本發(fā)明涉及蘭科石斛屬藥用植物產(chǎn)品的鑒別和質(zhì)量控制方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法。

背景技術(shù)：

安徽省大別山地區(qū)主要產(chǎn)3種藥用石斛，種名分別為：霍山石斛(Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng)(又稱霍山米斛)、鐵皮石斛(Dendrobium candidum Wall.exLindl.)(又稱黑節(jié)草)和細(xì)莖石斛(Dendrobium moniliforme (Linn.)Sw.)(又稱銅皮石斛)。三者均為蘭科石斛，屬多年生草本植物，主要含有多糖、生物堿、聯(lián)芐類和菲類等活性成分，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、擴(kuò)張血管、降血糖等多種功效。三者共同被安徽省政府申報(bào)為地理標(biāo)志產(chǎn)品“霍山石斛”(物種名稱“霍山石斛”僅指一種，地理標(biāo)志“霍山石斛”指代三種)。

多糖類化合物是天然藥物的主要活性成分之一。其活性與其多糖的空間結(jié)構(gòu)及分子量分布密切相關(guān)。為探索其組分和藥效的相關(guān)性，本方案采用高效體積排阻色譜法(HPSEC)對(duì)同一產(chǎn)地不同種類石斛多糖的相對(duì)分子質(zhì)量的分布進(jìn)行比較分析，從不同分子量多糖的比例和分布來(lái)表征不同物種石斛多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，建立HPSEC色譜指紋圖譜為后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供可行辦法。迄今為止，未見(jiàn)關(guān)于利用HPSEC色譜建立藥用石斛多糖色譜指紋圖譜的公開(kāi)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種更準(zhǔn)確可靠的鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法，該圖譜方法是根據(jù)藥用石斛主要藥效基礎(chǔ)物質(zhì)多糖建立的HPSEC色譜圖譜，本發(fā)明建立的多糖分子量分布圖譜能有效區(qū)分不同石斛種類，既可彌補(bǔ)單憑總多糖、生物堿的含量和多糖酸解成單糖的組成比來(lái)判斷鐵皮石斛或霍山石斛優(yōu)劣和真?zhèn)蔚牟蛔悖部捎脕?lái)鑒別地理標(biāo)志產(chǎn)品“霍山石斛”與其他產(chǎn)區(qū)的石斛品種。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法，包括如下步驟：

(1)：多糖提取

將按照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法取樣得到的已知不同品種的藥用石斛材料按照同種類混合，于50-60℃的烘箱中烘干至恒重，并粉碎成粉，80℃-90℃的無(wú)水乙醇索氏提取至回流液無(wú)色，揮干溶劑，將所得石斛藥渣按照料液比(0.5-1)：(5-7)加入蒸餾水中，并于75℃-85℃水浴冷凝回流提取4-5次，每次3-4h；接著，合并上述提取濾液并減壓濃縮獲得粗多糖溶液；

(2)：多糖純化及濃縮

將所得粗多糖溶液按照體積比(0.5-1):(3-4)加入無(wú)水乙醇中，再于3-5℃冰箱中靜置20-30h，接著，3000-4000r/min轉(zhuǎn)速下離心2-5min，且重復(fù)操作3-4次后留取沉淀，并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行多糖純化，其中，多糖純化采用兩步純化法：

①采用Sevage法對(duì)多糖溶液脫蛋白處理，實(shí)現(xiàn)第一步純化；

②收集第一步純化后多糖溶液，通過(guò)超濾裝置超濾，脫去小分子物質(zhì)并同時(shí)濃縮多糖溶液，實(shí)現(xiàn)第二步純化至最終獲得純化后的多糖濃縮溶液；

(3)：色譜分析及色譜指紋圖譜的建立

①色譜類型

高效體積排阻色譜HPSEC；

②色譜條件

流動(dòng)相：0.1-0.2M醋酸鈉；流速：0.5-1.0mL/min；柱溫：35-45℃；進(jìn)樣量：20μL；

③多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得

將不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成4-5mg/mL的水溶液分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC中，再根據(jù)各相應(yīng)色譜圖計(jì)算多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；

④樣品分子量分布分析及色譜指紋圖譜的建立

多糖純化后的石斛樣品分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC，獲取相應(yīng)色譜圖，再根據(jù)多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出各樣品的色譜曲線各部分的相對(duì)分子量，最終建立相應(yīng)已知的石斛樣品的色譜指紋圖譜；

(4)：未知種類石斛的鑒定

將未知種類的石斛按照以上步驟(1)-(3)進(jìn)行處理，以得到其對(duì)應(yīng)色譜指紋圖譜，再將其與已建立的已知的石斛樣品的色譜指紋圖譜進(jìn)行相似度比較，當(dāng)其相似度大于90％以上時(shí)，即可判定為同一類石斛屬植物，否則不是同一種屬。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中藥用石斛的品種分別為：霍山石斛、鐵皮石斛與細(xì)莖石斛。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中藥用石斛材料包括藥用石斛干品和鮮品，所述藥用石斛干品又進(jìn)一步包括楓斗、寸金、粉末；所述藥用石斛鮮品具體為根系生長(zhǎng)三年以上，當(dāng)年抽條越冬后的石斛去葉鮮莖，并且，所述藥用石斛鮮品需在切成薄片后混合使用。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為：在安徽大別山區(qū)采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行藥用石斛樣品的收集。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中采用Sevage法具體步驟為：先將所得沉淀用蒸餾水溶解并混勻，接著，按照樣品與萃取劑體積比(3-5)：(0.5-2)加入Sevage試劑，混勻振蕩25-35min，再以3000-4000r/min離心5-6min，棄去除下層氯仿及中層變性蛋白；再取上層水溶液重復(fù)去蛋白操作，至無(wú)明顯中層為止；最后，收集去蛋白后的上層水溶液。

優(yōu)選地，所述Sevage試劑為體積比分別為(3-5)∶(0.5-1.5)的氯仿與正丁醇的混合液。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中超濾裝置為濾膜截留分子量為1K的超濾裝置。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的重均分子量Mw分別為：2000KDa、580KDa、70KDa、10KDa、5KDa。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的計(jì)算方法為：根據(jù)各葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間和分子量對(duì)數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對(duì)數(shù)lgMw為縱坐標(biāo)，色譜峰保留時(shí)間Rt為橫坐標(biāo)，使用線性方程擬合得多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

優(yōu)選地，所述步驟(3)中色譜條件還包括：

色譜柱型號(hào)及裝柱方式：Ultrahydrogel^TM Linear 300mm×7.8mm，兩根串聯(lián)；檢測(cè)器類型：示差折光檢測(cè)器RID。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明提供的安徽大別山產(chǎn)三種石斛多糖分子量分布的HPSEC色譜指紋圖譜為代表模式圖譜，能通過(guò)石斛主要藥效成分-石斛多糖的分子量分布來(lái)有效區(qū)分和鑒別安徽大別山產(chǎn)的三種石斛；該方法能彌補(bǔ)中國(guó)藥典2015版設(shè)定的鐵皮石斛鑒定方法和霍山石斛的2016版安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)(DB34/T 486-2016)中的鑒定方法的不足，因?yàn)楹髢烧呤且钥偠嗵呛?、總生物堿含量和多糖酸解成單糖的組成比作為其質(zhì)量評(píng)價(jià)和判斷標(biāo)準(zhǔn)，是一種粗略的疊加信息，制假者利用檢測(cè)方法的漏洞可以造假，而本方法更貼近化學(xué)組分的本質(zhì)，是更精細(xì)的信息，制假者幾乎無(wú)法仿制或仿制成本昂貴。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1-2提供的一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法的流程圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1提供的一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法的安徽大別山產(chǎn)霍山石斛多糖的分子量分布圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1提供的一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法的安徽大別山產(chǎn)細(xì)莖石斛多糖的分子量分布圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1提供的一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法的安徽大別山產(chǎn)鐵皮石斛多糖的分子量分布圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法，如圖1所示，包括如下步驟：

(1)：多糖提取

將按照五點(diǎn)取樣法于安徽大別山區(qū)取樣得到的已知三種根系生長(zhǎng)三年以上的藥用石斛(霍山石斛、鐵皮石斛、細(xì)莖石斛)的當(dāng)年抽條越冬后的鮮莖去葉處理，按種類分別切成薄片混合，再于60℃的烘箱中烘干至恒重，并粉碎成粉，85℃的無(wú)水乙醇索氏提取至回流液無(wú)色，揮干溶劑，將所得石斛藥渣按照料液比1：5加入蒸餾水中，并于80℃水浴冷凝回流提取4次，每次4h；接著，合并上述提取濾液并減壓濃縮獲得粗多糖溶液；

(2)：多糖純化及濃縮

將所得粗多糖溶液按照體積比1:4加入無(wú)水乙醇中，再于4℃冰箱中靜置24h，接著，4000r/min轉(zhuǎn)速下離心2-5min，且重復(fù)操作3次，合并沉淀，并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行多糖純化，其中，多糖純化采用兩步純化法：

①采用Sevage法對(duì)多糖溶液脫蛋白處理，實(shí)現(xiàn)第一步純化：先將所得沉淀用蒸餾水溶解并混勻，接著，按照樣品與萃取劑體積比4：1加入Sevage試劑(體積比分別為4∶1的氯仿與正丁醇混合液)，混勻振蕩30min，再以4000r/min離心5min，棄去除下層氯仿及中層變性蛋白；再取上層水溶液重復(fù)去蛋白操作，至無(wú)明顯中層為止；最后，收集去蛋白后的上層水溶液；

②收集第一步純化后多糖溶液，通過(guò)超濾裝置超濾，濾膜截留分子量為1K，脫去小分子物質(zhì)并同時(shí)濃縮多糖溶液，實(shí)現(xiàn)第二步純化至最終獲得純化后的多糖濃縮溶液；

(3)：色譜分析及色譜指紋圖譜的建立

①色譜類型

高效體積排阻色譜HPSEC；

②色譜條件

色譜柱型號(hào)及裝柱方式：Ultrahydrogel^TM Linear 300mm×7.8mm，兩根串聯(lián)；檢測(cè)器類型：示差折光檢測(cè)器RID；流動(dòng)相：0.1M醋酸鈉；流速：0.8mL/min；柱溫：45℃；進(jìn)樣量：20μL；

③多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得

將重均分子量Mw分別為：2000KDa、580KDa、70KDa、10KDa、5KDa的五種葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成5mg/mL的水溶液分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC中，再根據(jù)各葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間和分子量對(duì)數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對(duì)數(shù)lgMw為縱坐標(biāo)，色譜峰保留時(shí)間Rt為橫坐標(biāo)，使用線性方程擬合得多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：lgMw＝y(tǒng)＝-0.3488x+11.134 R²＝0.9948；

④樣品分子量分布分析及色譜指紋圖譜的建立

多糖純化后的石斛樣品分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC，獲取相應(yīng)色譜圖，再根據(jù)多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出各樣品的色譜曲線各部分的相對(duì)分子量，最終建立相應(yīng)已知的石斛樣品的色譜指紋圖譜；圖2-4則分別為三種霍山產(chǎn)石斛在高效體積排阻色譜HPSEC中得到的峰譜圖，即以橫坐標(biāo)為出峰時(shí)間(單位：分鐘)，縱坐標(biāo)為光電信號(hào)的響應(yīng)值(單位：毫伏)的多糖的分子量分布圖，其中，色譜峰上的數(shù)據(jù)為各切割點(diǎn)的相對(duì)分子量Mw，是通過(guò)上述多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出；三種石斛樣品的HPSEC圖譜的峰按分子量范圍切割成6個(gè)部分，分子量分別為：大于500KDa、500KDa-200KDa、200KDa-100KDa、100KDa-50KDa、50KDa-10Kda、<10KDa；圖譜經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性試驗(yàn)、精密性試驗(yàn)和重現(xiàn)性試驗(yàn)等方法學(xué)考察，相對(duì)峰面積變化的RSD均小于3％，符合色譜方法學(xué)要求；

一般分子量在50KDa-200KDa之間的部分的多糖可能具有顯著的抗腫瘤活性，將分子量在50KDa-200KDa的峰面積占總峰面積的百分比數(shù)據(jù)被列出得到表1，即不同分子量的石斛多糖占總多糖的比例表；

表1 不同分子量的石斛多糖占總多糖的比例

由表1可知，安徽大別山產(chǎn)三種石斛的多糖含量和分子量分布均有明顯差異，不同分子量的多糖的相對(duì)比例不同，特別是分子量在50KDa～200KDa之間的多糖所占比例有明顯差異，分別為：霍山石斛16.38±1.4％、細(xì)莖石斛21.61±1.3％、鐵皮石斛14.19±1.5％。這表明，同一產(chǎn)地、同一培養(yǎng)條件下的三種石斛的多糖分子量分布存在明顯差異，這種差異可能與其種類和生理活性密切相關(guān)，也同時(shí)提示三種石斛的藥效差異可能源于活性多糖相對(duì)比例的差異；

因此，圖2-4的三個(gè)圖譜即為安徽大別山產(chǎn)三種石斛多糖分子量分布的HPSEC色譜指紋圖譜的代表模式圖譜；

(4)：未知種類石斛的鑒定

將兩種未知種類的石斛按照以上步驟(1)-(3)進(jìn)行處理，得到其對(duì)應(yīng)色譜指紋圖譜，再根據(jù)中國(guó)藥典委員會(huì)出品的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件進(jìn)行判定，結(jié)果表明一種石斛的圖譜和安徽大別山產(chǎn)霍山石斛的相似度達(dá)94％，即判定為安徽大別山產(chǎn)霍山石斛，而另一種石斛的圖譜與安徽大別山產(chǎn)三種石斛代表模式指紋圖譜的相似度均達(dá)不到90％，則判定該石斛并非安徽大別山產(chǎn)石斛。

實(shí)施例2

一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法，如圖1所示，包括如下步驟：

(1)：多糖提取

將按照五點(diǎn)取樣法于安徽大別山區(qū)取樣得到的已知三種藥用石斛(霍山石斛、鐵皮石斛、細(xì)莖石斛)楓斗按種類混合，再于55℃的烘箱中烘干至恒重，并粉碎成粉，80℃的無(wú)水乙醇索氏提取至回流液無(wú)色，揮干溶劑，將所得石斛藥渣按照料液比1：6加入蒸餾水中，并于80℃水浴冷凝回流提取5次，每次3h；接著，合并上述提取濾液并減壓濃縮獲得粗多糖溶液；

(2)：多糖純化及濃縮

將所得粗多糖溶液按照體積比1:4加入無(wú)水乙醇中，再于5℃冰箱中靜置30h，接著，3500r/min轉(zhuǎn)速下離心4min，且重復(fù)操作4次，合并沉淀，并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行多糖純化，其中，多糖純化采用兩步純化法：

①采用Sevage法對(duì)多糖溶液脫蛋白處理，實(shí)現(xiàn)第一步純化：先將所得沉淀用蒸餾水溶解并混勻，接著，按照樣品與萃取劑體積比4：1加入Sevage試劑(體積比分別為4∶1的氯仿與正丁醇混合液)，混勻振蕩25min，再以4000r/min離心6min，棄去除下層氯仿及中層變性蛋白；再取上層水溶液重復(fù)去蛋白操作，至無(wú)明顯中層為止；最后，收集去蛋白后的上層水溶液；

②收集第一步純化后多糖溶液，通過(guò)超濾裝置超濾，濾膜截留分子量為1K，脫去小分子物質(zhì)并同時(shí)濃縮多糖溶液，實(shí)現(xiàn)第二步純化至最終獲得純化后的多糖濃縮溶液；

(3)：色譜分析及色譜指紋圖譜的建立

①色譜類型

高效體積排阻色譜HPSEC；

②色譜條件

色譜柱型號(hào)及裝柱方式：Ultrahydrogel^TM Linear 300mm×7.8mm，兩根串聯(lián)；檢測(cè)器類型：示差折光檢測(cè)器RID；流動(dòng)相：0.1M醋酸鈉；流速：1.0mL/min；柱溫：45℃；進(jìn)樣量：20μL；

③多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得

將重均分子量Mw分別為：2000KDa、580KDa、70KDa、10KDa、5KDa的五種葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成5mg/mL的水溶液分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC中，再根據(jù)各葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間和分子量對(duì)數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對(duì)數(shù)lgMw為縱坐標(biāo)，色譜峰保留時(shí)間Rt為橫坐標(biāo)，使用線性方程擬合得多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：lgMw＝y(tǒng)＝-0.3488x+11.134R²＝0.9948；

④樣品分子量分布分析及色譜指紋圖譜的建立

多糖純化后的石斛樣品分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC，獲取相應(yīng)色譜圖，再根據(jù)多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出各樣品的色譜曲線各部分的相對(duì)分子量，最終建立相應(yīng)已知的石斛樣品的色譜指紋圖譜；

(4)：未知種類石斛的鑒定

將三種未知種類的石斛按照以上步驟(1)-(3)進(jìn)行處理，得到其對(duì)應(yīng)色譜指紋圖譜，再根據(jù)中國(guó)藥典委員會(huì)出品的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件進(jìn)行判定，結(jié)果表明一種石斛的圖譜與安徽大別山產(chǎn)鐵皮石斛的相似度達(dá)92％，即判定為安徽大別山區(qū)鐵皮石斛，一種石斛的圖譜和安徽大別山產(chǎn)細(xì)莖石斛的相似度達(dá)90％，即判定為安徽大別山產(chǎn)細(xì)莖石斛，而第三種石斛的圖譜與安徽大別山產(chǎn)的三種石斛代表模式指紋圖譜的相似度均達(dá)不到90％，則判定該石斛并非安徽大別山區(qū)產(chǎn)石斛。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。