆粒3g，緩沖液15g，表面活性劑3mL，防腐劑0.3mL，穩(wěn)定劑15g，無機(jī)鹽10g，余量為水。實(shí)施例5試劑R1由以下成分組成：緩沖液(MES)，無機(jī)鹽(氯化鈉)，表面活性劑(曲拉通X-100)，防腐劑(Proclin300)，穩(wěn)定劑(蔗糖)及干擾消除蛋白(HBR阻斷劑)。試劑R2由以下成分組成：緩沖液(MES)，無機(jī)鹽(氯化鈉)，表面活性劑(曲拉通X-100)，防腐劑(Proclin300)，穩(wěn)定劑(蔗糖)及聚苯乙烯膠乳顆?；旌衔铮鼍郾揭蚁┠z乳顆?；旌衔锝宦?lián)有抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體，偶聯(lián)抗體的膠乳制備步驟包括活化，偶聯(lián)，混合步驟，步驟具體如下：1.在偶聯(lián)緩沖液(50mMMES，pH6.0)中分別清洗各100mg羧基化的兩種平均粒徑為130nm和150nm膠乳微粒，然后按以下步驟對兩種膠乳進(jìn)行偶聯(lián)抗體反應(yīng)，用5mL偶聯(lián)緩沖液重懸，同時加入0.005％SDS以防止聚團(tuán)，偶聯(lián)緩沖液中避免加入含羧基，巰基和氨基的化合物。2.在上述微粒中加入100mg的EDC和100mg的sulfo-NHS，混勻使溶解。3.室溫反應(yīng)15分鐘。4.用偶聯(lián)緩沖液離心方法快速清洗微粒2次，后用5mL偶聯(lián)緩沖液超聲重懸。5.溶解抗血清淀粉樣蛋白SAA抗體在5mL的偶聯(lián)緩沖液中，抗體蛋白濃度以提供微粒單層表面積基團(tuán)的1到10倍過量的配基為準(zhǔn)。6.立即將抗體蛋白和微粒粒子進(jìn)行混合。7.混合后室溫反應(yīng)2-4小時。8.用偶聯(lián)緩沖液清洗微粒，并再懸浮于含有100mM含親水猝滅分子(即乙醇胺或Tris)的偶聯(lián)緩沖液以封閉過量的反應(yīng)位點(diǎn)。9.清洗微粒，并在適當(dāng)?shù)木彌_液中重懸。10.混合，將偶聯(lián)好抗體的兩種130nm和150nm膠乳顆粒，按照1:4比例混合；加入一定量無機(jī)鹽，緩沖液，表面活性劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，得到試劑R2。每1升試劑R1中各組分的用量為：緩沖液9.76g，表面活性劑3.6mL，防腐劑0.2mL，穩(wěn)定劑10g，干擾消除蛋白4mL，無機(jī)鹽9g，余量為水；每1升試劑R2中各組分的用量為：包被SAA抗體的膠乳顆粒2.2g，生物緩沖劑9.76g，表面活性劑2mL，防腐劑0.2mL，穩(wěn)定劑10g，無機(jī)鹽9g，余量為水。提供下述實(shí)驗(yàn)例用以證實(shí)本發(fā)明實(shí)施例試劑盒的各項(xiàng)性能指標(biāo)及檢測效果。實(shí)驗(yàn)例1標(biāo)準(zhǔn)曲線SAA標(biāo)準(zhǔn)品濃度如下：0、50、100、150、200、300mg/L。取高濃度標(biāo)準(zhǔn)品(300mg/L)和低濃度標(biāo)準(zhǔn)品(50mg/L)，梯度稀釋產(chǎn)生了3個濃度值的樣品，加上空白對照。在生化儀上對6個不同濃度的樣品分別平行測定7次，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，得到線性范圍，如圖1所示給出了本發(fā)明實(shí)施例1-4的試劑盒檢測SAA樣品時得到的吸光度變化曲線，其中，X軸表示樣本濃度，Y軸表示吸光度變化值。測試方法：取上述樣品6μL，加入試劑R1約162μL，混勻后5分鐘，反應(yīng)溫度37℃，然后加入試劑R2約30μL，混合18秒后檢測700nm波長吸光度，過5分鐘后再檢測一次700nm波長吸光度，求兩次吸光度之差。本法線性范圍為1～300mg/L，其回歸方程的截距和斜率分別為a＝50.857、b＝503.57，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，(Y＝50.857x+503.57，R2＝0.9911。該曲線為SAA濃度為1～300mg/L時的標(biāo)準(zhǔn)曲線；當(dāng)樣品SAA＞300mg/L時，需將樣品稀釋后再測。實(shí)驗(yàn)例2靈敏度試驗(yàn)參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical&LaboratoryStandardsInstitute:CLSI,EP17A)文件，以零參考標(biāo)準(zhǔn)品(0mg/L)測定透射值變化10次，計(jì)算其均值和標(biāo)準(zhǔn)差(s)。以透射值的計(jì)算得出的值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，所得的濃度值即為檢測的靈敏度。從表1可見，本發(fā)明實(shí)施例1檢測試劑盒的靈敏度為1mg/L。表1SAA(mg/L)測定次數(shù)均值2SDM+2SD01053317.4550.4實(shí)驗(yàn)例3高值線性測定測定10種不同SAA含量的樣品，每個樣品測2次，從表2可見，本發(fā)明實(shí)施例1檢測試劑盒的最高檢測范圍可達(dá)到300mg/L。表2SAA理論值(mg/L)SAA實(shí)際值(mg/L)100.12109.835048.94100102.35150148.66200204.57250250.18300306.89350288.310400253.9實(shí)驗(yàn)例4精密度試驗(yàn)根據(jù)(CLSI)EP5-A2文件對于精密度評價的要求，分別測定低、中、高值SAA濃度，2h內(nèi)各水平連續(xù)測定20次，計(jì)算s、變異系數(shù)CoefficientofVariation(CV)。每天測定1次，連續(xù)測定20d。計(jì)算s和CV。使用2種不同SAA含量的人血清樣品，測定本發(fā)明實(shí)施例1檢測試劑盒的批內(nèi)和批間精密度。結(jié)果表明，本發(fā)明實(shí)施例1檢測試劑盒的批內(nèi)精密度為4.58％，3.13％和2.37％(見表3)，而批間精密度則為7.32％，5.77％和4.76％(見表4)。表3批內(nèi)精密度低中高測定次數(shù)202020平均值(mg/L)10.751.4102.1最小值(mg/L)8.547.398.9最大值(mg/L)13.656.5112.3標(biāo)準(zhǔn)差(SD)4.12％3.08％2.13％變異系數(shù)(CV)4.58％3.13％2.37％表4批間精密度低中高測定次數(shù)202020平均值(mg/L)11.350.5117.6最小值(mg/L)5.743.188.7最大值(mg/L)16.959.8112.3標(biāo)準(zhǔn)差(SD)7.25％5.34％4.12％變異系數(shù)(CV)7.32％5.77％4.76％實(shí)驗(yàn)例5干擾試驗(yàn)加入干擾物質(zhì)后的測定值除以加入干擾物質(zhì)前的測定值即為影響率，試驗(yàn)結(jié)果表明游離膽紅素，結(jié)合膽紅素，血紅蛋白以及乳糜微粒的濃度分別在200mg/dl，200mg/dl，5000mg/dl以及21000FTU以下時，它們對測定結(jié)果的干擾均在2％以下(見表5)。表5上述本申請實(shí)施例中的技術(shù)方案，至少具有如下的技術(shù)效果或優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明試劑盒利用膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法測定血清淀粉樣蛋白，放大了檢測信號，提高了檢測靈敏度，縮短了檢測時間。(2)本發(fā)明采用混合粒徑的膠乳試劑，其中小粒徑的膠乳顆粒比例大，提高了線性；同時含有一定比例的大粒徑的膠乳顆粒，靈敏度也比較高。(3)本發(fā)明試劑盒特別加入了防止干擾的物質(zhì)，抗干擾性能好。同時，表面活性劑的添加也提高了精密度。(4)使用全自動生化分析儀測定血清淀粉樣蛋白，不僅使操作更為簡便，提高自動化程度，而且還節(jié)約了少量樣品檢測實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)成本。全自動生化分析儀在多批次對少量樣品進(jìn)行檢測，和單批次對大量樣品檢測的成本幾乎相同；因此，全自動生化分析儀可以適用于對少量樣品的檢測，并且不提高經(jīng)濟(jì)成本。盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3