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一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法與流程

文檔序號(hào):12119129閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法,其特征在于,包括如下步驟:

(1):多糖提取

將按照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法取樣得到的已知不同品種的藥用石斛材料按照同種類混合,于50-60℃的烘箱中烘干至恒重,并粉碎成粉,80℃-90℃的無水乙醇索氏提取至回流液無色,揮干溶劑,將所得石斛藥渣按照料液比(0.5-1):(5-7)加入蒸餾水中,并于75℃-85℃水浴冷凝回流提取4-5次,每次3-4h;接著,合并上述提取濾液并減壓濃縮獲得粗多糖溶液;

(2):多糖純化及濃縮

將所得粗多糖溶液按照體積比(0.5-1):(3-4)加入無水乙醇中,再于3-5℃冰箱中靜置20-30h,接著,3000-4000r/min轉(zhuǎn)速下離心2-5min,且重復(fù)操作3-4次后留取沉淀,并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行多糖純化,其中,多糖純化采用兩步純化法:

①采用Sevage法對(duì)多糖溶液脫蛋白處理,實(shí)現(xiàn)第一步純化;

②收集第一步純化后多糖溶液,通過超濾裝置超濾,脫去小分子物質(zhì)并同時(shí)濃縮多糖溶液,實(shí)現(xiàn)第二步純化至最終獲得純化后的多糖濃縮溶液;

(3):色譜分析及色譜指紋圖譜的建立

①色譜類型

高效體積排阻色譜HPSEC;

②色譜條件

流動(dòng)相:0.1-0.2M醋酸鈉;流速:0.5-1.0mL/min;柱溫:35-45℃;進(jìn)樣量:20μL;

③多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得

將不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成4-5mg/mL的水溶液分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC中,再根據(jù)各相應(yīng)色譜圖計(jì)算多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程;

④樣品分子量分布分析及色譜指紋圖譜的建立

多糖純化后的石斛樣品分別進(jìn)樣于高效體積排阻色譜HPSEC,獲取相應(yīng)色譜圖,再根據(jù)多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出各樣品的色譜曲線各部分的相對(duì)分子量,最終建立相應(yīng)已知的石斛樣品的色譜指紋圖譜;

(4):未知種類石斛的鑒定

將未知種類的石斛按照以上步驟(1)-(3)進(jìn)行處理,以得到其對(duì)應(yīng)色譜指紋圖譜,再將其與已建立的已知的石斛樣品的色譜指紋圖譜進(jìn)行相似度比較,當(dāng)其相似度大于90%以上時(shí),即可判定為同一類石斛屬植物,否則不是同一種屬。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法,其特征在于,所述步驟(1)中藥用石斛的品種分別為:霍山石斛、鐵皮石斛與細(xì)莖石斛。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法,其特征在于,所述步驟(1)中藥用石斛材料包括藥用石斛干品和鮮品,所述藥用石斛干品又進(jìn)一步包括楓斗、寸金、粉末;所述藥用石斛鮮品具體為根系生長三年以上,當(dāng)年抽條越冬后的石斛去葉鮮莖,并且,所述藥用石斛鮮品需在切成薄片后混合使用。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法,其特征在于,所述步驟(1)中統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為:在安徽大別山區(qū)采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行藥用石斛樣品的收集。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法,其特征在于,所述步驟(2)中采用Sevage法具體步驟為:先將所得沉淀用蒸餾水溶解并混勻,接著,按照樣品與萃取劑體積比(3-5):(0.5-2)加入Sevage試劑,混勻振蕩25-35min,再以3000-4000r/min離心5-6min,棄去除下層氯仿及中層變性蛋白;再取上層水溶液重復(fù)去蛋白操作,至無明顯中層為止;最后,收集去蛋白后的上層水溶液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法,其特征在于,所述Sevage試劑為體積比分別為(3-5)∶(0.5-1.5)的氯仿與正丁醇的混合液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法,其特征在于,所述步驟(2)中超濾裝置為濾膜截留分子量為1K的超濾裝置。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法,其特征在于,所述步驟(3)中不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的重均分子量Mw分別為:2000KDa、580KDa、70KDa、10KDa、5KDa。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法,其特征在于,所述步驟(3)中多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的計(jì)算方法為:根據(jù)各葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間和分子量對(duì)數(shù),以標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對(duì)數(shù)lgMw為縱坐標(biāo),色譜峰保留時(shí)間Rt為橫坐標(biāo),使用線性方程擬合得多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述的一種鑒別三種藥用石斛的色譜指紋圖譜方法,其特征在于,所述步驟(3)中色譜條件還包括:

色譜柱型號(hào)及裝柱方式:UltrahydrogelTM Linear 300mm×7.8mm,兩根串聯(lián);檢測器類型:示差折光檢測器RID。

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