本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，涉及一種水產(chǎn)品新鮮度快速檢測(cè)技術(shù)，具體地，本發(fā)明涉及快速檢測(cè)水產(chǎn)品中三甲胺含量的方法。

背景技術(shù)：

魚、蝦及貝類等水產(chǎn)品由于含水量高，肉質(zhì)組織脆弱，在貯藏和運(yùn)輸過程中，受外界環(huán)境、體內(nèi)內(nèi)源酶和微生物等原因的作用，極易發(fā)生自溶和腐敗變質(zhì)，引起蛋白質(zhì)自溶降解、脂質(zhì)氧化以及游離脂肪酸和氨基酸的變化，產(chǎn)生混雜的腐敗性氣味。其中由特定腐敗微生物酶催化降解氧化三甲胺(Trimetlylamine oxide，TMAO)形成的三甲胺(Trimethylamine，TMA)、二甲胺(Dimethylamine，DMA)和氨等揮發(fā)性鹽基氮類物質(zhì)已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外共同認(rèn)可的新鮮度檢測(cè)特征標(biāo)志物。隨著水產(chǎn)品新鮮度的下降，揮發(fā)性胺類物質(zhì)的體積分?jǐn)?shù)會(huì)逐漸升高，因此可以通過快速檢測(cè)揮發(fā)性胺類物質(zhì)來鑒定水產(chǎn)品的新鮮程度。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的揮發(fā)性胺的測(cè)定方法主要有分光光度法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管電泳法、質(zhì)譜法。

1、分光光度法

分光光度法是TMA、DMA、TMAO的經(jīng)典檢測(cè)方法，由于低級(jí)脂肪胺沒有發(fā)色團(tuán)，無紫外吸收特征，故一般要對(duì)TMA和DMA進(jìn)行衍生化處理，常見的是苦味酸比色法和雷氏鹽比色法。分光光度法的缺點(diǎn)：雷氏鹽和苦味酸與樣品中其他胺類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，常使測(cè)量結(jié)果偏高。靈敏度低，檢出限較高，效率低且重復(fù)性差，常用于檢測(cè)飼料及水產(chǎn)動(dòng)物中TMAO的含量。

2、氣相色譜法

秦輝等采用頂空氣相色譜法測(cè)量河蟹中TMA的含量，將蟹肉組織研磨后，取一定量樣品放入頂空瓶中，加入氫氧化鈉，使TMA從組織中游離出來，超聲波處理，40℃下保存30min后，不分流進(jìn)樣，然后用標(biāo)準(zhǔn)曲線定樣。氣相色譜法的缺點(diǎn)：氣相色譜法靈敏度高、分析速度快，適用于痕量分析，但是低級(jí)脂肪胺類極性大，容易吸附在硅烷和硅氧烷等極性固定相上，造成拖尾峰和重影現(xiàn)象，重復(fù)性差。

3、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

Chan采用頂空固相微萃?。瓪赓|(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定了肉組織中TMA、DMA和MA的量，效果較好。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用缺點(diǎn)：SPME需要專門的萃取器，價(jià)格昂貴，且纖維頭使用壽命有限，需要不停地更換，使測(cè)量成本變高，且樣品不好保存，萃取后要立刻進(jìn)樣分析，實(shí)驗(yàn)操作繁雜。

4、離子色譜法

孫永建立了一種同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中TMAO及其分解產(chǎn)物TMA、DMA的非抑制性離子色譜法，4mol/L硝酸+體積分?jǐn)?shù)為3％的乙腈混合溶液為淋洗液，流速為0.9ml/min在此條件下，可在10min內(nèi)完成待測(cè)組分的分析，縮短了分析時(shí)間，提高了分析效率。離子色譜法缺點(diǎn)：由于生物樣品中包含一些常見陽離子，如Ca2+、Na+、K+、Mg2+，考慮到這些離子會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成較大干擾，離子交換色譜法并不是測(cè)量生物樣品中胺類物質(zhì)的最佳方案。

5、毛細(xì)管電泳法

Timm用毛細(xì)管電泳儀間接紫外檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定了魚肉中TMA、DMA、TMAO的含量。4mmol/L甲酸、5mmol/L硫酸銅、3mmol/L冠醚、18－冠醚－6作為緩沖液，壓力進(jìn)樣，可在5-10min內(nèi)完成整個(gè)分析過程，檢出限0.04mmol/L。毛細(xì)管電泳法缺點(diǎn)：由于毛細(xì)管直徑小，光路短，使用紫外檢測(cè)器時(shí)，靈敏度較低，且影響電滲的因素多，進(jìn)而影響重復(fù)性。

6、質(zhì)譜法

Mamer用快原子轟擊質(zhì)譜和穩(wěn)定同位素稀釋法分別測(cè)定了尿液樣品中TMA、TMAO含量，所得曲線線性關(guān)系良好。質(zhì)譜法缺點(diǎn)：樣品前處理過程復(fù)雜，專業(yè)性要求較高，檢測(cè)過程需要很長(zhǎng)的時(shí)間效率低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)存在的不足問題，提出了一種以水產(chǎn)品為研究對(duì)象，快速檢測(cè)三甲胺的方法，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中三甲胺的快速檢測(cè)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)水產(chǎn)品中三甲胺的方法，該方法包括：

S1、制備濃度3.125～187.5ppb三甲胺標(biāo)準(zhǔn)使用氣，并將不同濃度所述三甲胺標(biāo)準(zhǔn)使用氣分別引入到離子遷移譜儀中依次進(jìn)行檢測(cè)，獲得不同濃度所述三甲胺標(biāo)準(zhǔn)使用氣的離子遷移譜譜圖，用離子遷移譜檢測(cè)到三甲胺峰的強(qiáng)度與對(duì)應(yīng)的三甲胺濃度做線性擬合得到三甲胺標(biāo)準(zhǔn)曲線；

所述離子遷移譜譜儀為紫外燈電離源，采用丁酮作為摻雜試劑，采用的實(shí)驗(yàn)條件為：遷移電場(chǎng)強(qiáng)度為：240～360V/cm，遷移管溫度為40～160℃，尾吹氣流速為100～1000ml/min，載氣流速為300ml/min，載氣和尾吹氣均為經(jīng)過硅膠、活性炭和分子篩處理的壓縮空氣，其中水汽含量低于10ppm；進(jìn)樣量為0.5μl至50μl；

所述三甲胺標(biāo)準(zhǔn)曲線以離子遷移譜對(duì)三甲胺的遷移時(shí)間定性，確定檢測(cè)出的物質(zhì)，以三甲胺響應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行定量，繪制三甲胺濃度關(guān)于三甲胺響應(yīng)峰強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

所述三甲胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：

Y＝5.1378X+10.9766，R²＝0.9911

其中，Y表示三甲胺的響應(yīng)峰強(qiáng)度，X表示三甲胺標(biāo)準(zhǔn)氣梯度濃度，R²表示表示曲線的擬合度；

S2、將待測(cè)水產(chǎn)品放到進(jìn)樣瓶中，微量揮發(fā)性物質(zhì)從水產(chǎn)品的組織和表面揮發(fā)出來，在進(jìn)樣瓶中形成頂空氣；將待測(cè)水產(chǎn)品形成的頂空氣引入到離子遷移譜中，獲得待測(cè)樣品的離子遷移譜譜圖；

所述離子遷移譜譜儀為紫外燈電離源，采用丁酮作為摻雜試劑，采用的實(shí)驗(yàn)條件與步驟S1相同；

S3、將待測(cè)水產(chǎn)品頂空氣的離子遷移譜譜圖和標(biāo)準(zhǔn)使用氣的離子遷移譜圖比較，根據(jù)三甲胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)水產(chǎn)品頂空氣中的三甲胺的實(shí)際含量；

將水產(chǎn)品直接進(jìn)樣后獲得的離子遷移譜譜圖與三甲胺標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比和計(jì)算，從而測(cè)出實(shí)際水產(chǎn)品中三甲胺的含量。

優(yōu)選方式下，步驟S1在濃度范圍3.125～187.5ppb內(nèi)選取13組三甲胺標(biāo)準(zhǔn)使用氣，每組取三個(gè)平行樣品；所述三甲胺標(biāo)準(zhǔn)使用氣的濃度按等差數(shù)列選?。?/p>

最有方式下，所述三甲胺標(biāo)準(zhǔn)使用氣的濃度分別為：3.125ppb、6.25ppb、12.5ppb、18.75ppb、25ppb、31.25ppb、37.5ppb、43.75ppb、62.5ppb、93.75ppb、125ppb、156.25ppb、187.5ppb。

進(jìn)一步優(yōu)化，所述制備三甲胺標(biāo)準(zhǔn)使用氣的具體方法為：

將容積為1L的氣袋充滿潔凈空氣，加熱、反復(fù)搖晃所述氣袋，待所述氣袋恢復(fù)室溫后，將所述氣袋內(nèi)氣體抽出，再次充入一定量潔凈空氣1L，然后用進(jìn)樣針吸取質(zhì)量濃度為28％的三甲胺標(biāo)準(zhǔn)液5.2μl注入到所述氣袋內(nèi)，搖晃后、靜置1h；

使氣袋內(nèi)壁能充分吸附足量的三甲胺達(dá)到吸附平衡，最后將氣體再次抽出；

再次注入1L的潔凈空氣，用進(jìn)樣針吸取10.4μl的三甲胺標(biāo)準(zhǔn)液注入氣袋中，即得到體積濃度為1000ppm的三甲胺預(yù)置標(biāo)準(zhǔn)氣；

從所述三甲胺預(yù)置標(biāo)準(zhǔn)氣氣袋中抽取不同體積的三甲胺氣體，打入容積為70ml的進(jìn)樣瓶后計(jì)算對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣瓶中三甲胺濃度，得到不同濃度的三甲胺氣體。

吸取預(yù)置量的三甲胺標(biāo)準(zhǔn)品，打入具有一定容積的氣袋中配成預(yù)置濃度的三甲胺標(biāo)準(zhǔn)氣；使用時(shí)通過吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)氣打入一定體積的進(jìn)樣瓶中來獲得不同濃度梯度的三甲胺氣體。

本發(fā)明方法需要待測(cè)樣品體積遠(yuǎn)小于頂空進(jìn)樣裝置，在進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)候，只要將待測(cè)水產(chǎn)品放到頂空進(jìn)樣裝置中，便可以檢測(cè)。通常情況下，頂空進(jìn)樣裝置為特制的玻璃器皿，可以根據(jù)應(yīng)用情況進(jìn)行定制，加工成不同體積，依據(jù)待檢測(cè)水產(chǎn)品的體積，選用不同體積的頂空進(jìn)樣裝置。檢測(cè)的時(shí)候貝類的需要去殼，表面有污泥需要清除，但不必要破壞樣品的完整性。所以前處理很簡(jiǎn)單，有的水產(chǎn)品蝦、小魚直接放進(jìn)去就行。

本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新在于：

1、本發(fā)明適合于任何水產(chǎn)品，待測(cè)水產(chǎn)品不需要復(fù)雜的前處理，可直接置于頂空進(jìn)樣裝置中進(jìn)行檢測(cè)。

2、本發(fā)明方法可以對(duì)待測(cè)的水產(chǎn)品直接進(jìn)樣檢測(cè)，拓展了離子遷移譜的用途，不會(huì)破壞水產(chǎn)品肉質(zhì)的完整性，重復(fù)性好，分析時(shí)間短，靈敏度高，檢出限低，檢測(cè)成本低廉，操作人員不需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)即可操作，方便檢測(cè)人員現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

3、本發(fā)明方法可以通過檢測(cè)到的揮發(fā)出來的三甲胺濃度來表征水產(chǎn)品的新鮮度，可以有效實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品新鮮程度的鑒別，可為消費(fèi)者提供出一個(gè)較好的食品品質(zhì)判斷，保障食品安全。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中三甲胺標(biāo)準(zhǔn)氣體的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2為新鮮牡蠣直接進(jìn)樣后的檢測(cè)結(jié)果與常溫貯藏一天后檢測(cè)結(jié)果匯總圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行更加詳細(xì)的說明，以便能夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)。然而，以下描述的具體實(shí)施方式和實(shí)施例僅是說明的目的，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：離子遷移譜對(duì)三甲胺的定量分析

如圖1所示，本實(shí)施例提供了一種快速檢測(cè)水產(chǎn)品中三甲胺的方法，該方法包括：

制備預(yù)置濃度的三甲胺標(biāo)準(zhǔn)使用氣，并將其引入到離子遷移譜儀中，獲得該標(biāo)準(zhǔn)使用氣的離子遷移譜譜圖及三甲胺標(biāo)準(zhǔn)曲線；

用來做標(biāo)準(zhǔn)曲線的三甲胺標(biāo)準(zhǔn)氣濃度依次是：3.125、6.25、12.5、18.75、25、31.25、37.5、43.75、62.5、93.75、125、156.25、187.5ppb，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣三次，其中三甲胺離子峰強(qiáng)度的選擇是用每三次進(jìn)樣中三甲胺離子峰強(qiáng)度最大的一個(gè)，然后將三甲胺濃度與相應(yīng)的三甲胺離子峰強(qiáng)度做成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

方程的建立：將不同濃度的三甲胺標(biāo)準(zhǔn)氣體，同獲得的相應(yīng)三甲胺離子峰強(qiáng)度輸入到ORIGIN8.5軟件中，利用軟件擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程：

Y＝5.1378X+10.9766，R²＝0.9911

其中，Y表示三甲胺的響應(yīng)峰強(qiáng)度，X表示三甲胺標(biāo)準(zhǔn)氣梯度濃度，R²表示表示曲線的擬合度。

圖1是獲得的三甲胺標(biāo)準(zhǔn)氣體的標(biāo)準(zhǔn)曲線，三甲胺離子峰強(qiáng)度在6.25ppb-187.5ppb的范圍內(nèi)隨濃度呈現(xiàn)良好的線性，能夠?qū)崿F(xiàn)三甲胺的定量分析。

在3.125ppb-187.5ppb的三甲胺濃度范圍內(nèi)均符合上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，上述標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度R²為0.9911，遠(yuǎn)大于0.90，擬合度較高，該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用來對(duì)三甲胺進(jìn)行定量，偏差不大。

將待測(cè)水產(chǎn)品形成的頂空氣引入到離子遷移譜中，獲得待測(cè)樣品的離子遷移譜譜圖；

將待測(cè)水產(chǎn)品頂空氣的離子遷移譜譜圖和標(biāo)準(zhǔn)使用氣的離子遷移譜圖比較，根據(jù)三甲胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)水產(chǎn)品頂空氣中的三甲胺的實(shí)際含量。

使用的離子遷移譜儀非放射性紫外燈電離源，并采用丁酮作為摻雜試劑，采用的實(shí)驗(yàn)條件為：工作電壓為360V/cm，遷移管溫度120℃，載氣300ml/min，載氣是用來攜帶摻雜劑進(jìn)入到進(jìn)樣瓶中和樣品發(fā)生反應(yīng)，最后進(jìn)入到離子遷移譜中檢測(cè),尾吹氣流速500ml/min，載氣和尾吹氣均為經(jīng)過硅膠、活性炭和分子篩處理的壓縮空氣，其中水汽含量低于10ppm。

實(shí)施例2

本實(shí)施例以牡蠣為例，將當(dāng)日新鮮活著的牡蠣去殼后直接放入進(jìn)樣瓶中進(jìn)行檢測(cè)，每次隨機(jī)取三只牡蠣進(jìn)行測(cè)試，檢測(cè)完成后在自封袋中常溫放置一天，次日再次檢測(cè)同只牡蠣，兩天的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

新鮮牡蠣貯藏一天后信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，由新鮮時(shí)的46.6127mv升高到515.2137mv，根據(jù)實(shí)施例1得到的三甲胺線性方程：

Y＝5.1378X+10.9766

計(jì)算得到三甲胺濃度由6.9361ppb上升到98.1426ppb，此時(shí)牡蠣已經(jīng)不新鮮。

丁酮形成遷移時(shí)間為8.78ms的反應(yīng)試劑離子峰，新鮮牡蠣和貯藏一天的牡蠣均可觀察到遷移時(shí)間為6.42ms的三甲胺特征峰，并且峰強(qiáng)度隨貯藏時(shí)間的增加逐漸增強(qiáng)。

TMA信號(hào)強(qiáng)度有著明顯的增高，由46.6127mv升高到515.2137mv，說明離子遷移譜(IMS)技術(shù)可以對(duì)當(dāng)日去殼牡蠣和放置一天后的牡蠣進(jìn)行快速辨別。

通過上述描述，可以看到，使用離子遷移譜儀檢測(cè)水產(chǎn)品中三甲胺含量的方法具有很好的可行性，可以實(shí)現(xiàn)三甲胺的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

綜上，利用離子遷移譜做三甲胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有很好的線性，在采用直接進(jìn)樣不需要預(yù)富集的條件下，離子遷移譜依然能夠很好檢測(cè)出三甲胺，并將三甲胺和雜質(zhì)的峰很好的分開，同時(shí)也檢測(cè)出不同貯藏時(shí)間的牡蠣中三甲胺含量的變化。說明利用離子遷移譜檢測(cè)牡蠣中三甲胺這一方法是可行的。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。