本發(fā)明涉及一種用于可作為預測和診斷急性冠狀動脈綜合征良好而可靠的生化標志物即可溶性CD40配體(sCD40L)檢測的電化學免疫傳感器的制備方法，基于羧基功能化的多壁碳納米管(c-MWCNTs)、聚乙烯亞胺(PEI)和金納米粒子(AuNPs)納米復合材料的直接型可再生的免疫傳感器，用于sCD40L的檢測，屬于電化學檢測領域。

背景技術：
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目前，心血管疾病因其發(fā)病率、致殘率和致死率較高，威脅人類的健康，已經(jīng)成為導致人類死亡的主要原因，其中急性冠狀動脈綜合征是臨床上常見的、嚴重的心血管疾病。sCD40L是腫瘤壞死因子超家族中的一員，屬于I型跨膜糖蛋白，能夠促進細胞的擴增和遷移。有研究表明，人血清中的sCD40L可用于急性冠狀動脈綜合征早期診斷與預測其發(fā)病風險的一個可靠而良好的生化標志物。因此，定量檢測人血清中的sCD40L對預測和診斷急性冠狀動脈綜合征有十分重要的意義。

蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)檢測方法有免疫細胞化學法(ICC)、免疫組化法(IHC)、蛋白質(zhì)免疫印跡雜交法(WB)等方法，但這些方法存在許多不足，如樣品處理過程繁瑣、分析時間較長、儀器或者試劑昂貴、靈敏度較低等，不適用于常規(guī)的臨床檢測。近年來，電化學免疫傳感器因其方便快捷、靈敏等特點而備受關注，并且已廣泛應用于生化分析、環(huán)境監(jiān)測、臨床研究和食品質(zhì)量檢測等領域。

在電化學免疫傳感器的應用中，為了達到簡便、快速地實現(xiàn)對目標物質(zhì)進行檢測的目的，應選擇合適的電極修飾材料。近年來，多壁碳納米管碳納米管(MWCNTs)因其優(yōu)良的導電性、較強的吸附能力、良好的電化學穩(wěn)定性和較大的比表面積等特點，廣泛應用于電化學免疫傳感器中。但由于其π-π電子的存在，形成范德華力的相互作用，具有較強的疏水性，導致其在許多溶劑中分散不均勻、易團聚，從而使其在電化學免疫傳感器的應用受到了許多限制。為了提高MWCNTs的分散性，降低其團聚作用，一方面選用c-MWCNTs因其帶有羧基，增加了其分散性；另一方面采用支化的PEI(分支中含有很多氨基的一類聚合物)，具有良好的水溶性，與c-MWCNTs相結(jié)合，不僅進一步提高了MWCNTs在溶劑中的分散性，而且它所提供的大量氨基為材料的進一步修飾奠定了基礎。金納米粒子(AuNPs)具有良好的導電性、較大的比表面積、較強的吸附能力、良好的生物相容性等特點，具有放大電化學免疫傳感器電信號的功能，能夠進一步提高電化學免疫傳感器的靈敏性，在電化學免疫傳感器中得到廣泛應用。本發(fā)明利用上述材料的性質(zhì)，不僅使電信號進一步放大，而且通過AuNPs與sCD40L抗體形成Au-NH₂鍵，從而固定sCD40L抗體，并且能保持此抗體的活性，從而實現(xiàn)對sCD40L的定量檢測。由于基底材料c-MWCNTs-PEI-AuNPs納米復合材料電化學性質(zhì)穩(wěn)定，其與sCD40L抗體結(jié)合牢固，在堿性溶液中，抗體抗原解離，而抗體與電極表面的連接不受影響，使電化學免疫傳感器具有再生性可多次重復使用。

本發(fā)明基于c-MWCNTs-PEI-AuNPs納米復合物為基底材料，建立一種用于生物樣品中sCD40L檢測的直接型可再生電化學免疫傳感器的制備方法，為生物體樣品中的sCD40L的方便、快速定量檢測提供一種新方法，為臨床上急性冠脈綜合癥的預測和診斷提供參考。

技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種用于生物樣品中的sCD40L定量檢測的可再生電化學免疫傳感器的制備方法，其特征包括以下步驟：

(1)羧基功能化多壁碳納米管(c-MWCNTs)-聚乙烯亞胺(PEI)-金納米粒子(AuNPs)基底材料的制備；

(2)建立可再生電化學免疫生物傳感器，測定sCD40L，繪制標準曲線。

本發(fā)明所述c-MWCNTs-PEI-AuNPs納米復合物的制備過程，其特征包括以下步驟：

稱取2mg c-MWCNTs到2mL的超純水中，超聲1-3h，使其分散均勻。在不斷攪拌下加入適量的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液活化其羧基，攪拌30min后加入100μL PEI溶液繼續(xù)攪拌2-5h。將上述材料洗滌多次之后，分散在2mL超純水中，先后分別加入100μL HAuCl₄·6H₂O(1％)和900μL(30mM)的NaBH₄溶液攪拌過夜，洗滌多次后分散在2mL超純水中，即可得到c-MWCNTs-PEI-AuNPs納米復合物，將其分散在2mL超純水中儲存于4℃冰箱中備用。

本發(fā)明中所述的建立可再生電化學免疫傳感器，測定生物樣品中的sCD40L濃度，繪制標準曲線，其特征在于包括以下步驟：

(1)分別用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末將電極拋光至鏡面，然后分別用適量超純水、無水乙醇、超純水按上述順序?qū)㈦姌O超聲清洗各5min，室溫干燥備用；

(2)將6μL制備好的c-MWCNTs-PEI-AuNPs納米復合物滴加在電極表面，室溫干燥；

(3)將6μL的sCD40L抗體滴加在修飾后的電極表面置于4℃冰箱中孵育10h；

(4)用超純水將孵育后的電極表面的未結(jié)合的sCD40L抗體沖去后，滴加6μL牛血清白蛋白(BSA，0.25％)溶液室溫孵育30min；

(5)用超純水將電極表面多余的BSA沖去后，將6μL不同濃度的sCD40L分別滴加在電極表面孵育45min；

(6)用超純水將未與sCD40L抗體結(jié)合的sCD40L沖去之后，將電極置于5mM的鐵氰化鉀溶液(5mM K₃[Fe(CN)₆]、5mM K₄[Fe(CN)₆]、0.1M KCl)中進行表征，用差分脈沖伏安法(DPV)測量其電流響應值；

(7)根據(jù)所得峰電流差值與sCD40L濃度的對數(shù)呈線性關系，繪制工作曲線；

(8)將檢測過sCD40L的電極放入解離液(30mM NaOH)中潤洗60s后取出，用超純水小心沖洗，置于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明是一種用于生物樣品中sCD40L定量檢測的可再生電化學免疫傳感器的制備方法，其突出的特點是：

(1)將c-MWCNTs-PEI-AuNPs納米復合材料作為基底引入到電化學免疫傳感器的制備中，不僅增強了導電性，加快了電子傳遞，而且增加了生物分子的固載量，進而提高了電化學免疫傳感器的靈敏度。

(2)本方法制備的可再生電化學免疫傳感器由于其基底材料(c-MWCNTs-PEI-AuNPs)的制備過程簡單、方便和電化學性質(zhì)穩(wěn)定，抗體與基底材料結(jié)合牢固。在堿性條件下，抗體與抗原解離，而抗體與基底材料的結(jié)合不受太大影響，因此具有優(yōu)良的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和再生性，可重復多次使用。

(3)本方法制備的可再生電化學免疫傳感器可為臨床對急性冠狀動脈綜合征的預防和診斷提供有效信息，有助于急性冠狀動脈綜合征的診斷和預防。

(4)本方法制備的可再生電化學免疫傳感器由于利用抗體抗原之間的特異性結(jié)合，具有良好的特異性，其制備過程簡單、檢測步驟較少，檢測速度較快，便于實現(xiàn)商品化，從而推進轉(zhuǎn)化醫(yī)學的發(fā)展。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明中可再生電化學免疫傳感器的構(gòu)建示意圖。

圖2為本發(fā)明中基底材料的不同合成步驟的透射電子顯微鏡圖、能譜圖和紫外-可見吸收光譜圖。

圖3為本發(fā)明的可再生電化學免疫傳感器在檢測可溶性CD40配體時得到的DPV曲線及其峰電流差值與濃度對數(shù)的線性關系。

具體實施方式：

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步闡述，應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

步驟1.稱取2mg c-MWCNTs到2mL的超純水中，超聲1-3h，使其分散均勻。在不斷攪拌下加入適量的EDC和NHS溶液活化其羧基，磁力攪拌30min之后加入100μL PEI溶液繼續(xù)攪拌2-5h。將上述材料洗滌多次之后，分散在2mL超純水中，先后分別加入100μL HAuCl₄·6H₂O(1％)和900μL的NaBH₄(30mM)攪拌過夜，洗滌多次后分散在2mL超純水中，即可得到c-MWCNTs-PEI-AuNPs納米復合物，將其分散在2mL超純水中儲存于4℃冰箱中備用；

步驟2.分別用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末將電極拋光至鏡面，然后分別用適量超純水、無水乙醇、超純水按以上順序?qū)㈦姌O各超聲清洗5min，室溫干燥備用；

步驟3.取上述制備好的6μL的c-MWCNTs-PEI-AuNPs納米復合物滴加在電極表面，室溫干燥；

步驟4.將6μL的sCD40L抗體滴加在修飾后的電極表面后，置于4℃冰箱中孵育10h；

步驟5.用超純水將孵育后的電極表面的未結(jié)合的sCD40L抗體沖去后，滴加6μL BSA(0.25％)溶液室溫孵育30min；

步驟6.用超純水將孵育后的電極表面多余的BSA沖去后，在電極上分別滴加6μL不同濃度的sCD40L置于37℃孵育45min；

步驟7.用超純水將未與sCD40L抗體結(jié)合的sCD40L沖去之后，將其置于鐵氰化鉀溶液(5mM K₃[Fe(CN)₆]、5mM K₄[Fe(CN)₆]、0.1M KCl)中進行表征，用DPV測量其電流響應值；

步驟8.根據(jù)所得峰電流值求得其差值與sCD40L濃度的對數(shù)呈線性關系，繪制工作曲線；測定結(jié)果表明sCD40L濃度在10fg mL^-1-100pg mL^-1范圍內(nèi)成線性關系，線性相關系數(shù)平方(R²)為0.99，檢測限為3fg mL^-1(S/N＝3)；

步驟9.將本發(fā)明用于檢測sCD40L以及血漿中的干擾物質(zhì)，結(jié)果表明血漿中的干擾物質(zhì)的電流響應值遠遠低于sCD40L的電流相應值，說明傳感器的特異性好，抗干擾能力強，能夠排除其他物質(zhì)的干擾；

步驟10.將本發(fā)明中上述傳感器置于于冰箱中4℃保存，間斷檢測傳感器電流響應，儲存28天后電流響應仍為初始電流的89.53％，表明傳感器具有良好的穩(wěn)定性；

步驟11.將本發(fā)明的5個電化學免疫傳感器用于檢測同一濃度(1pg mL^-1)的sCD40L，其相對標準偏差為1.38％，表明此傳感器有良好的重現(xiàn)性；

步驟12.將本發(fā)明用于檢測同一濃度(1pg mL^-1)的sCD40L后，放入解離液(30mM NaOH)中潤洗60s后取出，用超純水小心沖洗之后重復上述步驟，結(jié)果表明其重復5次電流值仍為初始電流的95.79％，表明此傳感器由于材料的穩(wěn)定、抗體與材料的牢固結(jié)合具有良好的再生性，可多次循環(huán)使用。