本發(fā)明涉及一種分子印跡在線固相萃取與液相色譜聯(lián)用檢測17β-雌二醇方法，屬于高分子材料和分離技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

17β-雌二醇是主要的內(nèi)源雌激素之一，它廣泛存在于飲用水中，因此成為環(huán)境中內(nèi)源雌激素進(jìn)入人體的主要途徑。在極低濃度下，就會對人和動物的內(nèi)分泌系統(tǒng)起極強(qiáng)的干擾作用。大量調(diào)查結(jié)果和實驗室研究表明，環(huán)境雌激素對近年來男性睪丸病和前列腺癌發(fā)病率的上升，精子數(shù)量減少，女性乳腺癌，子宮癌發(fā)病率的增加，雄性動物的雌性化和免疫功能的改變等具有不容忽視的作用，已成為一類新的研究和檢測的熱點物質(zhì)。環(huán)境水體中17β-雌二醇是極其微量的，因此，建立特異性強(qiáng)，靈敏度高的檢測方法成為包括17β-雌二醇在內(nèi)的環(huán)境雌激素研究領(lǐng)域中一大課題，也是改善食品安全現(xiàn)狀和保護(hù)人類健康的有效技術(shù)手段。

目前國內(nèi)外有關(guān)17β-雌二醇檢測方法大都采用分光光度法、液相色譜法或液相、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法進(jìn)行定性、定量的檢測。液相色譜是常用的檢測方法，但靈敏度，在17β-雌二醇含量較低(痕量)時很難檢出，通常分離需要富集。固相萃取法比傳統(tǒng)的溶劑萃取更快速、準(zhǔn)確，在進(jìn)行固相萃取時則需要使用對17β-雌二醇有高選擇性的固相吸附材料。分子印跡技術(shù)(Molecular Imprinting Technique,MIT)是當(dāng)前制備高選擇性材料的主要方法之一，通過該技術(shù)制備的分子印跡聚合物在固相萃取、化學(xué)仿生傳感器、模擬酶催化、臨床藥物分析、膜分離技術(shù)等許多領(lǐng)域展示了良好的應(yīng)用前景。利用分子印跡技術(shù)合成的聚合物具有很高的選擇性和吸附容量，用于17β-雌二醇含量較低(痕量)的樣品的前處理可顯著提高分離富集效果，與液相色譜在線聯(lián)用可顯著提高檢測方法的靈敏度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種分子印跡在線固相萃取與液相色譜聯(lián)用檢測17β-雌二醇的方法。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案

一種分子印跡在線固相萃取與液相色譜聯(lián)用檢測17β-雌二醇方法，步驟如下：

1.17β-雌二醇分子印跡聚合物的制備：

5-30mL氯仿溶液中加入17β-雌二醇、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷，磁力攪拌5-30min，再在混合液中加入0.1-0.3g活化硅球以及四乙氧基硅烷溶液(17β-雌二醇：γ-氨基丙基三乙氧基硅烷：四乙氧基硅烷按摩爾比1:3:4-10的混合液)，攪拌10-30min；最后加入1.0-5.0mL濃度為0.1mol L^-1醋酸反應(yīng)5-10min后，40-70℃水浴孵化24h。洗脫后80℃下真空干燥10h 得分子印跡聚合物MIP。

2.分子印跡在線固相萃取與液相色譜聯(lián)用流程：

(1)取100-200mg步驟1)制備的分子印跡聚合物MIP填充到圓柱形不銹鋼預(yù)柱中，與高效液相色譜的六通閥相連。

(2)以17β-雌二醇溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液；將100mL17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液以1.5-2.5mL min^-1的速度通過不銹鋼預(yù)柱，棄掉流出物。

(3)以超純水和色譜甲醇(2：3，體積比)混合溶液作為液相色譜的流動相；流動相以1.0mL min^-1的流速反沖洗脫，分析物進(jìn)入高效液相色譜儀，分析檢測。

(4)分析檢測后，將流動相以1.0mL min^-1的流速反沖洗脫MIP預(yù)柱5-10min；

3.配制不同濃度的17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液并重復(fù)步驟2操作；以17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.取待測環(huán)境水100mL，將待測環(huán)境水替換步驟2中17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液并按照步驟2的流程進(jìn)行檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測環(huán)境水中17β-雌二醇含量。

本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：

1.本發(fā)明固相萃取的取吸附劑是17β-雌二醇分子印跡聚合物，可專一識別17β-雌二醇，具有非常高的選擇性。

2.該17β-雌二醇吸附功能材料由化學(xué)合成方法制備，具有較高的穩(wěn)定性、較長的使用壽命和較強(qiáng)的抗惡劣環(huán)境的能力。成本低廉，實驗操作簡單，反應(yīng)條件容易控制。

3.本發(fā)明建立分子印跡在線固相萃取與液相色譜聯(lián)用，富集倍數(shù)超過490倍，大大降低液相色譜的檢出限，適用于水中痕量17β-雌二醇的吸附檢測。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明是采用分子印跡在線固相萃取與液相色譜聯(lián)用技術(shù)對17β-雌二醇進(jìn)行檢測。

1.17β-雌二醇分子印跡聚合物的制備：

在10mL氯仿溶液中加入0.200g 17β-雌二醇和0.50mLγ-氨基丙基三乙氧基硅烷，磁力攪拌5-30min，再加入0.2g活化硅球以及1.30mL四乙氧基硅烷溶液(17β-雌二醇：γ-氨基丙基三乙氧基硅烷：四乙氧基硅烷按摩爾比1:3:8的混合液)，攪拌30min；最后加入1.0mL0.1mol L^-1醋酸反應(yīng)5min后，置于50℃水浴鍋中水浴孵化24h。抽濾后100℃真空老化10h。制備的聚合物置于圓底燒瓶中，然后加入40mL甲醇和10mL 1.0mol L^-1鹽酸，磁力攪拌4h,真空抽濾后，分別用0.1mol L^-1氫氧化鈉、水以及甲醇洗滌5次，80℃下真空干燥10h 得分子印跡聚合物MIP。

2.分子印跡在線固相萃取與液相色譜聯(lián)用流程：

(1)取100mg高吸附性能MIP填充到裝在一個圓柱形不銹鋼預(yù)柱中，不銹鋼預(yù)柱與高效液相色譜的六通閥相連。

(2)將100mL濃度為0.5mg L^-1的17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液通過流動注射泵以2.5mL min^-1的速度通過不銹鋼預(yù)柱，棄除流出物。

(3)以超純水和色譜甲醇按照40％：60％(體積比)的混合溶液作為液相色譜的流動相；流動相以1.0mL min^-1的流速反沖洗脫，分析物進(jìn)入高效液相色譜儀，分析檢測。

(4)流動相以1.0mL min^-1的流速反沖洗脫MIP預(yù)柱10min。

3.分別配制濃度為0.5mg L^-1、1.0mg L^-1、2.0mg L^-1、4.0mg L^-1、8.0mg L^-1的17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液并重復(fù)步驟2操作；以17β-雌二醇溶液濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.取待測環(huán)境水100mL，將待測環(huán)境水替換步驟2中17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液并按照步驟2的流程進(jìn)行檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出環(huán)境水中17β-雌二醇含量為0.17mg L^-1。