本發(fā)明涉及分析化學(xué)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地指一種長(zhǎng)春西汀注射液中維生素C含量的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：長(zhǎng)春西汀是從夾竹桃科小蔓長(zhǎng)春花提取的一種生物堿的衍生物，其有效成分為阿樸長(zhǎng)春胺酸乙酯，長(zhǎng)春西汀最早由匈牙利的GedeonRichter藥物公司研發(fā)并于1978年上市，長(zhǎng)春西汀注射液上市以來(lái)，因臨床效果顯著以及安全性和耐受性良好，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)內(nèi)科、心血管內(nèi)科、耳科、眼科、神經(jīng)外科等臨床科室，現(xiàn)已成為世界各國(guó)腦血管常規(guī)用藥。長(zhǎng)春西汀具有多種作用，能改善大腦代謝、血流量以及血液流變學(xué)性質(zhì)。目前上市的長(zhǎng)春西汀注射液中輔料一般為維生素C、焦亞硫酸鈉、L-酒石酸、山梨醇、氫氧化鈉和注射用水。維生素C作為長(zhǎng)春西汀注射液中重要輔料，起到助溶劑和抗氧劑的作用，它能夠延緩主成分長(zhǎng)春西汀的氧化過(guò)程，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性。但維生素C性質(zhì)不穩(wěn)定，在高溫條件下易降解，發(fā)生氧化反應(yīng)后容易使溶液顏色變黃，影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此它在長(zhǎng)春西汀注射液中的含量變化也應(yīng)成為該藥品的關(guān)注重點(diǎn)。目前，《中華人民共和國(guó)藥典》2015版二部收載的維生素C注射液中維生素C含量的檢測(cè)方法為滴定法，長(zhǎng)春西汀注射液中含有抗氧劑焦亞硫酸鈉，對(duì)檢測(cè)結(jié)果存在干擾。為此，需要研究簡(jiǎn)便高效的檢測(cè)長(zhǎng)春西汀注射液中維生素C含量的檢測(cè)方法，以確保藥品的安全性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就是要提供一種長(zhǎng)春西汀注射液中維生素C含量的檢測(cè)方法，該方法采用HPLC法檢測(cè)長(zhǎng)春西汀注射液中維生素C的含量，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易行，專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，為保證藥品的安全、有效、可控提供依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的一種長(zhǎng)春西汀注射液中維生素C含量的檢測(cè)方法，先通過(guò)紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描確定維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長(zhǎng)λmax；接著配制一組不同濃度的維生素C溶液，在最大吸收波長(zhǎng)λmax下通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定各維生素C溶液的色譜峰面積，繪制維生素C溶液濃度與其對(duì)應(yīng)色譜峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程；同時(shí)在最大吸收波長(zhǎng)λmax下通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定供試品溶液的色譜峰面積，最后計(jì)算出供試品溶液中維生素C含量。進(jìn)一步地，所述確定維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長(zhǎng)λmax的具體步驟如下：取適量維生素C，加入流動(dòng)相溶解并定量稀釋至濃度為10μg/mL，通過(guò)紫外-可見分光光度計(jì)在200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)λmax。進(jìn)一步地，所述繪制維生素C溶液濃度與其對(duì)應(yīng)色譜峰面積A的標(biāo)準(zhǔn)曲線具體步驟如下：配制濃度為2.5μg/ml、12.5μg/ml、25.0μg/ml、37.5μg/ml、50.0μg/ml、125.0μg/ml的維生素C溶液，分別取各溶液10μL進(jìn)樣，在最大吸收波長(zhǎng)λmax下通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定各維生素C溶液的色譜峰面積，以維生素C的濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得到線性回歸方程。進(jìn)一步地，所述供試品溶液中的維生素C含量測(cè)定的具體步驟如下：1)稱取適量待測(cè)長(zhǎng)春西汀注射液制劑，制成濃度為25μg/mL的供試品溶液；2)精確稱取適量純維生素C，制成濃度為25μg/mL的對(duì)照品溶液；3)分別供試品溶液和對(duì)照品溶液取15μl注入高效液相色譜儀中，在最大吸收波長(zhǎng)λmax下通過(guò)測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的色譜峰面積；4)根據(jù)如下公式計(jì)算出供試品溶液中維生素C的含量：式中，C為供試品溶液中維生素C的含量，單位為μg/ml；Ai為供試品溶液的峰面積；Ar為對(duì)照品溶液的峰面積；Cr為對(duì)照品溶液的濃度，單位為μg/ml。進(jìn)一步地，所述最大吸收波長(zhǎng)λmax為265～282nm。最佳地，所述最大吸收波長(zhǎng)λmax為267nm。進(jìn)一步地，所述高效液相色譜儀測(cè)定中色譜柱為InertSustainC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。進(jìn)一步地，所述高效液相色譜儀測(cè)定中柱溫為25～35℃。進(jìn)一步地，所述高效液相色譜儀測(cè)定中流動(dòng)相為醋酸銨溶液與乙腈按體積比為35:65～45:55的混合液，所述醋酸銨溶液的濃度為0.2mol/L，流速為1ml/min。進(jìn)一步地，所述高效液相色譜儀測(cè)定中定量方法采用外標(biāo)法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：其一，本發(fā)明采用HPLC法檢測(cè)長(zhǎng)春西汀注射液中維生素C的含量，所述流動(dòng)相與長(zhǎng)春西汀注射液有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)用流動(dòng)相相同，焦亞硫酸鈉等其他輔料在此檢測(cè)條件下無(wú)吸收，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易行，專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，為保證藥品的安全、有效、可控提供依據(jù)。其二，本發(fā)明的測(cè)定方法耐用性好，波長(zhǎng)、流速等的微小變化對(duì)含量測(cè)定影響不大，根據(jù)長(zhǎng)春西汀注射液中各組分在色譜柱固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的差別，不同色譜柱均能使維生素C色譜峰與其他色譜峰之間達(dá)到較好的分離。其三，在本方法中維生素C經(jīng)氧化破壞后的降解產(chǎn)物保留時(shí)間之前的峰為維生素C降解峰，可見降解產(chǎn)物峰與主峰的分離度良好，不干擾樣品的測(cè)定，專屬性好，但維生素C穩(wěn)定性較差，高溫、堿、氧化等條件都會(huì)導(dǎo)致其降解。其四，本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果重現(xiàn)性好，靈敏度高，檢測(cè)限為0.0301ng；加標(biāo)回收率穩(wěn)定，回收率在100.6％～102.92之間，可為維生素C在長(zhǎng)春西汀注射液中的含量變化提供關(guān)鍵的技術(shù)支持。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的紫外-可見光譜掃描示意圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的維生素C的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中專屬性實(shí)驗(yàn)的測(cè)試結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1：本發(fā)明確定維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長(zhǎng)λmax的具體步驟如下：取適量維生素C，加入流動(dòng)相溶解并定量稀釋至濃度為10μg/mL，通過(guò)紫外-可見分光光度計(jì)在200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見附圖1所示，維生素C在波長(zhǎng)267nm處具有最大吸收波峰。實(shí)施例2：本發(fā)明繪制維生素C溶液濃度與其對(duì)應(yīng)色譜峰面積A的標(biāo)準(zhǔn)曲線具體步驟如下：精密稱取維生素C配制成濃度為2.5μg/ml、12.5μg/ml、25.0μg/ml、37.5μg/ml、50.0μg/ml、125.0μg/ml的維生素C溶液，分別取各待測(cè)試樣溶液10μl進(jìn)樣，在最大吸收波長(zhǎng)λmax下通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定各維生素C溶液的色譜峰面積，各濃度維生素C溶液濃度(μg/ml)與峰面積見表1。高效液相色譜儀的色譜條件：色譜柱為InertSustainC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；最大吸收波長(zhǎng)λmax為267nm；柱溫為30℃；流動(dòng)相為醋酸銨溶液與乙腈按體積比為40:60的混合液，所述醋酸銨溶液的濃度為0.2mol/L，流速為1ml/min。表1線性關(guān)系考察結(jié)果序號(hào)123456濃度C(μg/ml)2.512.525.037.550.0125.0峰面積A93172475653994835140348118007054537898以維生素C的濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，以峰面積A對(duì)濃度C作線性回歸，得線性回歸方程：A＝36041C+34228，r＝0.9997，結(jié)果表明在2.5～125.0μg/ml范圍內(nèi)，維生素C對(duì)照品的濃度與峰面積A線性關(guān)系良好。實(shí)施例3：本發(fā)明測(cè)定長(zhǎng)春西汀注射液中維生素C含量的具體步驟：1)稱取適量樣品1～3待測(cè)長(zhǎng)春西汀注射液制劑，制成濃度為25μg/mL的供試品溶液；2)精確稱取適量純維生素C，制成濃度為25μg/mL的對(duì)照品溶液；3)分別供試品溶液和對(duì)照品溶液取15μl注入高效液相色譜儀中，在最大吸收波長(zhǎng)λmax下通過(guò)測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的色譜峰面積；4)根據(jù)如下公式計(jì)算出供試品溶液中維生素C的含量：式中，C為供試品溶液中維生素C的含量，單位為μg/ml；Ai為供試品溶液的峰面積；Ar為對(duì)照品溶液的峰面積；Cr為對(duì)照品溶液的濃度，單位為μg/ml。高效液相色譜儀的色譜條件：色譜柱為InertSustainC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；最大吸收波長(zhǎng)λmax為267nm；柱溫為30℃；流動(dòng)相為醋酸銨溶液與乙腈按體積比為40:60的混合液，所述醋酸銨溶液的濃度為0.2mol/L，流速為1ml/min。樣品1-3檢測(cè)所用的長(zhǎng)春西汀注射液成分為長(zhǎng)春西汀、維生素C、焦亞硫酸鈉、山梨醇、L-酒石酸、氫氧化鈉和注射用水，其中維生素C理論值含量為0.25mg/ml，每個(gè)實(shí)施例中維生素C含量檢測(cè)進(jìn)行2次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。表2維生素C含量檢測(cè)結(jié)果樣品1-3中檢測(cè)結(jié)果與理論值0.25mg/ml接近，偏低的原因是由于在生產(chǎn)和儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)消耗部分維生素C。實(shí)施例4：本發(fā)明測(cè)定方法的專屬性實(shí)驗(yàn)：在實(shí)施例3中的色譜條件下，精密量取上述對(duì)照品溶液、待測(cè)試樣溶液、空白溶劑、無(wú)維生素C含長(zhǎng)春西汀和其他輔料的空白對(duì)照溶液各10μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，對(duì)色譜圖中的主要成分峰進(jìn)行歸屬并考察選擇性，結(jié)果如圖3所示。對(duì)照品溶液色譜圖中，維生素C保留時(shí)間為1.889分鐘；待測(cè)試樣溶液色譜圖中，維生素C峰與其他色譜峰分離度良好；空白對(duì)照溶液在維生素C峰相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)干擾吸收峰，對(duì)含量測(cè)定無(wú)干擾。實(shí)施例5本發(fā)明測(cè)定方法的精密度試驗(yàn)：1、儀器精密度試驗(yàn)：對(duì)照品溶液(濃度為25.0μg/ml)，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果見表3。表3儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果*rsd(％)＝標(biāo)準(zhǔn)偏差sd/平均值×100％結(jié)果表明，其峰面積測(cè)量值的RSD為1.79％，說(shuō)明儀器精密度良好。2、重復(fù)性試驗(yàn)：取本品10支，混合均勻后按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份待測(cè)試樣溶液，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算本品中維生素C的濃度，結(jié)果見表4。表4重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(μg/ml)序號(hào)123456平均值RSD濃度150.4151.9146.0150.1150.4151.1150.01.37％結(jié)果表明，本品中維生素C的濃度為150.0μg/ml，測(cè)量結(jié)果的RSD小于2.0％，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。3、中間精密度試驗(yàn)：取本品10支，混合均勻后由不同的操作人員按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份待測(cè)試樣溶液，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算本品中維生素C的濃度，結(jié)果見表5。表5中間精密度試驗(yàn)結(jié)果(μg/ml)結(jié)果表明，不同操作人員測(cè)定本品中維生素C濃度為178.8μg/ml，測(cè)量結(jié)果的RSD小于2.0％，說(shuō)明該方法中間精密度良好。實(shí)施例6本發(fā)明測(cè)定方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)：取本品10支，混合均勻后量取0.5ml于10ml量瓶中，按“實(shí)施例3”項(xiàng)下待測(cè)試樣溶液80％～120％取樣量的范圍取樣，分別加入對(duì)照品溶液6ml、5ml和4ml，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即平行制備高濃度、中濃度、低濃度待測(cè)試樣溶液各三份。按上述色譜條件，分別取待測(cè)試樣溶液和對(duì)照品溶液各10μl，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積。按外標(biāo)法計(jì)算維生素C的含量，結(jié)果見表6。表6維生素C回收率測(cè)定結(jié)果可見在80％～120％測(cè)試濃度的范圍內(nèi)，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度良好。實(shí)施例7本發(fā)明測(cè)定方法的范圍：配制三種規(guī)格待測(cè)試樣中維生素濃度分別25μg/ml、41.7μg/ml和50μg/ml，選擇最低濃度的80％(20μg/ml)作為低濃度溶液，最高濃度的120％(60μg/ml)作為高濃度溶液，取維生素C對(duì)照品適量，平行制備各濃度待測(cè)試樣溶液三份，精密量取10μl進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算各待測(cè)試樣溶液中維生素C的濃度，結(jié)果見表7。表7維生素C范圍試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，維生素C可以在20μg/ml～60μg/ml范圍內(nèi)取樣定量。實(shí)施例8本發(fā)明測(cè)定方法的耐用性試驗(yàn)1、不同檢測(cè)波長(zhǎng)的比較考察檢測(cè)波長(zhǎng)的改變對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響。使用不同的檢測(cè)波長(zhǎng)(±2nm)，其他色譜條件不變，分別精密量取待測(cè)試樣溶液及對(duì)照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定待測(cè)試樣溶液中維生素C的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算本品中維生素C的濃度，結(jié)果見表8。表8耐用性試驗(yàn)-不同檢測(cè)波長(zhǎng)的比較檢測(cè)波長(zhǎng)267nm278nm280nm282nmRSD濃度(μg/ml)179.7174.0174.6171.51.97％結(jié)果顯示：本品中維生素C濃度的RSD小于2.0％，表明在一定范圍內(nèi)，不同的檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)含量測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。但因維生素C在波長(zhǎng)267nm處具有最大吸收，故最終確定選擇267nm作為本方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。2、不同流速的比較考察流速的改變對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響。使用不同的流速(±0.1ml/min)，其他色譜條件不變，分別精密量取待測(cè)試樣溶液及對(duì)照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定待測(cè)試樣溶液中維生素C的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算本品中維生素C的濃度，結(jié)果見表9。表9耐用性試驗(yàn)-不同流速的比較流速0.9ml/min1.0ml/min1.1ml/minRSD濃度(μg/ml)169.9174.6173.51.40％結(jié)果顯示：本品中維生素C濃度的RSD小于2.0％，表明在一定范圍內(nèi)，不同的流速對(duì)含量測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。3、不同流動(dòng)相比例考察不同流動(dòng)相比例對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響。使用不同流動(dòng)相比例，其他色譜條件不變，分別精密量取待測(cè)試樣溶液及對(duì)照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定待測(cè)試樣溶液中維生素C的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算本品中維生素C的濃度，結(jié)果見表10。表10耐用性試驗(yàn)-不同流動(dòng)相比例的比較乙腈:0.2mol/l醋酸銨溶液65:3560:4055:45RSD濃度(μg/ml)171.2173.0173.20.64％結(jié)果顯示：本品中維生素C濃度的RSD小于2.0％，表明在一定范圍內(nèi)，不同的流動(dòng)相比例均可達(dá)到較好的分離，對(duì)其含量測(cè)定無(wú)影響。結(jié)論：該檢測(cè)方法耐用性良好。以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明所揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3