本發(fā)明涉及煙草代謝組學(xué)研究中液相色譜保留指數(shù)的建立及其在化合物定性方面的應(yīng)用，具體是建立標準色譜分析條件和標記物的保留指數(shù)，輔助解決復(fù)雜樣品組分的定性分析。
背景技術(shù)：
：煙草代謝組學(xué)研究中，最首要的任務(wù)就是對化合物進行準確定性。過去常利用保留時間與已知物質(zhì)比較，一般采用一種純品來鑒定一種化合物，且條件完全一致，這樣色譜峰的保留時間對上了就可能是同一種物質(zhì)。但這種方法有一個致命缺陷，需要對樣品的成分已知或合理猜測，且能夠提供純品，如果是探索性研究或純品很難獲得，定性就很難進行。且需要多次同條件實驗，過程繁瑣、成本較高。后來出現(xiàn)高分辨質(zhì)譜輔助定性，如LC-QTOF，根據(jù)獲得的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)定性，但事實證明這種方法的可靠性有待提高，尤其是復(fù)雜未知組分的分析，因此有研究者將保留指數(shù)RI引入到氣相色譜的方法中，使定性的準確性和唯一性大大提高。其作用是在定性中減少甚至消除實驗條件的干擾，如色譜柱、溫度、壓力等。然而截止目前，保留指數(shù)在液相色譜中的應(yīng)用還未見報道。鑒于液相色譜相比氣相色譜，具有以下優(yōu)勢：1）氣相色譜不適用于不揮發(fā)物質(zhì)和熱不穩(wěn)定物質(zhì)，而液相色譜不受樣品的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制。2）對于很難分離的樣品，液相色譜常比氣相色譜容易完成分離。因此，迫切需要建立液相色譜的保留指數(shù)，并輔助復(fù)雜樣品組分的定性分析。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的正是針對現(xiàn)有技術(shù)中缺乏液相色譜保留指數(shù)輔助定性的問題，而提供一種標準色譜分析條件和標記物的保留指數(shù)，輔助解決復(fù)雜樣品組分的定性分析。本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)措施來實現(xiàn)：本發(fā)明的液相色譜保留指數(shù)的建立及其在化合物定性方面的應(yīng)用是在液相色譜中引入保留指數(shù)的概念，并通過氘代標記物實現(xiàn)待測化合物保留時間的校正，使定性的準確性和唯一性大大提高；具體步驟如下：a、配制保留指數(shù)標記物的混合溶液；b、在標準色譜條件下，LC-MS/MS進行標記物的檢測并確定其保留指數(shù)值；c、對新鮮煙葉液氮速凍，冷凍干燥并粉碎；d、稱取40~80mg粉碎好的煙葉，在粉碎好的樣品中加入10~20μL保留指數(shù)標記物，之后加入提取溶劑0.75~1.5mL，低溫超聲提取；保留指數(shù)標記物的最終濃度為10ngmL-1；e、冷凍離心，取上清液并過濾；f、LC-MS/MS檢測上述上清液，并對溶液中所含化合物進行定性分析；g、液相色譜、質(zhì)譜條件如下：Waters公司BEH-C18超高壓柱，規(guī)格2.1mm×100mmi.d.,1.7μm；柱溫：40℃；正離子模式流動相為：A：含0.1%甲酸的水，B：含0.1%甲酸的甲醇；流速：0.35mLmin-1；梯度洗脫：0min：5%B，10min~12min：98%B，12.1min~15min：5%B；進樣量：5μL；正離子模式：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；干燥氣溫度：180℃；干燥氣流速：11Lmin-1；霧化器壓力：20psi；鞘氣溫度：400℃；鞘氣流速：12Lmin-1；毛細管電壓：3200V；噴嘴電壓：0V；駐留時間：50ms。本發(fā)明中所述提取溶劑是濃度為80%的甲醇；且所述提取溶劑中化合物組分的定性需滿足以下三個條件：1）保留指數(shù)相差75，即保留時間相差＜5s；2）母離子相差＜0.2m/z；3）二級質(zhì)譜MS/MS匹配得分＞80。本發(fā)明中所述的保留指數(shù)標記物為10個氘代化合物，且其保留時間分布均勻（化合物名稱如表1所示）；所述的保留指數(shù)標記物的保留指數(shù)的換算方法為1秒換算為RI15，根據(jù)實驗所測保留時間進行換算。更具體說：在標準色譜分析條件下，測定氘代標記物的保留時間，并設(shè)定其保留指數(shù)（1秒換算為RI15），正離子模式下保留指數(shù)標記物為10個（表1），其它組分的保留值用相鄰兩個組分的保留指數(shù)標記物來標定。其計算公式如下：RI(x)=RI(z)+[RI(z+1)-RI(z)]×[Rt(x)-Rt(z)]/[Rt(z+1)-Rt(z)]，式中Z和Z+1分別為目標化合物（X）流出前后的保留指數(shù)標記物（表1）的流出時間（Rt)和保留指數(shù)(RI)。這里Rt(z)<Rt(x)<Rt(z+1)。表1保留指數(shù)標記物的定性離子對及保留指數(shù)復(fù)雜樣品中組分進行定性分析時需滿足以下三個條件：1）保留指數(shù)相差75（即保留時間相差5s）以下；2）母離子相差0.2m/z以下；3）二級質(zhì)譜MS/MS匹配得分高于80。例如山奈酚的保留時間為7.683min，在系列保留指數(shù)標記物中，保留時間與山奈酚最接近但比其小的為Cl-苯丙氨酸(6.898min)，保留時間與山奈酚最接近但比其大的為D5-吲哚乙酸(7.729min)?？梢岳斫鉃樯侥畏拥某龇鍟r間介于Cl-苯丙氨酸和D5-吲哚乙酸之間，則山奈酚的保留指數(shù)為RI=6915，從保留指數(shù)實現(xiàn)對化合物保留時間的校正，避免了流動相﹑壓力或使用批號不同的色譜柱所帶來的保留時間的變化。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明研究人員利用保留指數(shù)標記物對新鮮煙葉樣品中的代謝物的保留時間進行校正，可輔助未知代謝物的準確定性，具有以下特點：1）減少甚至消除實驗條件(如色譜柱、溫度、升溫條件、壓力等)的干擾，相比之前的外標法、峰高增量法等，實驗量大大減少，鑒定可靠性也得到提高；2）重現(xiàn)性好，標準物統(tǒng)一，操作簡單快速。附圖說明圖1為本發(fā)明工藝流程圖。圖2為正離子模式下保留指數(shù)標記物的TIC圖。圖3為紅花大金元新鮮煙葉的總離子流TIC圖。圖4為K326新鮮煙葉的總離子流TIC圖。具體實施方式本發(fā)明以下將結(jié)合實施例作進一步描述（參見圖1、圖2）：本發(fā)明的液相色譜、質(zhì)譜條件如下：Waters公司BEH-C18超高壓柱，規(guī)格2.1mm×100mmi.d.,1.7μm；柱溫：40℃；正離子模式流動相為：A：含0.1%甲酸的水，B：含0.1%甲酸的甲醇；流速：0.35mLmin-1；梯度洗脫：0min：5%B，10min~12min：98%B，12.1min~15min：5%B；進樣量：5μL；正離子模式：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；干燥氣溫度：180℃；干燥氣流速：11Lmin-1；霧化器壓力：20psi；鞘氣溫度：400℃；鞘氣流速：12Lmin-1；毛細管電壓：3200V；噴嘴電壓：0V；駐留時間：50ms。本發(fā)明中所述提取溶劑是濃度為80%的甲醇。且所述提取溶劑中化合物組分的定性需滿足以下三個條件：1）保留指數(shù)相差75，即保留時間相差＜5s；2）母離子相差＜0.2m/z；3）二級質(zhì)譜MS/MS匹配得分＞80。本發(fā)明中所述的保留指數(shù)標記物為10個氘代化合物，且其保留時間分布均勻（化合物名稱如表1所示）；所述的保留指數(shù)標記物的保留指數(shù)的換算方法為1秒換算為RI15，根據(jù)實驗所測保留時間進行換算。更具體說：在標準色譜分析條件下，測定氘代標記物的保留時間，并設(shè)定其保留指數(shù)（1秒換算為RI15），正離子模式下保留指數(shù)標記物為10個（表1），其它組分的保留值用相鄰兩個組分的保留指數(shù)標記物來標定。其計算公式如下：RI(x)=RI(z)+[RI(z+1)-RI(z)]×[Rt(x)-Rt(z)]/[Rt(z+1)-Rt(z)]，式中Z和Z+1分別為目標化合物（X）流出前后的保留指數(shù)標記物（表1）的流出時間（Rt)和保留指數(shù)(RI)。這里Rt(z)<Rt(x)<Rt(z+1)。以下不再贅述。實施例1：首先配制保留指數(shù)標記物的混合溶液，在標準色譜條件下LC-MS/MS進行標記物的檢測并確定其保留指數(shù)值；對新鮮煙葉液氮速凍，冷凍干燥并粉碎。稱取45~50mg凍干處理的新鮮煙葉（云南大理種植的紅花大金元）于玻璃試管中，加入1mL提取溶劑（提前加入保留指數(shù)標記物）于玻璃管中，保留指數(shù)標記物的濃度為10ngmL-1，加蓋密封后置于超聲波清洗機內(nèi)，在冰浴下超聲抽提30min，超聲功率為100Hz，然后在8000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液并過濾，進行LC-MS/MS分析，所得的總離子流TIC如圖3所示，部分代謝物的名稱、母離子、子離子、碰撞能量及校正保留指數(shù)如表2所示。表2部分代謝物的名稱、母離子、子離子、碰撞能量及校正保留指數(shù)代謝物名稱母離子子離子碰撞能量保留時間校正保留指數(shù)Histidine156110400.786707.4Phenylalanine166120402.4472202.3Leucine13286201.7371563.3Glutamine14784401.3621225.8Oleamide2822652011.34110206.9Adenosine268136401.6581492.2Asparagine13374200.826743.4Lysine14784400.707636.3Tryptophan205188203.3092978.1Palmiticacid25757209.9028911.8Glutamicacid14884200.798718.2實施例2：首先配制保留指數(shù)標記物的混合溶液，在標準色譜條件下LC-MS/MS進行標記物的檢測并確定其保留指數(shù)值；對新鮮煙葉液氮速凍，冷凍干燥并粉碎。稱取45~50mg凍干處理的新鮮煙葉（貴州遵義種植的K326）于玻璃試管中，加入1mL提取溶劑（提前加入保留指數(shù)標記物）于玻璃管中，保留指數(shù)標記物的濃度為10ngmL-1，加蓋密封后置于超聲波清洗機內(nèi)，在冰浴下超聲抽提30min，超聲功率為100Hz，然后在8000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液并過濾，進行LC-MS/MS分析，所得的總離子流TIC如圖4所示，部分代謝物的名稱、母離子、子離子、碰撞能量及校正保留指數(shù)如表3所示。表3部分代謝物的名稱、母離子、子離子、碰撞能量及校正保留指數(shù)代謝物名稱母離子子離子碰撞能量保留時間校正保留指數(shù)Quinicacid193111100.854768.6Ferulicacid19517755.2584732.2Scopolin355193103.2882959.2Caffeicacid18116354.2283805.2Kaempferol287153307.6836914.7Neochlorogenicacid354163154.5324078.8Proline11670400.874786.6Quercetin303229257.0346330.6Cysteine12210550.873785.7Delphinidinchloride303257245.8295246.1Rutin611303135.8195237.1當(dāng)前第1頁1 2 3