本發(fā)明涉及食品檢測領域，尤其涉及一種用于同時檢測丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉的方法。

背景技術：

食品添加劑的使用在加工食品和方便食品中的應用已經(jīng)越來越廣泛。加工食品，如蠔油、醬油、魚露在制作過程中添加防腐劑以抑制微生物生成，維持營養(yǎng)價值和其他特性，進而延長食品保質(zhì)期。然而，非法添加和過量添加防腐劑會使消費者有過敏反應和慢性中毒風險。因此，《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》(GB 2760—2014)規(guī)定了所有防腐劑的最大允許添加濃度。

蠔油、醬油、魚露是人們餐桌上倍受歡迎的調(diào)味品。丙酸鈉(鈣)、雙乙酸鈉作為化學防腐劑，被廣泛應用于糕點、醬油等食品中。GB 2760—2014中規(guī)定，丙酸及其鈉鹽、鈣鹽在醬油中的最大允許使用量為2.5g/kg，而蠔油、魚露中不得使用；雙乙酸鈉在蠔油、醬油和魚露中的最大使用量均為2.5g/kg。食品中丙酸的檢測方法有氣相色譜法和高效液相色譜法等。雙乙酸鈉的檢測方法高效液相色譜法和離子色譜法等。林清河等、吳忠興等和項林敏等報道了高效液相色譜同時測定糕點中丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉的方法。向文娟等報道了全自動固相萃取(SPE)-HPLC法測定食品中的丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉。朱洪亮等報道了高效液相色譜同時測定食品中丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉的方法。李敏等報道了高效液相色譜法同時測定蒼山蒜米中雙乙酸鈉和丙酸鈣含量。2014年9月29日，我國收到了韓國通報的廈門某企業(yè)蠔油檢測出丙酸的不合格食品信息，我國食品安全國家標準GB2760也規(guī)定蠔油中不得使用丙酸，但有關蠔油等食品中丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉含量的檢測方法尚未見報道。

GB/T 5009.120—2003、GB/T 23382—2009及GB/T 23383—2009中有關丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉含量檢測的蒸餾法均是稱取25g樣品于500mL蒸餾瓶中，蒸餾至250mL容量瓶中，最終定容體積為250mL。該檢測方法需樣品量大，定容體積較大，且較為費時。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速、簡便、準確、實用的可同時用于檢測丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于同時檢測丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉的方法，其特征在于，包括以下步驟，

樣品處理：準確稱取待測樣品于凱氏定氮蒸餾裝置中，加入1～3mL0.5～3mol/L的磷酸溶液，進行水蒸氣蒸餾，蒸餾液經(jīng)過冷凝后，用比色管作為接收裝置，待蒸餾出23.5-24.5mL餾出液時停止接收，用0.5～3mol/L的磷酸溶液調(diào)餾出液的pH值至2.7-3.5，加水定容至25ml，搖勻；再經(jīng)0.22～0.45μm微孔濾膜過濾得到濾過液；調(diào)節(jié)餾出液的pH值為2.7-3.5，在此pH值范圍內(nèi)，丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉可完全轉(zhuǎn)化為丙酸和乙酸進行檢測；

HPLC：將上述所得濾過液進行HPLC；

檢測方法：根據(jù)丙酸的線性方程y1＝284.58x1+0.210，其中x1為丙酸的質(zhì)量濃度，y1為丙酸的峰面積；即可計算出樣品中丙酸的質(zhì)量濃度；

根據(jù)雙乙酸鈉的線性方程y2＝236.24x2+0.298，其中x2為雙乙酸鈉的質(zhì)量濃度，y2為雙乙酸鈉的峰面積；即可計算出樣品中雙乙酸鈉的質(zhì)量濃度。

進一步，所述樣品處理中，準確稱取待測樣品5.00g于凱氏定氮蒸餾裝置中。

進一步，所述HPLC的條件為，色譜柱：C18柱，250mm×4.6mm×5μm或等效色譜柱；柱溫：20～40℃；流動相為1.5g/L磷酸二氫銨溶液，溶劑為甲醇和水的混合液，用0.5～3mol/L磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.7～3.5；流速：0.5～2mL/min；進樣量：10～20μL。

進一步，所述HPLC步驟中，溶劑為體積比5:95～10:90的甲醇和水的混合液。

進一步，所述HPLC步驟中，溶劑為體積比10:90的甲醇和水的混合液。

進一步，所述待測樣品為蠔油、醬油或魚露。

本發(fā)明參考國標規(guī)定方法，以蠔油、醬油和魚露為基質(zhì)，首次采用凱氏定氮蒸餾裝置，利用高效液相色譜技術，建立了可同時檢測蠔油、醬油和魚露中丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉的方法，需用樣品量僅為5g，定容體積為25mL(樣品量大大減少，定容體積也大大減小。因為是水蒸氣蒸餾，定容體積減小意味著節(jié)約能量和時間)。該方法首次在丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉含量檢測中運用凱氏定氮蒸餾裝置，快速、簡便、準確、實用。

蠔油是一種風味獨特的調(diào)味品，它具有天然的海產(chǎn)品風味、鮮美濃郁的滋味，而且使用方便，營養(yǎng)豐富，富含Ca、Fe、Zn、Se等微量元素。醬油是人們生活中常用的調(diào)味品之一，而且它除了調(diào)味作用外，還具有抗氧化等營養(yǎng)保健作用。魚露富含多種氨基酸以及Cu、Cr、Zn、I等微量元素，不僅有獨特的海鮮風味，還有抗氧化、降血壓、降低膽固醇等功能特性。蠔油、醬油、魚露都是人們餐桌上倍受歡迎的調(diào)味品，而其中食品添加劑含量的檢測和監(jiān)控是保障食品安全的重要途徑。本發(fā)明首次結(jié)合凱氏定氮蒸餾裝置，建立了可同時檢測蠔油、醬油和魚露中丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉含量的高效液相色譜法。

本研究以蠔油、醬油和魚露為基質(zhì)，參考國標規(guī)定方法，并結(jié)合本實驗室對分析方法的驗證經(jīng)驗，方法學驗證指標包括流動相的確定、目標物蒸餾體積的確定、線性方程、定量限、準確度和精密度。本發(fā)明比較了不同的流動相，最終選定甲醇-水(10/90，v/v)作為溶劑流動相，雙乙酸鈉和丙酸鈉出峰時間分別為4.91和10.18min，基線平穩(wěn)，峰型和出峰時間穩(wěn)定；同時，比較了四種餾出液體積，最終確定餾出液體積為25mL，丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉的回收率可分別達到100.3％和98.2％。本方法的檢出限為0.010g/kg，定量限為0.025g/kg；在三種基質(zhì)中，丙酸鈉(鈣)(以丙酸計)和雙乙酸鈉的回收率分別為88.5％～108.3％和86.5％～108.7％，相對標準偏差為2.13％～6.42％和2.02％～6.37％，均能滿足丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉的檢測需要。

綜上所述，本方法極大節(jié)約了樣本處理時間，基質(zhì)干擾少，操作簡便；方法的線性關系良好、回收率高、定量限低、重復性好；實用性強，可同時適用于蠔油、醬油和魚露等食品中丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉含量的測定。

附圖說明

圖1是實施例2中丙酸和雙乙酸鈉標準品色譜圖。

圖2是實施例3中丙酸、雙乙酸鈉餾出液體積與回收率圖。

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

以下實施例所用儀器：Agilent 1260液相色譜儀，配有DAD檢測器；德國賽多利斯電子天平，感量0.1mg和0.01g；凱氏定氮蒸餾裝置。

以下實施例中的丙酸鈉可以被丙酸鈣替代。

方法：

樣品處理：準確稱取試樣于凱氏定氮蒸餾裝置中，加入1mL 1mol/L的磷酸溶液，進行水蒸氣蒸餾，蒸餾液經(jīng)過冷凝后，用25mL比色管作為接收裝置，待蒸餾出約24mL時停止接收，用1mol/L的磷酸溶液調(diào)pH值至2.7-3.5左右，加水定容至25ml，搖勻。經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，供HPLC測定。

HPLC：色譜柱：Sapphire C18(250mm×4.6mm×5μm)，柱溫：30℃；流動相為1.5g/L磷酸二氫銨溶液(溶劑為甲醇-水的混合液)，用1mol/L磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.7～3.5；流速：1mL/min；進樣量：10μL。

實施例1：標準混合溶液配制

丙酸鈉標準儲備液的制備：準確稱取1.3g(精確至0.0001g)丙酸鈉，用水定容至100mL，配制成相當于含10mg/mL丙酸的丙酸鈉標準儲備液。

雙乙酸鈉標準儲備液的制備：準確稱取1.0g(精確至0.0001g)雙乙酸鈉，用水定容至100mL，配制成10mg/mL的雙乙酸鈉標準儲備液。

依次吸取0.0125、0.05、0.125、0.5、1.25、2.5mL丙酸鈉及雙乙酸鈉標準儲備液于凱氏定氮蒸餾裝置，加入1mol/L的磷酸溶液1mL，蒸餾出約24mL時，用1mol/L的磷酸溶液調(diào)pH值至3左右，定容至25mL。得到丙酸鈉(相當于丙酸)、雙乙酸鈉的混合工作液濃度分別為0.005、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0mg/mL。經(jīng)過0.22μm微孔濾膜過濾，濃度由低到高進樣，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。得到：丙酸的線性方程為y＝284.58x+0.210，雙乙酸鈉的線性方程為y＝236.24x+0.298。線性方程的線性相關系數(shù)均為0.9999。

實施例2：流動相的確定

HPLC條件：

色譜柱：Sapphire C18(250mm×4.6mm×5μm)，柱溫：30℃；流動相為1.5g/L磷酸二氫銨溶液(溶劑為以下三種溶劑)，用1mol/L磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.7～3.5；流速：1mL/min；進樣量：10μL。所述三種溶劑是：水、甲醇-水(10/90，v/v)、甲醇-水(15/85，v/v)。

稱取1.5g磷酸氫二銨分別于1L上述三種溶劑中，用1mol/L磷酸溶液調(diào)節(jié)至pH值至2.7～3.5。分別用這三種流動相來分離丙酸和雙乙酸鈉。

試驗結(jié)果表明：使用純水做流動相，對色譜柱的傷害較大，丙酸的出峰時間較晚，且峰比較寬。使用甲醇-水(15/85，v/v)作為流動相，雙乙酸鈉的峰出峰時間過早，受基質(zhì)干擾較大，且由于選用214nm波長作為檢測波長，有機相比例過高后基線不平。使用甲醇-水(10/90，v/v)作為溶劑的流動相，結(jié)果如圖1所示，雙乙酸鈉和丙酸鈉出峰時間分別為4.91和10.18min?；€平穩(wěn)，峰型和出峰時間穩(wěn)定。

實施例3：目標物餾出液體積的確定

取市售蠔油空白試樣5.00g，其中丙酸及雙乙酸鈉加標的濃度均為1.0g/kg，空白試樣中的丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉，經(jīng)磷酸酸化轉(zhuǎn)化成丙酸和乙酸，再經(jīng)過水蒸氣蒸餾，冷凝管冷卻后，用比色管接收餾出液。本實驗對餾出液體積進行了優(yōu)化：每個蒸餾體積均平行6組試驗，見圖2。由圖2可知，丙酸及雙乙酸鈉的回收率隨著餾出液體積的增加而增大，餾出液體積為10mL時，丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉的平均回收率僅有50.2％(RSD＝3.2％，n＝6)和52.1％(RSD＝4.3％，n＝6)；餾出液體積為15mL時，丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉的平均回收率僅有74.3％(RSD＝2.5％，n＝6)和71.9％(RSD＝4.1％，n＝6)；餾出液體積為20mL時，丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉的平均回收率為92.1％(RSD＝4.1％，n＝6)和94.5％(RSD＝3.1％，n＝6)；當餾出液體積達到25mL時，丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉的回收率平均分別為100.3％(RSD＝2.0％，n＝6)和98.2％(RSD＝2.5％，n＝6)。因此，選取蒸餾體積為25mL為最終定容體積。

實施例4：方法的線性回歸方程及定量限

取丙酸鈉(鈣)(以丙酸計)、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度0.005、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0mg/mL的6個混合標準溶液，按照濃度由低到高依次進樣，以各自的質(zhì)量濃度為橫坐標(g/mL)，峰面積為縱坐標，得到線性回歸方程，丙酸的線性方程為y＝284.58x+0.210，雙乙酸鈉的線性方程為y＝236.24x+0.298。線性方程的線性相關系數(shù)均為0.9999，丙酸鈉(鈣)(以丙酸計)、雙乙酸鈉在0.005～1.000mg/mL的線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。以3倍信噪比(S/N＝3)對應的目標物濃度為檢出限，以10倍信噪比(S/N＝10)對應的目標物濃度作為定量限，獲得兩種物質(zhì)的儀器檢出限均為0.002mg/mL，儀器定量限均為0.005mg/mL。儀器的檢出限和定量限，再乘以定容體積(25mL)，除以樣品質(zhì)量(5.00g)，得到方法的可能檢出限為0.010g/kg，可能定量限為0.025g/kg。取陰性樣品(即不含有丙酸鈉和雙乙酸鈉的樣品)，加入丙酸鈉和雙乙酸鈉，使樣品中丙酸鈉(以丙酸計)和雙乙酸鈉的濃度為0.010g/kg，按照實驗方法處理樣品，測得目標物信號的信噪比大于3。取陰性樣品(即不含有丙酸鈉和雙乙酸鈉的樣品)，加入丙酸鈉和雙乙酸鈉，使樣品中丙酸鈉(以丙酸計)和雙乙酸鈉的濃度為0.025g/kg，按照1.4實驗方法處理樣品，測得目標物信號的信噪比大于10。從而確定方法的檢出限為0.010g/kg，定量限為0.025g/kg。

本實驗建立方法與國標方法(GB/T 23382-2009和GB/T 23383-2009)對比如表1所示。本實驗建立方法，可同時檢測丙酸和雙乙酸鈉兩個項目，而GB/T 23382-2009和GB/T 23383-2009只可分別單獨檢測丙酸和雙乙酸鈉項目。本檢測方法需要樣品量僅為5.00g，最終定容體積為25mL，與國標檢測方法相比，所需樣品量減少且定容體積減?。煌瑫r，單個樣品水蒸氣耗費時間也縮短至僅需10min。本檢測方法的回收率能與國標方法保持一致，均在86.5％以上；方法定量限方面，丙酸由0.10g/kg精確至0.025g/kg，雙乙酸鈉由0.05g/kg精確至0.025g/kg。

表1 本實驗建立方法與國標方法比對表

實施例5：方法的準確度和精密度

分別對蠔油、醬油及魚露等進行添加回收試驗，其中蠔油為陽性樣品，丙酸的檢出量為0.132g/kg，其余兩種為陰性樣品。按照優(yōu)化的色譜條件、本方法的蒸餾方法進行加標回收試驗。加標濃度選取3個濃度：最低濃度選取定量限附近濃度0.030g/kg；第二個濃度選取最大允許使用量濃度2.5g/kg；第三個濃度為線性范圍外濃度6.0g/kg(定容后的蒸餾溶液稀釋一倍后用儀器檢測)。稱取100g樣品3份，分別加入3.9mg丙酸鈉和3.0mg雙乙酸鈉、324.3mg丙酸鈉和250.0mg雙乙酸鈉以及778.4mg丙酸鈉和600.0mg雙乙酸鈉，充分溶解，使樣品中丙酸和雙乙酸鈉的加標濃度為0.030g/kg、2.5g/kg和6.0g/kg。分別準確稱取加標試樣5.00g(精確到0.01g)于凱氏定氮蒸餾裝置中，按照1.4實驗方法處理測定，每個濃度重復六次平行實驗，準確度和精密度結(jié)果見表2。由表2可知，三種基質(zhì)中，丙酸鈉(鈣)(以丙酸計)和雙乙酸鈉的回收率分別為88.5％～108.3％和86.5％～108.7％，相對標準偏差為2.13％～6.42％和2.02％～6.37％。本方法的回收率高，精密度好，能夠滿足丙酸鈉(鈣)和雙乙酸鈉的檢測需要。

表2 丙酸鈉(鈣)(以丙酸計)、雙乙酸鈉回收率及相對標準偏差(RSD)(n＝6)表

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。