本發(fā)明涉及一種生物體內(nèi)物質(zhì)含量的檢測方法，特別是一種檢測海洋生物體內(nèi)塑料含量的方法。

背景技術(shù)：

塑料及其制品在工業(yè)、農(nóng)業(yè)及日常生活中被廣泛應(yīng)用，全球每年使用塑料不少于2.4億噸。環(huán)境中的塑料殘體可以通過風力、河流、洋流等外力進行遠距離遷移，污染地球上的偏遠角落。從已有報道發(fā)現(xiàn)，目前在北大西洋和太平洋表面以及深海均存在著較高程度的塑料碎片污染；同時也有研究表明，中國南海海岸帶地區(qū)塑料碎片的污染也非常普遍。這些碎片由于受到太陽輻射(光降解、脆化)或波浪等作用，直徑往往小于1 cm甚至更低, 并且在長期的物理、化學作用下會分解成更為微小型的塑料碎片或顆粒，當其直徑小于5mm時即可定義為微塑料。傳統(tǒng)的微塑料鑒定可通過目測或者顯微鏡輔助下的觀測實現(xiàn)。這主要依據(jù)它們的透明性、顏色、形狀、硬度等特征進行鑒別并分類，但這些鑒定方法主觀性較強，容易造成誤判。一些破壞性的方法比如通過樣品燃燒現(xiàn)象或者有機溶劑溶解后的信息來判定聚合物的組成也被廣泛應(yīng)用。例如，F(xiàn)ries等人運用裂解氣相色譜/質(zhì)譜法同時鑒定微塑料及其中添加劑的類型，該種方法具有用量小、直接進樣、可定性定量等優(yōu)點，但具有破壞性，實驗條件控制要求高。熱分析如差示掃描量熱法等由于對不同的塑料具有很高的區(qū)分率、樣品用量少、且對共混物的鑒別具有很大的優(yōu)越性，也被用于微塑料的鑒定，但費時且要完全破壞樣品。相比較破壞性的鑒定方法，原位非破壞性的方法在微塑料研究方面更受到關(guān)注，這主要是由于微塑料提取的樣品量往往較少，非破壞性的分析鑒定方法可以滿足在較少樣品量的情況下進行多途徑分析，得到不同的參數(shù)。目前運用較為普遍的是傅立葉變換紅外光譜、拉曼光譜等進行微塑料成分的鑒定，傅立葉變換紅外光譜不受樣品大小、形狀等影響，且樣本量小，但易受塑料老化的影響，拉曼光譜不僅可以獲得表面官能團信息，還能觀察其局部微觀形貌，但獲得的僅僅是微塑料表面的信息。在微塑料的形貌及表面元素鑒定方面，還可以采用掃描電子顯微鏡-能譜分析等方法。這些方法其準確性還有待進一步提高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，提出一種能夠快速、準確測量海洋生物體內(nèi)微塑料數(shù)量的方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種檢測海洋生物體內(nèi)塑料含量的方法，其特征在于：首先取被測海洋生物的肌肉組織或從食道到肛門括約肌之間的消化道組織，稱重后記錄生物組織質(zhì)量，并將其在烘箱中于60℃條件下恒溫烘干，將烘干至恒重后的生物組織在石英研缽中破碎，破碎后保證其粒徑范圍是5-10mm，稱取粉碎后的生物組織5-10g樣品加入500ml的玻璃燒杯中，加入25-50ml濃度為65%的濃硝酸，于電熱板上煮沸消解30min，加熱溫度的范圍是90-100℃，在加熱的過程中逐滴向燒杯中加入濃度為30%的雙氧水，直至獲得透明溶液，然后利用濃度為10%的NaOH溶液調(diào)節(jié)透明溶液的pH值至中性，獲得消解液。

將上述消解液利用等密度區(qū)帶離心法處理，分離出不同密度的微塑料，具體操作步驟如下：首先在離心管中預(yù)先放置梯度介質(zhì)密度為1.36g/cm³的蔗糖溶液，然后將消解液放在梯度介質(zhì)的液面上，或者預(yù)先將消解液與密度為1.36g/cm³的梯度介質(zhì)混合后放入離心管中，將上述的離心管放入離心機中，在轉(zhuǎn)速4000轉(zhuǎn)/min 的條件下離心處理10-15min，形成不同密度梯度溶液層，不同密度的微塑料可以實現(xiàn)分離，

從離心處理后的離心管中定量獲取離心液，并在熒光顯微鏡下鏡檢、分離出能夠發(fā)出熒光的微塑料，進行計數(shù)，在全自動傅里葉變換紅外光譜顯微鏡下鏡檢、分離出不能發(fā)出熒光的微塑料，進行計數(shù)；可以獲得不同密度微塑料的數(shù)量，

將上述兩次計數(shù)結(jié)果相加，除以初始的生物組織質(zhì)量，獲得單位質(zhì)量內(nèi)海洋生物體內(nèi)的塑料含量，

結(jié)果計算：

生物體內(nèi)微塑料濃度=（（n₁+n₂）×V））/m

n₁：熒光顯微鏡下統(tǒng)計的微塑料數(shù)量（個）

n₂：傅里葉變換紅外光譜顯微鏡下統(tǒng)計的微塑料的數(shù)量（個）

V：消解后獲得的消解液的體積（ml）

m：消解稱取的生物組織的重量（g）。

本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點：

本發(fā)明所公開的方法，可以在海洋生物的樣品中，快速、準確地檢測出是否含有微塑料，并可以直接得出單位質(zhì)量的海洋生物體內(nèi)含有的微塑料的量，該方法可以通過微波消解將生物體進行消解、液化，能夠排除部分樣品本身殘留物的影響，使實驗檢測更為準確，并且該試驗方法操作簡便、實驗儀器藥品易制備、實用性強，特別適合于用于科研單位生物體內(nèi)塑料含量的實驗研究。

附圖說明

圖1為微塑料的紅外譜圖。

圖2為海洋生物體內(nèi)微塑料的照片。

圖3顯微鏡下的微塑料圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖說明本發(fā)明的具體實施方式：如圖1至圖3所示：一種檢測海洋生物體內(nèi)塑料含量的方法，按照以下步驟進行操作：首先取被測海洋生物的肌肉組織，或取北側(cè)海洋生物的從食道到肛門括約肌之間的消化道組織，稱重后記錄生物組織質(zhì)量，并將其在烘箱中60℃條件下恒溫烘干，將烘干至恒重后的生物組織在石英研缽中破碎，破碎后保證其粒徑范圍是5-10mm。稱取粉碎后的生物組織5-10g樣品加入500ml的玻璃燒杯中，加入25-50ml濃硝酸（濃度為65%硝酸），于電熱板上煮沸消解30min，加熱溫度的范圍是90-100℃，在加熱的過程中逐滴向燒杯中濃度為30%的雙氧水，直至獲得透明溶液。然后利用濃度為10%的NaOH溶液調(diào)節(jié)透明溶液的pH值至中性，獲得消解液。

將上述消解液利用等密度區(qū)帶離心法處理，分離出不同密度的微塑料，具體操作步驟如下：首先在離心管中預(yù)先放置梯度介質(zhì)密度為（1.36g/cm³）的蔗糖溶液，然后將消解液放在梯度介質(zhì)的液面上，或者預(yù)先將消解液與梯度介質(zhì)（1.36g/cm³）混合后放入離心管中，將上述的離心管放入離心機中，在轉(zhuǎn)速4000轉(zhuǎn)/min 的條件下離心處理10-15min，形成不同密度梯度溶液層，不同密度的微塑料可以實現(xiàn)分離。

從離心處理后的離心管中定量獲取離心液，并在熒光顯微鏡下鏡檢、分離出能夠發(fā)出熒光的微塑料，進行計數(shù)，在全自動傅里葉變換紅外光譜顯微鏡下鏡檢、分離出不能發(fā)出熒光的微塑料，進行計數(shù)；可以獲得不同密度微塑料的數(shù)量。

將上述兩次計數(shù)結(jié)果相加，除以初始的生物組織質(zhì)量，獲得單位質(zhì)量內(nèi)海洋生物體內(nèi)的塑料含量。

結(jié)果計算：

生物體內(nèi)微塑料濃度=（（n₁+n₂）×V））/m

n₁：熒光顯微鏡下統(tǒng)計的微塑料數(shù)量（個）

n₂：傅里葉變換紅外光譜顯微鏡下統(tǒng)計的微塑料的數(shù)量（個）

V：消解后獲得的消解液的體積（ml）

m：消解稱取的生物組織的重量（g）。