本發(fā)明涉及藥物殘留檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種動(dòng)物肌肉組織中頭孢菌素類(lèi)藥物殘留快速篩查方法。

背景技術(shù)：

自上世紀(jì)50年代頭孢菌素C被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，頭孢菌素類(lèi)藥物就成為了一類(lèi)被頻繁使用的抗生素。近年來(lái)，在日常生活中常用的頭孢類(lèi)抗生素已經(jīng)有40多種。該類(lèi)藥物具有抗菌譜廣的特點(diǎn)，常用于治療細(xì)菌性感染類(lèi)疾病。頭孢類(lèi)藥物在食源性動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中，也常用于治療和預(yù)防動(dòng)物感染類(lèi)疾病，但使用頭孢類(lèi)藥物可能帶來(lái)的過(guò)敏反應(yīng)和腎臟毒性不容忽視。當(dāng)前已經(jīng)有非常多關(guān)于服用該類(lèi)藥物所帶來(lái)的過(guò)敏反應(yīng)和腎臟毒性的報(bào)道。自從上世紀(jì)八十年代起就有大量關(guān)于頭孢類(lèi)藥物對(duì)腎臟毒性的研究，ZHANG Zhi-lin等對(duì)于頭孢曲松和頭孢孟多的腎毒性做了研究，并發(fā)表論文指出其可能帶來(lái)的腎臟損傷。而對(duì)于頭孢類(lèi)藥物的過(guò)敏反應(yīng)，HAI Mei等對(duì)頭孢類(lèi)藥物皮試反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，指出應(yīng)預(yù)防頭孢類(lèi)藥物的過(guò)敏反應(yīng)并將其作為關(guān)注重點(diǎn)。此外，頭孢類(lèi)抗生素長(zhǎng)期在醫(yī)藥領(lǐng)域和動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中的過(guò)度使用還可能引發(fā)超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生。

盡管近年來(lái)因動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中抗生素濫用而引發(fā)的食品安全問(wèn)題已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，但部分國(guó)家依然沒(méi)有關(guān)于治療和預(yù)防食源性動(dòng)物疾病的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于消費(fèi)者而言，長(zhǎng)期食用含頭孢菌素類(lèi)藥物殘留的食品可能打亂人體腸道菌群的平衡，引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，還會(huì)增加人體感染抗藥性細(xì)菌的風(fēng)險(xiǎn)。于此，歐盟對(duì)八種頭孢菌素類(lèi)藥物在食品中的最大殘留限量MRLs作了規(guī)定，美國(guó)食品藥監(jiān)局頒布相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了兩種頭孢類(lèi)藥物的最大殘留限量，聲明除了具有最大殘留限量的幾種頭孢類(lèi)藥物之外，其余頭孢類(lèi)藥物在食品中均不得檢出。此外，頭孢類(lèi)藥物可在體內(nèi)發(fā)生代謝，如頭孢匹林和頭孢噻可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為去乙酰頭孢匹林和去乙酰頭孢噻肟，同樣具有抗菌活性的代謝物會(huì)在體內(nèi)蓄積。因此，有必要建立一種包含代謝物在內(nèi)的頭孢菌素類(lèi)藥物高通量篩查方法。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，關(guān)于頭孢類(lèi)藥物的篩查方法很少。傳統(tǒng)的頭孢菌素類(lèi)藥物檢測(cè)方法靈敏度低，選擇性較差，且無(wú)法達(dá)到高通量篩查的目的，例如液相色譜-紫外法。當(dāng)前液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是食品中的獸藥殘留分析中應(yīng)用作為廣泛的檢測(cè)方法。Karageorgou等建立了8種頭孢類(lèi)藥物和10種喹諾酮類(lèi)藥物的LC-MS/MS檢測(cè)方法。Han等建立了蜂蜜中的38種抗生素篩查方法，包括7種頭孢菌素在內(nèi)。我們研究小組已經(jīng)建立了豬肉中22種頭孢類(lèi)藥物殘留的LC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)，但該方法無(wú)法檢測(cè)油脂含量較高的牛肉和羊肉等樣品。此外，LC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)雖然提高了方法靈敏度和選擇性，但仍存在分辨率低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的缺點(diǎn)，因此目前為止的頭孢菌素類(lèi)藥物殘留檢測(cè)方法均無(wú)法達(dá)到對(duì)頭孢類(lèi)藥物的高通量篩查目的，為人類(lèi)健康帶來(lái)了一定的隱患。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種動(dòng)物肌肉組織中頭孢菌素類(lèi)藥物殘留快速篩查方法，其耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，具有分辨率高、高靈敏度及高通量的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)動(dòng)物肌肉組織中44種頭孢菌素類(lèi)藥物殘留的篩查。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：一種動(dòng)物肌肉組織中頭孢菌素類(lèi)藥物殘留快速篩查方法，其包括以下步驟：

樣品處理及檢測(cè)分析

(1)提取，將待測(cè)樣品攪碎置于離心管中，加入提取溶劑，渦旋混合后，經(jīng)超聲提取，并經(jīng)離心后取上層清液；

(2)凈化，離心后的上層清液過(guò)固相萃取柱，收集流出液，流盡后向固相萃取柱中加入洗脫液洗脫，收集流出的洗脫液，合并收集的流出液和洗脫液，經(jīng)氮吹濃縮，加乙睛定容，并過(guò)濾膜，取過(guò)濾后的液體進(jìn)樣至超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中檢測(cè)分析；

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

將多種頭孢菌素類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品分別置于容量瓶中，加溶解劑溶解并定容，配制成單標(biāo)儲(chǔ)備液；移取相同體積的各單標(biāo)儲(chǔ)備液進(jìn)行混合，并定容，再加入乙睛逐級(jí)稀釋，配制成多種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，注入超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中測(cè)定，得到各頭孢菌素類(lèi)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

測(cè)定樣品中頭孢菌素類(lèi)化合物的濃度

將樣品處理及檢測(cè)分析過(guò)程中獲得的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中頭孢菌素類(lèi)化合物的濃度。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

進(jìn)一步，所述提取溶劑為乙睛與水的混合液，所述混合液中乙睛與水的體積比為2-5:1。

進(jìn)一步，所述混合液中乙睛與水的體積比為4:1。

進(jìn)一步，所述混合液添加量滿足每克樣品中加入混合液的體積為1-3ml。

進(jìn)一步，所述固相萃取柱為Oasis PRiME HLB固相萃取柱。

進(jìn)一步，所述洗脫液的有機(jī)相為乙腈，水相中含0.1％的甲酸，乙睛與含0.1％甲酸的水的體積比為4-6:1。

進(jìn)一步，乙睛與含0.1％甲酸的水的體積比為5:1。

進(jìn)一步，所述超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中采用的色譜柱為SUPELCO Ascentis C8色譜柱。

進(jìn)一步，所述色譜柱的柱溫為20-40℃。

進(jìn)一步，所述溶解劑為甲醇和水的混合液，甲醇與水的體積比為0.5-1:1。

進(jìn)一步，所述溶解劑為乙睛和水的混合液，乙睛與水的體積比為3-5:1。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：1、本發(fā)明利用超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，成功建立了一套動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類(lèi)藥物殘留篩查技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)動(dòng)物肌肉組織中44種頭孢菌素類(lèi)藥物殘留的篩查；2、該方法耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，具有高分辨率、高靈敏度及高通量的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為頭孢地尼和頭孢唑肟在不同色譜柱下的色譜圖；

圖2為五種流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離的色譜圖；

圖3為不同提取溶劑下頭孢菌素類(lèi)化合物的回收率的對(duì)比圖；

圖4為三種洗脫液下同一樣品的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)比圖；

圖5為四種肌肉樣品的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)比圖；

圖6為頭孢菌素類(lèi)化合物的提取離子流圖；

圖7為陽(yáng)性樣品提取離子流圖；

圖8為陽(yáng)性樣品二級(jí)質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。

實(shí)施例一

本實(shí)施例提供的動(dòng)物肌肉組織中頭孢菌素類(lèi)藥物殘留快速篩查方法，其包括以下步驟：

樣品處理及檢測(cè)分析

(1)提取，將待測(cè)樣品攪碎置于離心管中，加入提取溶劑，渦旋混合后，經(jīng)超聲提取，并經(jīng)離心后取上層清液；

(2)凈化，離心后的上層清液過(guò)固相萃取柱，收集流出液，流盡后向固相萃取柱中加入洗脫液洗脫，收集流出的洗脫液，合并收集的流出液和洗脫液，經(jīng)氮吹濃縮，加乙睛定容，并過(guò)濾膜，取過(guò)濾后的液體進(jìn)樣至超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中檢測(cè)分析；

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

將多種頭孢菌素類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品分別置于容量瓶中，加溶解劑溶解并定容，配制成單標(biāo)儲(chǔ)備液；移取相同體積的各單標(biāo)儲(chǔ)備液進(jìn)行混合，并定容，再加入乙睛逐級(jí)稀釋，配制成多種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，注入超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中測(cè)定，得到各頭孢菌素類(lèi)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

測(cè)定樣品中頭孢菌素類(lèi)化合物的濃度

將樣品處理及檢測(cè)分析過(guò)程中的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中頭孢菌素類(lèi)化合物的濃度。

本實(shí)施例利用44種頭孢菌素類(lèi)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品建立了各頭孢菌素類(lèi)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該44種頭孢菌素類(lèi)化合物具體為：頭孢乙腈、頭孢特侖酯、頭孢卡品酯、頭孢唑蘭、頭孢西酮、頭孢米諾、頭孢噻肟、頭孢他美酯、頭孢他啶、頭孢洛寧、頭孢地尼、頭孢地嗪、頭孢硫脒、去乙酰頭孢匹林、去乙酰頭孢噻肟、頭孢孟多酯鈉、頭孢丙烯、頭孢羥氨芐、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢匹林、頭孢克洛、頭孢噻吩、頭孢西丁、頭孢雷特、頭孢匹胺、頭孢泊肟酯、頭孢妥侖匹酯、頭孢甲肟、頭孢尼西、頭孢孟多、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢替安、頭孢唑肟、頭孢克肟、頭孢替坦、頭孢美唑、頭孢哌酮、頭孢噻呋、頭孢喹肟、頭孢匹羅。

根據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟，分別將上述各種頭孢菌素類(lèi)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品分別置于各容量瓶中，加溶解劑溶解并定容，配制成單標(biāo)儲(chǔ)備液，于-40℃貯存。并移取相同體積的各單標(biāo)儲(chǔ)備液于容量瓶中進(jìn)行混合，并定容，配制成一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，于-40℃貯存。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需每周配制一次，混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液再加入乙腈逐級(jí)稀釋，配制成一系列濃度的工作液，注入超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中測(cè)定，得到各頭孢菌素類(lèi)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

其中的溶解劑可為甲醇與水的混合液或者乙睛和水的混合液，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品為頭孢克洛、頭孢唑肟和頭孢雷特時(shí)，以體積比為0.5-1:1的甲醇與水的混合液作為溶解劑，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品為其他41種頭孢菌素類(lèi)化合物時(shí)，則以體積比為3-5:1的乙腈與水的混合液作為溶解劑。優(yōu)選地，甲醇與水的體積比為1:1，乙腈與水的體積比為4:1。具體地，本實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液及混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制如下：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取頭孢標(biāo)準(zhǔn)品0.01g(精確至0.0001g),頭孢克洛、頭孢唑肟、頭孢雷特以甲醇:水＝1：1(v/v)溶液定容至100mL，其余頭孢標(biāo)準(zhǔn)品均以乙腈:水＝4：1(v/v)溶液定容至100mL，配制成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-40℃貯存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.1mL于容量瓶中，定容至10mL，配制成1mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，-40℃貯存，實(shí)驗(yàn)中每周配制一次，混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液使用乙腈逐級(jí)稀釋，配制成系列工作液。

在樣品的處理過(guò)程中，精確稱取一定質(zhì)量的待檢測(cè)的樣品，如動(dòng)物肌肉組織，攪碎置于離心管中，加入提取溶劑，渦旋混合一定時(shí)間后，經(jīng)超聲提取一定時(shí)間，并離心后取上清液再過(guò)固相萃取柱，收集流出液，流盡后向固相萃取柱中加入洗脫液洗脫，收集流出的洗脫液，合并收集的流出液和洗脫液，經(jīng)氮吹濃縮，并加乙腈定容，并經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾，取過(guò)濾后的液體進(jìn)樣至超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中檢測(cè)分析，得到相應(yīng)的檢測(cè)數(shù)據(jù)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷樣品中含有的頭孢菌素類(lèi)化合物的種類(lèi)及含量。

實(shí)施例二

為提高本實(shí)施例提供的篩查方法的檢測(cè)全面性和準(zhǔn)確率，本實(shí)施例分別對(duì)不同的樣品處理方法進(jìn)行了對(duì)比分析，并對(duì)超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的不同實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了對(duì)比分析，優(yōu)化本實(shí)施例提供的篩查方法，從而可建立一種全面篩選上述頭孢菌素類(lèi)化合物的方法。

為了得到最好的分離效果，本實(shí)施例分別對(duì)比研究了五種色譜柱、五種流動(dòng)相對(duì)頭孢菌素類(lèi)化合物的分離效果，具體過(guò)程如下。

五種色譜柱分別為Waters ACQUITY UPLCBEH Shield RP18(1.7μm，2.1×100mm)，Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC(1.7μm，2.1×100mm)，phenomenex Kinetex F5 100A(2.6μm，3×100mm)，Waters ACQUITY UPLC BEH C8(1.7μm，2.1×150mm)和SUPELCO Ascentis C8(10cm×4.6mm，3μm)。分別取相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用上述五種色譜柱分別進(jìn)行超高效液相色譜實(shí)驗(yàn)，如圖1所示，示例性地給出了頭孢地尼和頭孢唑肟在不同色譜柱下的色譜圖。

如圖1所示，圖1中橫坐標(biāo)為離子生成時(shí)間，以分表示，縱坐標(biāo)為離子相對(duì)豐度，以百分比表示。其中的a為phenomenex Kinetex F5 100A色譜柱，b為Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱，c為SUPELCO Ascentis C8色譜柱，d為Waters ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱，e為Waters ACQUITY UPLCBEH Shield RP18色譜柱。圖1中，使用Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱分離目標(biāo)物時(shí)，色譜峰展寬較為嚴(yán)重，會(huì)影響定量的準(zhǔn)確性；使用phenomenex Kinetex F5 100A色譜柱對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離時(shí)，檢測(cè)結(jié)果章出現(xiàn)了兩個(gè)目標(biāo)峰，這可能是由于目標(biāo)物在色譜柱中發(fā)生了分解；使用Waters ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱和Waters ACQUITY UPLCBEH Shield RP18色譜柱時(shí)也出現(xiàn)了同樣的情況；而SUPELCO Ascentis C8色譜柱是最適用于目標(biāo)物分離的色譜柱，對(duì)于頭孢類(lèi)物質(zhì)色譜峰形的改善、峰寬減小等有很大的幫助。因此，由圖1及上述分析可知，SUPELCO Ascentis C8色譜柱更適用于頭孢菌素類(lèi)化合物的分離，因此，本實(shí)施例優(yōu)選地，色譜柱選用SUPELCO Ascentis C8。

再對(duì)比五種流動(dòng)相對(duì)相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物分離的影響，其中的五種流動(dòng)相分別為：其中B相均為乙腈，A相分別為水、甲酸水、乙酸水、甲酸銨溶液和乙酸銨溶液，利用五種流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離的色譜圖如圖2所示。

如圖2所示，圖2中橫坐標(biāo)為離子生成時(shí)間，以分表示，縱坐標(biāo)為離子相對(duì)豐度，以百分比表示。其中a為由0.1％甲酸水和乙腈組成的流動(dòng)相，b為由0.1％乙酸水和乙腈組成的流動(dòng)相，c為由3mM乙酸銨溶液和乙腈組成的流動(dòng)相，d為由3mM甲酸銨溶液和乙腈組成的流動(dòng)相，d為水和乙腈組成的流動(dòng)相。由圖2可知，在使用0.1％甲酸水和乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰形的改善是十分明顯的，這是由于流動(dòng)相中的甲酸與頭孢類(lèi)物質(zhì)中的氨基和羧基產(chǎn)生了積極的相互作用，促進(jìn)了電離過(guò)程。相反的，純水-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)的分析結(jié)果最差。因此，本實(shí)施例優(yōu)選地，采用0.1％甲酸水和乙腈作為流動(dòng)相。

另外，為考察不同提取溶劑對(duì)樣品中頭孢菌素類(lèi)化合物的提取效果的影響，本實(shí)施例針對(duì)七種不同的提取溶劑對(duì)頭孢菌素類(lèi)化合物的提取效果做了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中，選用的七種提取溶劑分別為乙腈，乙腈-水(6:1；v/v)，乙腈-水(5:1；v/v)，乙腈-水(4:1；v/v)，乙腈-水(2:1；v/v)，乙腈-水(1:2；v/v)。

空白肌肉樣品采樣于養(yǎng)殖場(chǎng)，經(jīng)用Q-Orbitrap超高分辨質(zhì)譜分析系統(tǒng)篩查不含頭孢菌素類(lèi)化合物，稱取取5.0±0.05g空白樣品于50mL離心管中，以每千克空白樣品中加入500μg的一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液為標(biāo)準(zhǔn)，向稱取的空白樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，對(duì)應(yīng)地，在5.0±0.05g空白樣品中加入0.5μg的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，并向加標(biāo)后的樣品中加入10mL提取溶劑，渦旋30s，超聲提取30min，于8000轉(zhuǎn)離心10分鐘后，過(guò)0.22μm濾膜，上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)頭孢菌素類(lèi)化合物的回收率判斷提取溶劑對(duì)頭孢菌素類(lèi)化合物的提取效果的影響，如圖3所示，以滿足回收率在60％-120％內(nèi)的頭孢類(lèi)物質(zhì)的個(gè)數(shù)為指標(biāo)，圖3給出了不同提取溶劑對(duì)頭孢菌素(頭孢菌素類(lèi)化合物)的回收率的影響。

如圖3所示，當(dāng)提取溶劑為乙腈-水(4:1；v/v)時(shí)得到最好檢測(cè)結(jié)果。高比例有機(jī)溶劑會(huì)導(dǎo)致水溶性頭孢菌素的回收率較差，且可能更多的將脂肪等物質(zhì)溶解在提取液里，導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)過(guò)大。而提取液中水的比例過(guò)高時(shí)，肌肉組織中的油脂類(lèi)物質(zhì)則在樣品上形成保護(hù)，阻礙了目標(biāo)物的提取。此外，水比例過(guò)高還會(huì)導(dǎo)致肌肉組織中的血液等物質(zhì)聚集在提取液中，增加檢測(cè)難度。因此，本實(shí)施例優(yōu)選地，選用乙腈與水的混合液作為提取溶劑，混合液中乙腈與水的體積比為3-5:1，每克樣品中加入乙睛-水的混合液的體積為1-3ml，進(jìn)一步優(yōu)選地，乙腈與水的體積比為4:1，每克樣品中加入乙睛-水的混合液為2ml。

再者，因肉類(lèi)樣品中除了含有較高的脂肪含量外，磷脂類(lèi)物質(zhì)也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，前處理過(guò)程中樣品凈化對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性而言十分重要。因此，本實(shí)施例利用SPE固相萃取凈化處理方法，對(duì)比八種不同填料的固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，以確定不同固相萃取柱對(duì)頭孢菌素類(lèi)化合物的回收率的影響。

其中的八種不同填料的固相萃取柱分別為Oasis HLB，Oasis MAX，Oasis MCX，Oasis PRiME HLB，NH2，C18，SLE和C8八種不同填料的SPE固相萃取小柱做了比較。具體處理過(guò)程如下。

稱取5.0±0.05g樣品于50mL離心管中，加入0.5μg的一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入10mL乙腈/水溶液，渦旋混合30s，超聲提取30min，8000轉(zhuǎn)離心10min，取2ml上清液做SPE固相萃取凈化處理。

利用Oasis PRiME HLB及SLE兩種填料的固相萃取小柱進(jìn)行凈化處理的過(guò)程均為：取2mL上清液上柱，再以乙腈水溶液洗脫，收集兩次洗脫液，將洗脫液氮吹濃縮，以乙腈-水溶液(1:4；v/v)定容至1mL，過(guò)0.22μm微孔濾膜，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算經(jīng)Oasis PRiME HLB及SLE兩種固相萃取小柱凈化處理后的加標(biāo)樣品中頭孢菌素類(lèi)化合物的回收率。

利用Oasis HLB、NH2、C18、C8四種固相萃取小柱進(jìn)行凈化處理的過(guò)程均為：取2ml上清液氮吹除乙腈，再以磷酸二氫鈉緩沖液定容，取2mL加入緩沖液后的提取液上柱，正己烷凈化，再以乙腈洗脫，收集洗脫液，將洗脫液氮吹濃縮，以乙腈水溶液(1:4；v/v)定容至1mL，過(guò)0.22μm微孔濾膜，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算經(jīng)Oasis HLB、NH2、C18、C8四種固相萃取小柱凈化處理后的加標(biāo)樣品中頭孢菌素類(lèi)化合物的回收率。

利用Oasis MAX及Oasis MCX固相萃取小柱進(jìn)行凈化處理的過(guò)程均為：取2ml上清液氮吹除乙腈，再以磷酸二氫鈉緩沖液定容。取2mL加入緩沖液后的提取液上柱，洗脫時(shí)Oasis MAX固相萃取柱使用含2％甲酸的乙腈洗脫，Oasis MCX使用含5％氨水的乙腈洗脫，分別收集洗脫液，將洗脫液氮吹濃縮，以乙腈-水溶液(1:4；v/v)定容至1mL，過(guò)0.22μm微孔濾膜，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算經(jīng)Oasis MAX及Oasis MCX兩種固相萃取小柱凈化處理后的加標(biāo)樣品中頭孢菌素類(lèi)化合物的回收率。

經(jīng)上述八種固相萃取柱的凈化處理后的加標(biāo)樣品中各頭孢菌素類(lèi)化合物的回收率如表1所示。

表1凈化優(yōu)化過(guò)程中不同填料SPE小柱對(duì)回收率的影響

由表1可知，不同填料的凈化過(guò)程對(duì)44種頭孢類(lèi)藥物回收率有很大的影響。Oasis HLB柱凈化后的回收率為0.00％-275.07％，Oasis MAX柱凈化后的回收率為0.00％-368.12％，Oasis MCX柱凈化后的回收率為0.00％-765.17％，NH2柱凈化后的回收率為0.00％-402.98％，SLE柱凈化后的回收率為4.07％-414.31％，C18柱凈化后的回收率為0.00％-385.77％，C8柱凈化后的回收率為0.00％-381.27％，Oasis PRiME HLB柱凈化后的效果最好，回收率為68.59％-128.01％，因此，本實(shí)施例優(yōu)選Oasis PRiME HLB柱作為固相萃取柱。

最后，本實(shí)施例對(duì)比分析了不同洗脫液對(duì)同一樣品的基質(zhì)效應(yīng)的影響，對(duì)比了乙腈，乙腈-水(5:1；v/v)和乙腈-含0.1％甲酸的水(5:1；v/v)溶液對(duì)樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響，基質(zhì)效應(yīng)分析的具體過(guò)程為：取一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入提取溶劑，并進(jìn)樣至超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中測(cè)試，液相條件中的洗脫液分別為上述三種，得到各個(gè)頭孢菌素類(lèi)化合物對(duì)應(yīng)的峰面積A；取相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白樣品中，加入相同量的提取溶劑，并進(jìn)樣至超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中測(cè)試，采用相同的洗脫液，得到各個(gè)頭孢菌素類(lèi)化合物對(duì)應(yīng)的峰面積B?；|(zhì)效應(yīng)即為峰面積B與峰面積A的比值，以百分比表示，由此得到三種提取溶劑下的基質(zhì)效應(yīng)，如圖4所示。

由圖4中可以看出，乙腈-含0.1％甲酸的水(5:1；v/v)溶液更適用于做洗脫液。這可能是由于甲酸改變了洗脫液的酸堿度，能使樣品中的磷脂等雜質(zhì)被吸附在Oasis PRiME HLB固相萃取柱上，而對(duì)頭孢菌素類(lèi)化合物則沒(méi)有保留。因此，本實(shí)施例中的洗脫液為乙睛與含0.1％甲酸的水，其體積比為4-6:1，優(yōu)選地，乙睛與含0.1％甲酸的水的體積比為5:1。

經(jīng)過(guò)上述對(duì)色譜柱、流動(dòng)相、提取溶劑、固相萃取柱及洗脫液的優(yōu)化分析，獲得優(yōu)化后的最優(yōu)的樣品前處理過(guò)程及超高效液相色譜條件。優(yōu)化后的樣品前處理過(guò)程的其中一個(gè)實(shí)施方式如下：稱取5.0±0.05g樣品于50mL離心管中，取10mL乙腈-水(4:1；v/v)溶液為提取溶劑，從攪碎的樣品中提取目標(biāo)物，離心后取2mL上清液過(guò)PRiME HLB固相萃取柱，流盡后加入2mL乙腈-含0.1％甲酸的水(5:1；v/v)溶液，收集兩次流出液，氮吹至小于1mL，取乙腈定容至1mL，過(guò)0.2μm微孔濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

在利用超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí)，其質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)可能會(huì)被基質(zhì)效應(yīng)所影響，軟電離過(guò)程中的質(zhì)譜響應(yīng)可能會(huì)因?yàn)榛|(zhì)效應(yīng)而增強(qiáng)或者減弱。因此，本實(shí)施例比較了雞肉、豬肉、牛肉、羊肉四種樣品的基質(zhì)效應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，基質(zhì)效應(yīng)分析的具體過(guò)程為：取一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入一定量的乙腈-水(4:1；v/v)提取溶劑，并進(jìn)樣至超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中測(cè)試，得到各個(gè)頭孢菌素類(lèi)化合物對(duì)應(yīng)的峰面積A；取相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白樣品中，加入相同量的乙睛-水(4:1；v/v)提取溶劑，并進(jìn)樣至超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中測(cè)試，得到各個(gè)頭孢菌素類(lèi)化合物對(duì)應(yīng)的峰面積B。基質(zhì)效應(yīng)即為峰面積B與峰面積A的比值，以百分比表示，由此得到的四種樣品的基質(zhì)效應(yīng)如圖5所示。

由圖5可以看出，四種肉類(lèi)的基質(zhì)效應(yīng)并沒(méi)有明顯的區(qū)別，因此，實(shí)驗(yàn)時(shí)以一種肉為空白基質(zhì)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。四種肉類(lèi)空白樣品中分別加入50μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)前處理后，分別對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察，每種樣品做5份平行實(shí)驗(yàn)，取5次平行測(cè)定的平均結(jié)果，計(jì)算頭孢菌素類(lèi)化合物的回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出，經(jīng)前處理后的四種肉類(lèi)基質(zhì)效應(yīng)較小，該法可滿足雞肉，豬肉，牛肉和羊肉中頭孢類(lèi)藥物殘留的日常檢測(cè)需求。

表2使用相同標(biāo)準(zhǔn)曲線定量后的回收率(％)和精密度RSD考察表

實(shí)施例三

基于實(shí)施例二提供的優(yōu)化條件，本實(shí)施例提供了動(dòng)物肌肉組織中頭孢菌素類(lèi)藥物殘留快速篩查方法的優(yōu)選實(shí)施方式，以豬肉樣本為例，驗(yàn)證本實(shí)施例提供的檢測(cè)方法的可靠性。

優(yōu)化后的樣品前處理過(guò)程如下：稱取5.0±0.05g樣品于50mL離心管中，取10mL乙腈-水(4:1；v/v)溶液為提取液，從攪碎的樣品中提取目標(biāo)物，離心后取2mL上清液過(guò)PRiME HLB固相萃取柱，流盡后，收集流出液，并向PRiMEHLB固相萃取柱中加入2mL乙腈-含0.1％甲酸的水(5:1；v/v)溶液，再收集流出液，氮吹至小于1mL，取乙腈定容至1mL，過(guò)0.2μm微孔濾膜，取過(guò)濾后的液體進(jìn)樣至超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)分析。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取頭孢標(biāo)準(zhǔn)品0.01g(精確至0.0001g),頭孢克洛、頭孢唑肟、頭孢雷特以甲醇:水＝1：1(v/v)溶液定容至100mL，其余頭孢標(biāo)準(zhǔn)品均以乙腈:水＝4：1(v/v)溶液定容至100mL，配制成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-40℃貯存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.1mL于容量瓶中，定容至10mL，配制成1mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，-40℃貯存，實(shí)驗(yàn)中每周配制一次，混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液使用乙腈逐級(jí)稀釋，配制成系列工作液。

優(yōu)化后的色譜條件：SUPELCO Ascentis C8色譜柱(10cm×4.6mm,3μm)，流動(dòng)相A為水相，含0.1％甲酸，B為乙腈。梯度洗脫程序：0-1min，95％B；1-8min，95％-5％B；8-9.5min，5％-95％B；9.5-15min，95％B。流速：0.5mL/min；進(jìn)樣體積：5μL；柱溫為20-40℃，優(yōu)選為30℃；樣品盤(pán)溫度：8℃。

其中質(zhì)譜參數(shù)：HESI離子源；鞘氣30psi；輔助氣10arb；噴霧電壓3.5Kv；S-lens電壓60V；毛細(xì)管溫度300℃；輔助氣加熱溫度350℃；正負(fù)離子切換采集模式。44種頭孢類(lèi)物質(zhì)的分子式、離子化方式及質(zhì)譜信息如表3所示，其中的分辨率為實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)與精確質(zhì)量數(shù)的差值再與實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)的比值，44種頭孢類(lèi)物質(zhì)的提取離子流圖如圖6所示，其中橫坐標(biāo)為離子的生成時(shí)間，以分表示，縱坐標(biāo)為離子的相對(duì)豐度，以百分比表示。

表3 44種頭孢類(lèi)物質(zhì)的分子式、離子化方式、精確質(zhì)量數(shù)及分辨率

由表3分析可知，頭孢乙腈是唯一在離子化過(guò)程中與銨離子結(jié)合的物質(zhì)，其余頭孢類(lèi)物質(zhì)均與氫離子結(jié)合或失去一個(gè)氫離子形成帶電基。相比其它頭孢類(lèi)物質(zhì)，頭孢乙腈中含有一個(gè)鍵長(zhǎng)較短的腈基，這可能使得頭孢乙腈更易與銨離子結(jié)合。從圖6所示的44個(gè)頭孢類(lèi)物質(zhì)的提取離子圖中可以看到，頭孢曲松是唯一一個(gè)不具備標(biāo)準(zhǔn)色譜峰形的物質(zhì)。這可能是由于頭孢曲松由頭孢母核與1,2,4-三嗪環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而具有穩(wěn)定的共軛結(jié)構(gòu)，對(duì)其軟電離過(guò)程造成不利影響。

在篩查方法中，為了確保定性結(jié)果的準(zhǔn)確度，本實(shí)施例使用Full MS/ddMS2二級(jí)離子全掃描模式，得到44種頭孢類(lèi)物質(zhì)的子離子，并以此達(dá)到對(duì)陽(yáng)性樣品確證的目的。高分辨率的子離子可以使我們更清晰地解析頭孢類(lèi)物質(zhì)的軟電離裂解規(guī)律，本實(shí)施例中，每種頭孢類(lèi)物質(zhì)均被選出三個(gè)子離子作為其定性離子，例如頭孢氨芐的特征子離子為106.06551，158.02692和174.05418(m/z)，頭孢噻肟的特征子離子為134.09650，167.02736和396.04297(m/z)，頭孢他美酯的特征子離子為241.03880，398.05874，380.04794(m/z)。

本實(shí)施例提供的優(yōu)化后的方法參照歐盟2002/657/EC(2002)標(biāo)準(zhǔn)和美國(guó)食品藥監(jiān)局生物分析程序指導(dǎo)手冊(cè)進(jìn)行方法驗(yàn)證。驗(yàn)證中每組數(shù)據(jù)至少取5次平行測(cè)定的平均結(jié)果。

CCα：等濃度梯度水平五個(gè)點(diǎn)加標(biāo)后，標(biāo)準(zhǔn)曲線上x(chóng)＝0位置上2.33倍的y值所對(duì)應(yīng)的x即為CCα(α＝1％)。CCβ：取1.64倍的CCα的y值所對(duì)應(yīng)x值(β＝5％)。結(jié)果見(jiàn)表4。

44種頭孢類(lèi)物質(zhì)回收率及精密度驗(yàn)證參照美國(guó)食品藥監(jiān)局生物分析程序指導(dǎo)手冊(cè)，取線性范圍內(nèi)高、中、低三個(gè)點(diǎn)進(jìn)行加標(biāo)檢測(cè)，每組數(shù)據(jù)取6次平行測(cè)定的平均結(jié)果，包括日間精密度，日內(nèi)精密度。加標(biāo)濃度為5μg/kg、50μg/kg、200μg/kg。由表4可以看出，日間和日內(nèi)檢測(cè)的回收率分別為69.20％-129.00％和62.90–128.00％。RSD均低于15％。

表4 CCα,CCβ,日間、日內(nèi)精密度及回收率考察表

依照本實(shí)施例優(yōu)化后的動(dòng)物肌肉組織中頭孢菌素類(lèi)藥物殘留快速篩查方法對(duì)市區(qū)采樣的270例樣品進(jìn)行篩查,其中有一例疑似樣品被檢出,如圖7、8所示，圖7為檢出的陽(yáng)性樣品的提取離子流圖，圖8為陽(yáng)性樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖，由標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，在羊肉樣本中檢出50.14μg/kg頭孢他啶。

綜上所述，本發(fā)明提供的動(dòng)物肌肉組織中頭孢菌素類(lèi)藥物殘留快速篩查方法，其利用超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，成功建立了一套動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類(lèi)藥物殘留篩查技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)動(dòng)物肌肉組織中44種頭孢菌素類(lèi)藥物殘留的篩查；另外，該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、分析速度快、分辨率高，分辨率在0.17-1.23ppm的范圍內(nèi)，全部44種目標(biāo)物回收率穩(wěn)定，其回收率在69.20％-129.00％的范圍內(nèi)，可有效地用于動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類(lèi)藥物殘留的篩查。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。