本發(fā)明涉及中藥制劑質(zhì)量控制領(lǐng)域，具體涉及基于復(fù)方血脂寧提取物指紋圖譜的建立及其活性成分定量分析方法。

背景技術(shù)：

中藥復(fù)方血脂寧收載于2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部中，由決明子、制首烏、荷葉、山楂四味中藥組成，具有活血行氣，化瘀降脂之功效，適用于血脈瘀滯所致高脂血癥。環(huán)糊精(Cyclodextrin，簡(jiǎn)稱CD)及其衍生物是近年來(lái)發(fā)展較快的新型藥用材料，具有生物毒性低、水溶性好的特點(diǎn)。β-環(huán)糊精(β-CD)是淀粉經(jīng)葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵后得到的α-1,4-葡萄糖苷鍵連接的環(huán)狀低聚物，其包含7個(gè)吡喃葡萄糖單元。具有內(nèi)疏水、外親水的特殊分子結(jié)構(gòu)，能與多種“客體”藥物形成包含物，從而可以增加藥物的溶解度、穩(wěn)定性并提高生物利用度。國(guó)內(nèi)學(xué)者利用環(huán)糊精水溶液對(duì)金銀花、銀杏、廣棗、虎杖等藥材進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)環(huán)糊精對(duì)黃酮類，蒽醌類等成分具有增加提取率、改善溶出速率的作用，提示環(huán)糊精對(duì)藥物分子具有選擇包合作用，可提高中藥活性成分的提取率。

中藥指紋圖譜技術(shù)譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，通過(guò)現(xiàn)代信息技術(shù)和質(zhì)量分析手段能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)，基于中藥指紋圖譜并結(jié)合多指標(biāo)成分定量分析的中藥質(zhì)量控制模式是以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，體現(xiàn)了中醫(yī)藥整體治療的特色，突出了指標(biāo)性成分的作用，同時(shí)兼顧了微量成分和多成分融合調(diào)節(jié)作用的傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，其在指紋圖譜的基礎(chǔ)上賦予指紋圖譜定性、定量信息，對(duì)指紋圖譜中多個(gè)目標(biāo)成分尤其是有效成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，使得中藥質(zhì)量控制更加準(zhǔn)確、真實(shí)反映中藥的質(zhì)量狀況，使產(chǎn)品的組成更加清晰、產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性更加可靠[。

復(fù)方血脂寧中存在大量的其他有效成分，而這些有效成分對(duì)于血脂寧的質(zhì)量控制也是有重要意義的，因此，需要構(gòu)建復(fù)方血脂寧指紋圖譜，以全面地反映中藥復(fù)方血脂寧所含有的化學(xué)有效成分，更好的控制復(fù)方血脂寧的藥品品質(zhì)，并且通過(guò)復(fù)方血脂寧的指紋圖譜去進(jìn)行多指標(biāo)活性成分定量分析對(duì)于復(fù)方血脂寧提取物的質(zhì)量控制也具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了復(fù)方血脂寧提取物指紋圖譜的建立，本發(fā)明的發(fā)明目的是通過(guò)建立復(fù)方血脂寧高效液相指紋圖譜，能夠?yàn)橹兴帍?fù)方血脂寧的鑒別和質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

本發(fā)明還設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了復(fù)方血脂寧提取物的活性成分定量分析方法，本發(fā)明的發(fā)明目的在于基于指紋圖譜選取活性成分作為定量指標(biāo)，建立復(fù)方血脂寧提取物活性成分定量分析方法。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

復(fù)方血脂寧提取物指紋圖譜的建立方法，采用高效液相色譜法，包括如下步驟：

取二苯乙烯苷對(duì)照品，加甲醇溶解，定容，作為供試品溶液；

按照復(fù)方血脂寧處方量稱取藥材，用水或者β-環(huán)糊精水溶液提取，定容，作為供試品溶液；

采用色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以體積分?jǐn)?shù)100％甲醇為A相，體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸為B相，組成流動(dòng)相，采用梯度洗脫，柱溫為45℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流速為0.2mL/min，分析時(shí)間為40min；

采用進(jìn)樣量為3μL注入高效液相色譜儀，得到所述指紋圖譜。

優(yōu)選的是，所述梯度洗脫的洗脫程序如下：

0分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為10％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為90％的甲酸溶液；

2分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為25％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為75％的甲酸溶液；

9分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為35％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為65％的甲酸溶液；

12分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為40％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為60％的甲酸溶液；

40分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為90％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為10％的甲酸溶液；

所述柱溫為45℃；所述流速：0.2mL/min；所述進(jìn)樣量：3μL。

優(yōu)選的是，用水提取復(fù)方血脂寧物制備工藝包括：按照處方量復(fù)方血脂寧分別稱取決明子3g，制首烏2g，荷葉1.5g，山楂1g，加入25倍量水，浸泡1小時(shí)，提取3次，每次2小時(shí)，提取液過(guò)濾后合并，得到復(fù)方血脂寧水提取供試液。

優(yōu)選的是，用β-環(huán)糊精提取血脂寧物制備工藝包括：按照處方量復(fù)方血脂寧分別稱取決明子3g，制首烏2g，荷葉1.5g，山楂1g，加入占藥材量5％β-環(huán)糊精，25倍量水，浸泡1小時(shí)，提取3次，每次2小時(shí)，提取液過(guò)濾后合并，得到所述復(fù)方血脂寧β-環(huán)糊精提取供試液。

優(yōu)選的是，所述指紋圖譜包括34個(gè)共有指紋峰，相對(duì)保留時(shí)間分別為：

1號(hào)峰：0.52；2號(hào)峰：0.57；3號(hào)峰：0.61；4號(hào)峰：0.66；5號(hào)峰：0.89；6號(hào)峰：0.97；7號(hào)峰：1.00；8號(hào)峰：1.03；9號(hào)峰：1.13；10號(hào)峰：1.22；11號(hào)峰：1.26；12號(hào)峰：1.32；13號(hào)峰：1.35；14號(hào)峰：1.37；15號(hào)峰：1.46；16號(hào)峰：1.65；17號(hào)峰：1.68；18號(hào)峰：1.80；19號(hào)峰：1.83；20號(hào)峰：1.86；21號(hào)峰：1.88；22號(hào)峰：1.91；23號(hào)峰：2.06；24號(hào)峰：2.16；25號(hào)峰：2.21；26號(hào)峰：2.50；27號(hào)峰：2.67；28號(hào)峰：2.78；29號(hào)峰：2.87；30號(hào)峰：2.92；31號(hào)峰：2.96；32號(hào)峰：3.26；33號(hào)峰：3.53；34號(hào)峰：3.69。

復(fù)方血脂寧提取物的活性成分定量分析方法，包括：

選取多組處方量復(fù)方血脂寧，分別制備血脂寧水提取物以及血脂寧β-環(huán)糊精提取物，根據(jù)得到所述血脂寧水提取物以及所述血脂寧β-環(huán)糊精提取物的指紋圖譜，確定34個(gè)共有指紋峰，對(duì)所述共有指紋峰進(jìn)行藥材歸屬以及對(duì)所述共有峰進(jìn)行成分確定，在確定的成分中選取多個(gè)活性指標(biāo)成分，建立復(fù)方血脂寧多指標(biāo)成分定量分析方法；

其中，所述活性指標(biāo)成分包括荷葉堿、二苯乙烯苷、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷、槲皮素、橙黃決明素、大黃素。

優(yōu)選的是，建立復(fù)方血脂寧多指標(biāo)成分定量分析方法包括如下步驟：

取荷葉堿、二苯乙烯苷、紅鐮霉素-龍膽二糖苷、槲皮素、橙黃決明素、大黃素對(duì)照品，加甲醇溶解并定容，作為對(duì)照品溶液；

量取血脂寧提取物，加甲醇定容，搖勻，超聲，離心，上清液經(jīng)濾膜過(guò)濾，收集續(xù)濾液，作為供試品溶液；

采用色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以體積分?jǐn)?shù)100％甲醇為A相，體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸為B相，組成流動(dòng)相，采用梯度洗脫，柱溫為40℃～50℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm～320nm，流速為0.2mL/min，分析時(shí)間為40min。

優(yōu)選的是，采用色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以體積分?jǐn)?shù)100％甲醇為A相，體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸為B相，組成流動(dòng)相，采用梯度洗脫，柱溫為45℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm、280nm、320nm，流速為0.2mL/min，分析時(shí)間為40min，進(jìn)樣量為3μL；以及

所述梯度洗脫的洗脫程序如下：

0分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為10％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為90％的甲酸溶液；

2分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為25％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為75％的甲酸溶液；

9分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為35％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為65％的甲酸溶液；

12分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為40％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為60％的甲酸溶液；

40分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為90％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為10％的甲酸溶液。

優(yōu)選的是，所述血脂寧水提取物制備工藝包括：按照處方量復(fù)方血脂寧分別稱取決明子3g，制首烏2g，荷葉1.5g，山楂1g，加入25倍量水，浸泡1小時(shí)，提取3次，每次2小時(shí)，提取液過(guò)濾后合并，得到所述血脂寧水提取物；所述血脂寧β-環(huán)糊精提取物制備工藝包括：按照處方量復(fù)方血脂寧分別稱取決明子3g，制首烏2g，荷葉1.5g，山楂1g，加入占藥材量5％β-環(huán)糊精，25倍量水，浸泡1小時(shí)，提取3次，每次2小時(shí)，提取液過(guò)濾后合并，得到所述血脂寧β-環(huán)糊精提取物。

優(yōu)選的是，對(duì)所述共有峰進(jìn)行藥材歸屬包括如下步驟：

步驟a、分別稱取處方量陰性決明子復(fù)方、陰性制首烏復(fù)方、陰性荷葉復(fù)方、陰性山楂復(fù)方，并且分別制備水提取物以及β-環(huán)糊精提取物；

步驟b、分別建立所述水提取物以及所述β-環(huán)糊精提取物的指紋圖譜，其與34個(gè)共有指紋峰進(jìn)行比對(duì)；

步驟c、確定27個(gè)指紋峰歸屬于決明子，4個(gè)指紋峰歸屬于制首烏，4個(gè)指紋峰歸屬于荷葉，1個(gè)指紋峰歸屬于山楂。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較所具有的有益效果：

1、本發(fā)明所建立的復(fù)方血脂寧指紋圖譜具有精密度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好、方法簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確的鑒別復(fù)方血脂寧的質(zhì)量品質(zhì)；

2、本發(fā)明采用具有高分離度、高速度、高靈敏度特點(diǎn)的超高效液相色譜法建立血脂寧的中藥指紋圖譜，并選取荷葉堿、二苯乙烯苷、紅鐮霉素-龍膽二糖苷、槲皮素、橙黃決明素、大黃素作為活性指標(biāo)成分，建立血脂寧多指標(biāo)成分定量分析方法，為β-環(huán)糊精提取血脂寧新方法的應(yīng)用提供可靠質(zhì)量控制方法，同時(shí)能夠?yàn)檠瑢帍?fù)方優(yōu)化及β-CD對(duì)血脂寧中主要活性成分穩(wěn)定性及溶出度研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明所述的復(fù)方血脂寧水提物高效液相色譜圖。

圖2為本發(fā)明所述的復(fù)方血脂寧β-環(huán)糊精提取物高效液相色譜圖。

圖3為二苯乙烯對(duì)照品高效液相色譜圖。

圖4為血脂寧傳統(tǒng)水提取樣品指紋圖譜圖。

圖5為血脂寧β-環(huán)糊精提取樣品指紋圖譜圖。

圖6為血脂寧共有指紋峰色譜圖。

圖7為決明子陰性復(fù)方指紋圖譜圖。

圖8為制首烏陰性復(fù)方指紋圖譜圖。

圖9為荷葉陰性復(fù)方指紋圖譜圖。

圖10為山楂陰性復(fù)方指紋圖譜圖。

圖11為決明子和制首烏陰性復(fù)方指紋圖譜圖。

圖12為制首烏和山楂陰性復(fù)方指紋圖譜圖。

圖13為采用BEH C18色譜柱，柱溫45℃，甲醇起始比例為10％，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm色譜條件的高效液相色譜圖。

圖14為采用BEH shield RP18色譜柱，柱溫45℃，甲醇起始比例為10％，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm色譜條件的高效液相色譜圖。

圖15為采用BEH shield RP18色譜柱，柱溫45℃，甲醇起始比例為5％，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm色譜條件的高效液相色譜圖。

圖16為采用BEH shield RP18色譜柱，柱溫40℃，甲醇起始比例為10％，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm色譜條件的高效液相色譜圖。

圖17為采用BEH shield RP18色譜柱，柱溫50℃，甲醇起始比例為10％，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm色譜條件的高效液相色譜圖。

圖18為采用BEH shield RP18色譜柱，柱溫45℃，甲醇起始比例為10％，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm色譜條件的高效液相色譜圖。

圖19為254nm對(duì)照品溶液高效液相色譜圖。

圖20為280nm對(duì)照品溶液高效液相色譜圖。

圖21為320nm對(duì)照品溶液高效液相色譜圖。

圖22為254nm血脂寧供試品溶液高效液相色譜圖。

圖23為280nm血脂寧供試品溶液高效液相色譜圖。

圖24為320nm血脂寧供試品溶液高效液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū)文字能夠據(jù)以實(shí)施。

復(fù)方血脂寧提取物指紋圖譜的建立方法，采用高效液相色譜法，包括如下步驟：

對(duì)照品溶液的制備：取二苯乙烯苷對(duì)照品，加甲醇溶解，定容，作為供試品溶液；

供試品溶液的制備：按照復(fù)方血脂寧處方量稱取藥材，用水或者β-環(huán)糊精水溶液提取，定容，作為供試品溶液；

色譜條件：采用色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以體積分?jǐn)?shù)100％甲醇為A相，體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸為B相，組成流動(dòng)相，采用梯度洗脫，柱溫為40℃～50℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流速為0.2mL/min，分析時(shí)間為40min；

建立指紋圖譜：采用進(jìn)樣量為3μL注入高效液相色譜儀，得到所述指紋圖譜。

在另一種實(shí)施例中，梯度洗脫的洗脫程序如下：

0分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為10％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為90％的甲酸溶液；

2分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為25％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為75％的甲酸溶液；

9分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為35％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為65％的甲酸溶液；

12分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為40％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為60％的甲酸溶液；

40分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為90％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為10％的甲酸溶液；

所述柱溫為45℃；所述流速：0.2mL/min；所述進(jìn)樣量：3μL。

在另一種實(shí)施例中，用水提取復(fù)方血脂寧物制備工藝包括：按照處方量復(fù)方血脂寧分別稱取決明子3g，制首烏2g，荷葉1.5g，山楂1g，加入25倍量水，浸泡1小時(shí)，提取3次，每次2小時(shí)，提取液過(guò)濾后合并，得到復(fù)方血脂寧水提取供試液；用β-環(huán)糊精提取血脂寧物制備工藝包括：按照處方量復(fù)方血脂寧分別稱取決明子3g，制首烏2g，荷葉1.5g，山楂1g，加入占藥材量5％β-環(huán)糊精，25倍量水，浸泡1小時(shí)，提取3次，每次2小時(shí)，提取液過(guò)濾后合并，得到所述復(fù)方血脂寧β-環(huán)糊精提取供試液。

在另一種實(shí)施例中，如圖6所示，指紋圖譜包括34個(gè)共有指紋峰，相對(duì)保留時(shí)間分別為：1號(hào)峰：0.52；2號(hào)峰：0.57；3號(hào)峰：0.61；4號(hào)峰：0.66；5號(hào)峰：0.89；6號(hào)峰：0.97；7號(hào)峰：1.00；8號(hào)峰：1.03；9號(hào)峰：1.13；10號(hào)峰：1.22；11號(hào)峰：1.26；12號(hào)峰：1.32；13號(hào)峰：1.35；14號(hào)峰：1.37；15號(hào)峰：1.46；16號(hào)峰：1.65；17號(hào)峰：1.68；18號(hào)峰：1.80；19號(hào)峰：1.83；20號(hào)峰：1.86；21號(hào)峰：1.88；22號(hào)峰：1.91；23號(hào)峰：2.06；24號(hào)峰：2.16；25號(hào)峰：2.21；26號(hào)峰：2.50；27號(hào)峰：2.67；28號(hào)峰：2.78；29號(hào)峰：2.87；30號(hào)峰：2.92；31號(hào)峰：2.96；32號(hào)峰：3.26；33號(hào)峰：3.53；34號(hào)峰：3.69。

實(shí)施例1

1材料

1.1藥品

決明子(產(chǎn)地：越南)、制首烏(產(chǎn)地：四川)、荷葉(產(chǎn)地：山東)、山楂(產(chǎn)地：承德)。

1.2試劑

1.3儀器

2方法與結(jié)果

2.1復(fù)方血脂寧中藥指紋圖譜

2.1.1色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1×100mm,1.7μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脫程序見(jiàn)下表1；流速：0.2mL/min；柱溫：45℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；分析時(shí)間：40min；進(jìn)樣量3μL；如圖1～3所示，為血脂寧高效液相色譜圖。

表1梯度洗脫表

2.1.2樣品溶液制備

血脂寧傳統(tǒng)水提工藝按照血脂寧復(fù)方稱取藥材，決明子3g，制首烏2g，荷葉1.5g，山楂1g，加入25倍量水，浸泡1小時(shí)，提取3次，每次2小時(shí)。提取液過(guò)濾后合并，即為血脂寧傳統(tǒng)水提樣品。

血脂寧β-環(huán)糊精提取工藝按照血脂寧復(fù)方稱取藥材，決明子3g，制首烏2g，荷葉1.5g，山楂1g，加入占藥材量5％β-環(huán)糊精，25倍量水，浸泡1小時(shí)，提取3次，每次2小時(shí)。提取液過(guò)濾后合并，即為血脂寧β-環(huán)糊精提取樣品。

供試品溶液制備精密量取1mL提取樣品，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，超聲30min，10000r·min^-1離心10min，上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，收集續(xù)濾液即為供試品溶液。

對(duì)照品溶液制備取二苯乙烯苷對(duì)照品適量，精密稱定，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。

2.1.3血脂寧指紋圖譜

按血脂寧復(fù)方稱取藥材10份，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，10批傳統(tǒng)水提取樣品與β-環(huán)糊精提取樣品指紋圖譜(圖4、圖5所示)。對(duì)比血脂寧傳統(tǒng)提取與β-環(huán)糊精提取樣品指紋譜圖可知，兩種提取方法樣品指紋峰數(shù)目相同，根據(jù)各自10批樣品共標(biāo)定34個(gè)共有指紋峰(如圖6所示)。

2.1.4相似度評(píng)價(jià)

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，對(duì)血脂寧10批傳統(tǒng)提取樣品及10批β-環(huán)糊精提取樣品分別進(jìn)行相似度判別，結(jié)果傳統(tǒng)提取樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果均大于0.988，表明各批次樣品相關(guān)性好，提取工藝穩(wěn)定；β-環(huán)糊精提取樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果均大于0.986，同樣表明各批次樣品相關(guān)性好，提取工藝穩(wěn)定，并且說(shuō)明本發(fā)明建立的復(fù)方血脂寧指紋圖譜方法準(zhǔn)確可靠，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2血脂寧10批傳統(tǒng)提取樣品相似度計(jì)算結(jié)果

表3血脂寧10批β-環(huán)糊精提取樣品相似度計(jì)算結(jié)果

2.1.5方法學(xué)驗(yàn)證

精密度試驗(yàn)取同一供試液連續(xù)進(jìn)樣6次，以二苯乙烯苷(7號(hào)峰)為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜2.0％；相對(duì)峰面積RSD＜3.0％，表明該色譜方法精密度良好，結(jié)果見(jiàn)表4，見(jiàn)表5。

表4共有峰相對(duì)保留時(shí)間精密度試驗(yàn)結(jié)果

表5共有峰相對(duì)峰面積精密度試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試液，分別于0，2，4，8，12，18，24h進(jìn)樣分析，以二苯乙烯苷(7號(hào)峰)為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.34％；相對(duì)峰面積的RSD＜2.9％，表明該色譜方法測(cè)定樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表6、表7。

表6共有峰相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表7共有峰相對(duì)峰面積穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)性試驗(yàn)平行制備6份供試液，進(jìn)樣分析，以二苯乙烯苷(7號(hào)峰)為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.37％；相對(duì)峰面積的RSD<2.9％，表明該色譜方法重復(fù)性良好，結(jié)果見(jiàn)表8、表9。

表8共有峰相對(duì)保留時(shí)間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表9共有峰相對(duì)峰面積重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

復(fù)方血脂寧提取物的活性成分定量分析方法，包括如下步驟：

選取多組處方量復(fù)方血脂寧，分別制備血脂寧水提取物以及血脂寧β-環(huán)糊精提取物，得到所述血脂寧水提取物以及所述血脂寧β-環(huán)糊精提取物的指紋圖譜，確定34個(gè)共有指紋峰，對(duì)共有指紋峰進(jìn)行藥材歸屬以及對(duì)共有峰進(jìn)行成分確定，在確定的成分中選取荷葉堿、二苯乙烯苷、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷、槲皮素、橙黃決明素、大黃素活性指標(biāo)成分，建立復(fù)方血脂寧多指標(biāo)成分定量分析方法。

在另一種實(shí)施例中，在所述步驟三中，建立復(fù)方血脂寧多指標(biāo)成分定量分析方法包括如下步驟：

對(duì)照品溶液的制備：取荷葉堿、二苯乙烯苷、紅鐮霉素-龍膽二糖苷、槲皮素、橙黃決明素、大黃素對(duì)照品，加甲醇溶解并定容，作為對(duì)照品溶液；

供試品溶液的制備：量取血脂寧提取物，加甲醇定容，搖勻，超聲，離心，上清液經(jīng)濾膜過(guò)濾，收集續(xù)濾液，作為供試品溶液；

色譜條件：采用色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以體積分?jǐn)?shù)100％甲醇為A相，體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸為B相，組成流動(dòng)相，采用梯度洗脫，柱溫為40℃～50℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm～320nm，流速為0.2mL/min，分析時(shí)間為40min。

在另一種實(shí)施例中，所述色譜條件：

采用色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以體積分?jǐn)?shù)100％甲醇為A相，體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸為B相，組成流動(dòng)相，采用梯度洗脫，柱溫為45℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm、280nm、320nm，流速為0.2mL/min，分析時(shí)間為40min，進(jìn)樣量為3μL；

梯度洗脫的洗脫程序如下：

0分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為10％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為90％的甲酸溶液；

2分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為25％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為75％的甲酸溶液；

9分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為35％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為65％的甲酸溶液；

12分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為40％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為60％的甲酸溶液；

40分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為90％的甲醇溶液，流動(dòng)相B為10％的甲酸溶液。

在另一種實(shí)施例中，血脂寧水提取物制備工藝包括：按照處方量復(fù)方血脂寧分別稱取決明子3g，制首烏2g，荷葉1.5g，山楂1g，加入25倍量水，浸泡1小時(shí)，提取3次，每次2小時(shí)，提取液過(guò)濾后合并，得到所述血脂寧水提取物；血脂寧β-環(huán)糊精提取物制備工藝包括：按照處方量復(fù)方血脂寧分別稱取決明子3g，制首烏2g，荷葉1.5g，山楂1g，加入占藥材量5％β-環(huán)糊精，25倍量水，浸泡1小時(shí)，提取3次，每次2小時(shí)，提取液過(guò)濾后合并，得到所述血脂寧β-環(huán)糊精提取物。

在另一種實(shí)施例中，對(duì)共有峰進(jìn)行藥材歸屬包括如下步驟：

步驟a、分別稱取處方量陰性決明子復(fù)方、陰性制首烏復(fù)方、陰性荷葉復(fù)方、陰性山楂復(fù)方，并且分別制備水提取物以及β-環(huán)糊精提取物；

步驟b、分別建立所述水提取物以及所述β-環(huán)糊精提取物的指紋圖譜，其與34個(gè)共有指紋峰進(jìn)行比對(duì)；

步驟c、確定27個(gè)指紋峰歸屬于決明子，4個(gè)指紋峰歸屬于制首烏，4個(gè)指紋峰歸屬于荷葉，1個(gè)指紋峰歸屬于山楂。

實(shí)施例2

1材料

1.1藥品

荷葉堿(111566-200703)、槲皮素(100081-200907)、大黃素(110756-200110)、大黃酚(110796-201017)、大黃素甲醚(110758-201013)、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱二苯乙烯苷，110844-200606)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷(簡(jiǎn)稱紅鐮霉素-龍膽二糖苷，純度≥98％)購(gòu)自南京拓海生物科技有限公司。決明子(產(chǎn)地：越南)、制首烏(產(chǎn)地：四川)、荷葉(產(chǎn)地：山東)、山楂(產(chǎn)地：承德)。

1.2試劑

1.3儀器

2方法與結(jié)果

2.1復(fù)方血脂寧中藥指紋圖譜

2.1.1采用實(shí)施例1中“2.1.1～2.1.3”項(xiàng)下確定復(fù)方血脂寧中藥指紋圖譜。

2.1.2共有指紋峰歸屬

分別按復(fù)方量稱取陰性決明子、制首烏、荷葉、山楂復(fù)方，按實(shí)施例1中“2.1.2”項(xiàng)下樣品制備方法制備各藥材陰性藥材樣品，進(jìn)樣分析，對(duì)34個(gè)共有指紋峰進(jìn)行了歸屬，結(jié)果見(jiàn)表10和表11，對(duì)陰性樣品供試品溶液指紋圖譜分析結(jié)果見(jiàn)圖7～12。

表10共有指紋峰歸屬

注：表內(nèi)色譜峰名稱經(jīng)前期質(zhì)譜定性研究確定。

表11共有指紋峰各藥材歸屬數(shù)量

根據(jù)復(fù)方血脂寧中藥指紋圖譜中色譜峰藥材歸屬試驗(yàn)結(jié)果，選取決明子中的紅鐮霉素-龍膽二糖苷、橙黃決明素、大黃素，制首烏中的二苯乙烯苷、大黃素，荷葉中的荷葉堿、槲皮素作為多指標(biāo)成分定量分析方法的指標(biāo)成分，而山楂在血脂寧復(fù)方中用量相對(duì)最小，且指紋圖譜中山楂成分未獲得確認(rèn)，因此綜合考量未選取來(lái)源于山楂的化學(xué)成分作為指標(biāo)成分。

中藥復(fù)方中化學(xué)成分復(fù)雜，質(zhì)量控制中指標(biāo)成分選取應(yīng)首先考慮已明確的藥效活性成分，以保證提取物的有效性，多項(xiàng)研究表明荷葉堿、二苯乙烯苷、紅鐮霉素-龍膽二糖苷、槲皮素、橙黃決明素和大黃素均具有一定的降血脂活性，因此選取以上成分作為血脂寧定量分析方法的指標(biāo)以保證提取物的降血脂活性。

2.2血脂寧多指標(biāo)成分定量分析方法

2.2.1色譜條件的優(yōu)化

復(fù)方血脂寧由四味藥材組成，化學(xué)成分復(fù)雜多樣，值得一提的是決明子藥材中所含成分同分異構(gòu)體較多，性質(zhì)相近，為了提高分析的靈敏度，使色譜峰達(dá)到良好的分離效果，本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑消耗少、分析效率高的UPLC建立分析方法，試驗(yàn)中對(duì)色譜柱、柱溫、流動(dòng)相等條件進(jìn)行了考察和優(yōu)化，以甲醇-0.1％甲酸水系統(tǒng)為流動(dòng)相，0～20分鐘內(nèi)將甲醇比例由10％升至90％，柱溫45℃，如圖13～14所示，對(duì)Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1×100mm,1.7μm)、Acquity UPLC BEH C₁₈(3.0×100mm,1.7μm)兩種色譜柱進(jìn)行比較，結(jié)果表明，使用Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1×100mm,1.7μm)，各色譜峰分離情況且峰形較好；如圖14～15所示，對(duì)流動(dòng)相中甲醇的初始比例進(jìn)行比較，分別采用5％甲醇以及10％甲醇進(jìn)行考察，采用10％甲醇的初始比例可節(jié)省分析時(shí)間；如圖16～18所示，通過(guò)對(duì)40℃、45℃、50℃柱溫的考察，在柱溫45℃下，分離效果較為理想；在280nm下檢測(cè)到的色譜峰最多，反映的成分信息更為全面，因此選用280nm作為定性的檢測(cè)波長(zhǎng)，最終選取圖14所示的色譜初始條件并通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相梯度洗脫比例，確定復(fù)方血脂寧的分析方法，定量分析方法根據(jù)所選定的指標(biāo)成分，分別選擇254、280和320nm三個(gè)波長(zhǎng)，保證活性指標(biāo)成分含量準(zhǔn)確測(cè)定。

2.2.2色譜條件的確定

色譜柱：Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1×100mm,1.7μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)–0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脫程序見(jiàn)下表12；流速：0.2mL/min；柱溫：45℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254、280、320nm；分析時(shí)間：40min；進(jìn)樣量3μL，如圖19～24，圖中1為荷葉堿，2為二苯乙烯苷，3為紅鐮霉素-龍膽二糖苷，4為槲皮素，5為橙黃決明素，6為大黃素。

表12梯度洗脫表

2.2.3樣品溶液制備

對(duì)照品溶液制備選取活性成分荷葉堿、二苯乙烯苷、紅鐮霉素-龍膽二糖苷、槲皮素、橙黃決明素、大黃素對(duì)照品適量，精密稱定，分別置10mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制得對(duì)照品溶液。

供試品溶液制備精密量取1mL提取液，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，超聲30min，10000r·min^-1離心10min，上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，收集續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.2.4方法學(xué)驗(yàn)證

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密量取荷葉堿、二苯乙烯苷、紅鐮霉素-龍膽二糖苷、槲皮素、橙黃決明素以及大黃素對(duì)照品溶液適量，逐級(jí)稀釋，分別配成一系列濃度的對(duì)照品溶液，取上述系列對(duì)照品溶液3μL進(jìn)樣分析，分別于波長(zhǎng)254nm(槲皮素)、280nm(荷葉堿、紅鐮霉素-龍膽二糖苷、橙黃決明素、大黃素)、320nm(二苯乙烯苷)下測(cè)定并記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，求得的回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表13。

表13標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限和檢測(cè)限

精密度試驗(yàn)取荷葉堿、二苯乙烯苷、紅鐮霉素-龍膽二糖苷、槲皮素、橙黃決明素以及大黃素對(duì)照品混合溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD值均小于1.43％，表明該色譜方法精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表14。

表14精密度試驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品，平行配制6份供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定各成分的峰面積，計(jì)算RSD均小于1.85％，表明該色譜方法重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表15。

表15重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(μg·mL^-1)

穩(wěn)定性試驗(yàn)取一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24h進(jìn)樣，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定各成分的峰面積，計(jì)算RSD均小于1.88％，表明供試品溶液室溫放置24h基本穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表16。

表16穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(μg·mL^-1)

加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的樣品，分別加入荷葉堿、二苯乙烯苷、紅鐮霉素-龍膽二糖苷、槲皮素、橙黃決明素、大黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按樣品制備方法制得供試品溶液6份，進(jìn)樣分析，計(jì)算各成分的平均加樣回率為99.39％～101.19％，RSD(％)<1.36％，表明測(cè)定方法加樣回收率符合試驗(yàn)要求。結(jié)果見(jiàn)表17。

表17加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5樣品測(cè)定

分別按照血脂寧處方稱取復(fù)方藥材3份，以傳統(tǒng)水提和β-CD提取復(fù)方按照實(shí)施例1中“2.1.2”制備供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定各成分含量，如表18所示。

表18指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果

注：**表示與傳統(tǒng)水提工藝相比有顯著性差異，P<0.01

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，β-環(huán)糊精提取血脂寧與傳統(tǒng)水提方法比較，指標(biāo)成分荷葉堿、二苯乙烯苷、紅鐮霉素-龍膽二糖苷、槲皮素、橙黃決明素、大黃素提取率顯著提高(P<0.01)。提取率提高程度不同也表明了β-環(huán)糊精的分子選擇性，同時(shí)通過(guò)本發(fā)明建立的復(fù)方血脂寧提取物的活性定量分析方法能夠?qū)Ζ?環(huán)糊精提取血脂寧與傳統(tǒng)水提血脂寧同時(shí)進(jìn)行定量分析測(cè)定。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開(kāi)如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書(shū)和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。