本發(fā)明屬于食品分析技術領域，涉及乳粉及嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的同時檢測方法，具體涉及一種親水作用色譜-串聯(lián)質譜法檢測乳粉及嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的方法。

背景技術：

高氯酸鹽、氯酸鹽和溴酸鹽屬于污染物，美國環(huán)保局制訂的安全限制標準是高氯酸鹽在飲用水中的含量為24.5μg/L，我國GB 5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標準規(guī)定其中溴酸鹽和氯酸鹽的限量分別是0.01和0.7mg/L，其他食品中暫無相關限量。乳粉及嬰幼兒配方乳粉的原料為生乳，經(jīng)過濃縮、添加營養(yǎng)成分等多步生產(chǎn)工藝，其中原料乳可能含有微量的高氯酸鹽、氯酸鹽和溴酸鹽，而且在生產(chǎn)過程中可能使用消毒劑對管道、器皿進行清洗，導致終產(chǎn)品中含有一定量的高氯酸鹽、氯酸鹽和溴酸鹽。高氯酸鹽被廣泛用于軍工、核電、紡織印染、電鍍工作等領域，具有強穩(wěn)定性、易溶于水等特點，已成為普遍關注的環(huán)境污染物。高氯酸鹽是一種甲狀腺毒素，影響胎兒、兒童腦部的發(fā)育，甚至造成腦部的損傷。

食品在加工包裝過程中涉及各種器皿的清洗和消毒，氯酸鹽為二氧化氯原料帶入，對人體有害。國際癌癥研究中心（IARC）已將其列為中等毒性化合物。

溴酸鹽是一種具有致癌性的飲用水消毒副產(chǎn)物，也是一種面粉添加劑，能顯著改善面粉制品的烘焙效果。1992 年世界衛(wèi)生組織確認溴酸根是一種氧化性致癌物，2005 年7月1日我國已全面禁止使用溴酸鉀作為面粉添加劑。

目前，這三種陰離子的檢測技術主要是離子色譜或離子色譜-質譜法，也有少量采用反相液相色譜或者陰離子交換色譜對其中的一種或兩種進行分離，親水作用色譜相比上述技術具有更好的質譜兼容性，因此發(fā)展乳粉及嬰幼兒配方乳粉中這三種陰離子的高靈敏度檢測方法，采用新型色譜分離材料，建立三種陰離子同時檢測的親水作用色譜-質譜/質譜檢測方法，將提高檢測通量和靈敏度，并可在此基礎上調研其中相關物質的含量范圍，為風險評估提供有效數(shù)據(jù)，為制定相關限量、控制風險奠定基礎，更好的服務監(jiān)管。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有檢測技術的不足，采用簡單、高通量前處理方法，利用親水作用色譜實現(xiàn)對目標陰離子的有效保留，并利用親水作用色譜與質譜的高兼容性，實現(xiàn)質譜的高靈敏度檢測，建立簡便、實用、可行的乳粉及嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的高靈敏度測定方法。

本發(fā)明的目的是通過以下方案來實現(xiàn)的：

一種親水作用色譜-串聯(lián)質譜法檢測乳粉及嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的方法，包括以下步驟：

1）樣品的提取及凈化：取樣品經(jīng)水提取、乙醇沉淀蛋白后，采用固相基質分散去除脂類雜質，得到待測樣品溶液，備用；

2）標準溶液的配制：分別取氯酸鹽標準品、高氯酸鹽標準品和溴酸鹽標準品，采用水制備為100μg/mL標準溶液，分別再用水逐級稀釋得到1～100ng/mL濃度的加標用標準溶液，備用。

3）配制基質加標溶液：取不含氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的空白待測樣品溶液，然后加入氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的加標用標準溶液，配制為一系列的基質加標溶液，備用；

4）樣品的分析：將步驟1）待測樣品溶液，采用基于親水作用色譜原理的高效液相色譜對待測組分進行分離，三重四級桿串聯(lián)質譜檢測，得樣品譜圖，檢測氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽中三種陰離子；

5）繪制基質加標曲線：采用步驟4）檢測條件測定步驟3）配制的不同濃度的基質加標樣品溶液，得到標準譜圖，形成基質加標曲線，采用基質加標外標法同時實現(xiàn)定性定量分析，根據(jù)標準譜圖中保留時間確定步驟4）待測組分溶液中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽種類，以外標法計算步驟4）待測組分溶液中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的含量。

步驟1）中，所述的提取及凈化具體方法為：稱取樣品1.0 g于15 mL離心管中，準確加入5.0 mL水，混勻，超聲提取15min。準確移取1.0 mL溶液于另一離心管中，加入1.0 mL無水乙醇，混勻后，加入0.2 g C18填料，混勻，8000轉/分鐘離心5分鐘，取清液過0.22 μm有機濾膜，得到待測樣品溶液。

步驟4）中，

高效液相色譜條件：

色譜柱：TE-Cys，100mm×2.1mm i. d，5 μm；流動相A：90%甲醇-水-10mM甲酸銨；流動相B：水-10mM甲酸銨；流動相流速：0.2mL/min；梯度洗脫；柱溫：30-35℃；進樣量：2μL；

質譜分析條件：

離子化模式：ESI- ；噴霧電壓：-4.5kV；脫溶劑氣溫度：500 ℃；霧化氣(GS 1)：55 psi；輔助霧化氣(GS 2)：55 psi；氣簾氣：45 psi；碰撞氣：12 psi。掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）。

步驟4）中，高效液相色譜，梯度洗脫條件為

。

上述親水作用色譜-串聯(lián)質譜法檢測乳粉及嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的方法，測得氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的檢出限均為10μg/kg。

本發(fā)明親水作用色譜-串聯(lián)質譜法檢測乳粉及嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的方法，氯酸鹽的回收率在91.3%-106.9%范圍內，高氯酸鹽回收率在90.1%- 110%范圍內，溴酸鹽回收率在91.2%-104.7%范圍內，測定結果均具有良好的重現(xiàn)性，氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的RSD分別為3.27%、6.70%和5.24%。本發(fā)明方法能夠精確測定乳粉及嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的含量。

本發(fā)明的有益效果：

(1)操作簡單、通量高

樣品經(jīng)水提取、乙醇沉淀蛋白后，采用固相基質分散去除脂類雜質，結合親水作用色譜-串聯(lián)質譜法分析測定食品中的氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽。與過去文獻上報道的利用離子色譜或者陰離子交換液相色譜的測定方法相比，省去了SPE柱凈化過程，具有操作簡單的特點，而且實現(xiàn)了三種陰離子的同時檢測，檢驗通量提高三倍以上。

(2)大幅降低檢測成本

之前的氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽檢測方法標準（SN/T 4049-2014、SN/T 4089-2015、GB/T 20188-2006）需要三次提取、三根SPE柱凈化、三次檢測，而本發(fā)明只需提取、沉淀蛋白、固相基質分散三個步驟，即可上機測試，節(jié)省了原方法中成本最高的固相萃取柱，檢測成本不到原來的1/10。

(3)定性定量準確

本發(fā)明采用親水作用色譜分離，三重四級桿串聯(lián)質譜法檢測，基質加標外標法定量，結果準確度高且穩(wěn)定，克服了原來離子色譜定量可能存在的干擾和假陽性問題，可用于乳粉及嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的同時定性定量。

（4）檢測靈敏度高

之前的氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽檢測方法標準（SN/T 4049-2014、SN/T 4089-2015、GB/T 20188-2006）檢出限分別是0.5mg/kg, 3.0μg/kg和0.5mg/kg，本方法三種陰離子的檢出限均為10μg/kg，除高氯酸鹽外，其他兩種陰離子靈敏度均較現(xiàn)有標準方法提高50倍。

附圖說明

圖1為氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽標準溶液的MRM色譜圖；

圖2為氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的空白基質溶液MRM色譜圖；

圖3為氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的基質加標溶液MRM色譜圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進行進一步說明：

實施例1

嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽檢測：

1、材料與試劑

色譜柱： TE-Cys（100mm×2.1mm i. d, 5 μm)（中國科學院大連化學物理研究所研制）。

氯酸鹽標準品、高氯酸鹽標準品和溴酸鹽標準品分別購自濟南眾標科技有限公司、上海安譜實驗科技股份有限公司和中國計量科學研究院，濃度均為1mg/mL；甲醇、甲酸、甲酸銨（色譜純）；超純水：Mili-Q超純水機制備；氮氣（>99.999%）。

2、儀器和設備

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀，配有電噴霧（ESI）電離源(ABI 5500，美國AB公司)，液相色譜分離模式為親水作用色譜，檢測器為三重四級桿串聯(lián)質譜；分析天平：感量為0.01g；離心機。

3、親水作用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的方法，步驟為：

1）樣品的提取及凈化：稱取嬰幼兒配方乳粉1.0 g于15 mL離心管中，準確加入5.0 mL水，混勻，超聲提取15min。準確移取1.0 mL溶液于另一離心管中，加入1.0 mL無水乙醇，混勻后，加入0.2 g C18填料，混勻，8000轉/分鐘離心5分鐘，取清液過0.22 μm有機濾膜，得到待測樣品溶液，備用。

2）標準溶液的配制： 分別準確移取1mL氯酸鹽標準品、高氯酸鹽標準品和溴酸鹽標準品的標準儲備溶液（1mg/mL）于10mL容量瓶中，用水稀釋得到濃度為100μg/mL的標準溶液，分別再用水逐級稀釋得到1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL和100ng/mL等七個濃度水平的加標用標準溶液，備用；

3）配制基質加標溶液：取不含氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的空白待測樣品溶液，然后加入步驟2）氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的加標用標準溶液，配制為一系列的基質加標溶液，備用；

4）樣品的分析：將步驟1）待測樣品溶液，采用基于親水作用色譜原理的高效液相色譜對待測組分進行分離，三重四級桿串聯(lián)質譜檢測，得樣品譜圖，檢測氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽中三種陰離子；

高效液相色譜和質譜條件

i）高效液相色譜條件

色譜柱：TE-Cys（100mm×2.1mm i. d, 5 μm)；流動相：90%甲醇/水溶液（含10mM甲酸銨）（A）、水（含10mM甲酸銨）（B），梯度洗脫，梯度條件見表1；柱溫：30℃，進樣體積：2μL。

表1 液相色譜梯度條件

ii）質譜條件

離子化模式：ESI^-；噴霧電壓：-4.5kV；脫溶劑氣溫度：500 ℃；霧化氣(GS 1)：55 psi；輔助霧化氣(GS 2)：55 psi；氣簾氣：45 psi；碰撞氣：12 psi。掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）

每種季銨鹽的定性定量離子對、裂解電壓、駐留時間及碰撞能量見表2。

表2 氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的質譜參數(shù)

5）繪制基質加標曲線：采用步驟4）檢測條件測定步驟3）配制的不同濃度的基質加標樣品溶液，得到標準譜圖，形成基質加標曲線，采用基質加標外標法同時實現(xiàn)定性定量分析，根據(jù)標準譜圖中保留時間確定步驟4）待測組分溶液中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽種類，以外標法計算步驟4）待測組分溶液中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的含量。

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀進行檢測時，由于基質效應的影響，導致目標化合物發(fā)生離子增強或抑制作用，因此采用基質加標外標法定量。取空白樣品，準確移取添加氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的標準儲備液適量，配制一系列的基質加標樣品，按照步驟3）制備基質加標溶液，形成基質加標曲線。

4、定性及定量結果分析

4.1基質加標曲線

采用不含氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的嬰幼兒配方乳粉樣品，分別加入1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL和100ng/mL等七個濃度水平的標準溶液，按照上述方法步驟進行檢測，獲得質量色譜圖，質量色譜圖中定量離子對的色譜峰面積y為縱坐標，以基質加標溶液相應離子的濃度值（ng/mL）x為橫坐標，作標準曲線，獲得氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的線性回歸方程（如表3所示）。

表3 嬰幼兒配方乳粉基質加標曲線

4.2 樣品檢測

（1）定性分析

實施例1待測嬰幼兒配方乳粉樣品預處理為待測樣品溶液，用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀，按照上述方法給出的步驟測定，獲得樣品質量色譜圖。

若樣品質量色譜圖中存在與標準質量色譜圖中的色譜峰相應的色譜峰；則表明樣品中含有氯酸鹽、高氯酸鹽或溴酸鹽。相應的色譜峰是指：樣品色譜峰的保留時間與標準色譜峰的保留時間比較，變化范圍在±2.5％之內；而且試樣色譜峰的相對豐度比與相應標準色譜峰相比，偏差不超過表4規(guī)定的范圍。標準色譜峰是指標準質量色譜圖中的目標物的色譜峰。

實施例1待測嬰幼兒配方乳粉樣品中分析可知含有氯酸鹽、高氯酸鹽，不含溴酸鹽。

表4定性時相對離子豐度的最大允許偏差

（2）定量計算

采用外標法定量：根據(jù)樣品質量色譜圖中定量離子色譜峰的面積，采用表3的回歸方程，計算得到實施例1待測嬰幼兒配方乳粉樣品中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的濃度分別為351μg/kg，162μg/kg和未檢出（＜10μg/kg）。

實施例2

乳粉中氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽檢測：

采用跟實施例1相同的實驗條件和定性定量方法，對乳粉中的氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽進行檢測。得到的氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的線性回歸方程（如表5所示）。

表5乳粉基質加標曲線

采用與實施例1相同的定性定量方法，計算得到氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的濃度分別為851μg/kg，146μg/kg和35μg/kg。

本發(fā)明檢測方法回收率、精密度和檢出限測定：

空白樣品：嬰幼兒配方乳粉（嬰配）、乳粉和羊乳粉

采用基質加標外標法定量，統(tǒng)計氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的回收率（回收率：實測值/加入量*100％），結果如表5所示。由表5可見，氯酸鹽的回收率在91.3%-106.9%范圍內，高氯酸鹽回收率在90.1%- 110%范圍內，溴酸鹽回收率在91.2%-104.7%范圍內。

對不同樣品重復測定6次，測定結果均具有良好的重現(xiàn)性，氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的RSD分別為3.27%、6.70%和5.24%。

采用在空白樣品中添加目標化合物的方法，測得氯酸鹽、高氯酸鹽和溴酸鹽的檢出限均為10 μg/kg。

表6 加標回收實驗結果