本發(fā)明提供了一種鼻咽癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)試劑盒，屬于鼻咽癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)指進(jìn)入到血液中的腫瘤細(xì)胞。這部分腫瘤細(xì)胞參與到血液循環(huán)當(dāng)中，并且隨著血液循環(huán)的方向可以遷移至相關(guān)組織或器官，在合適的條件下發(fā)展成腫瘤病灶。CTCs主要來(lái)源分為兩方面：一為脫落，即由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落下來(lái)穿透血管壁進(jìn)入到血液中。二為較早的階段進(jìn)入，即在尚未增殖形成影像學(xué)可見(jiàn)的腫瘤病灶組織時(shí)，以癌變細(xì)胞的形式提前進(jìn)入到血液中，因此從理論上講，CTCs的出現(xiàn)要早于影像學(xué)對(duì)腫瘤實(shí)體的發(fā)現(xiàn)。

鼻咽癌常見(jiàn)的檢查方法有：磁共振成像檢查，CT檢查，鼻咽鏡檢查，X射線檢查，血清學(xué)診斷等。常見(jiàn)基于血清學(xué)診斷主要是依據(jù)鼻咽癌患者血清中EB病毒抗體水平與其它惡性腫瘤患者和健康人之間存在明顯差異。

鼻咽部解剖位置隱蔽，鼻咽癌早期癥狀不典型，臨床上容易延誤診斷，應(yīng)特別提高警惕。而鼻咽癌的治療方法主要是以放化療為主，檢測(cè)及監(jiān)測(cè)鼻咽癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量可提示早期診斷，并進(jìn)行放化療療效的評(píng)估。

采用人外周全血進(jìn)行檢測(cè)，早中晚期鼻咽癌患者血液中，只要存在進(jìn)入血液循環(huán)的鼻咽癌腫瘤細(xì)胞，均可被檢測(cè)到。由于CTC在外周血的數(shù)量極少，通常需在約1億個(gè)白細(xì)胞和500億個(gè)紅細(xì)胞中尋找僅有的數(shù)個(gè)腫瘤細(xì)胞，因此為了提高CTC的檢出率，通常須在檢測(cè)前進(jìn)行CTC富集。目前CTC的富集方法按其原理主要分為基于抗原抗體反應(yīng)原理的富集法和基于細(xì)胞形態(tài)的富集方法。并且CTC的檢測(cè)方法眾多，根據(jù)檢測(cè)原理可分為兩大類：細(xì)胞計(jì)數(shù)法和核酸檢測(cè)法，前者主要包括各種免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光技術(shù)等；后者主要包括聚合酶鏈反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及其各種改進(jìn)的技術(shù)等。目前的檢測(cè)方法中普遍存在有以下缺陷：由于外周血中的白細(xì)胞去除率不高，白細(xì)胞作為有核細(xì)胞會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的富集造成干擾。此外，血源性異常細(xì)胞也會(huì)對(duì)非血源性異常細(xì)胞(循環(huán)腫瘤細(xì)胞)的篩選造成干擾。此外，目前大多采用正分選的方法捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞，利用磁珠表面偶聯(lián)有特異性抗體(如Epcam、CK19等)捕獲腫瘤細(xì)胞，該方法得到的細(xì)胞表面帶有磁珠，導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。并且由于標(biāo)志物的關(guān)系，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞富集回收率較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種鼻咽癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，該試劑盒結(jié)合免疫磁富集分離技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、鼻咽癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)，能精確測(cè)定樣本中鼻咽癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：

一種鼻咽癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，由人外周血白細(xì)胞去除部分和免疫熒光原位雜交鑒定部分組成，其中人外周血白細(xì)胞去除部分包括稀釋緩沖液、紅細(xì)胞裂解液、密度梯度離心介質(zhì)、細(xì)胞固定液A以及免疫磁珠，其中紅細(xì)胞裂解液由氯化銨、碳酸氫鈉以及EDTA二鈉溶液混合而成，所述免疫磁珠是共價(jià)偶聯(lián)了抗人白細(xì)胞共同抗原的抗體的磁珠，該抗體為CD45，所用免疫磁珠粒徑為0.2～1.5μm；細(xì)胞固定液A功效成分為醇類；

所述的免疫熒光原位雜交鑒定部分包括緩沖液，雜交固定液B，生物素標(biāo)記的CEP8探針，紅色量子點(diǎn)標(biāo)記的CD45抗體，綠色量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素，封片劑以及牛血清白蛋白粉末；所述雜交固定液B功效成分為多聚甲醛，所述CEP8探針能夠通過(guò)熒光原位雜交的方法對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行探針標(biāo)記，所述紅色量子點(diǎn)標(biāo)記的CD45抗體對(duì)剩余白細(xì)胞進(jìn)行染色且其發(fā)射波長(zhǎng)為585nm～625nm，綠色量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素能夠與CEP8探針相結(jié)合從而對(duì)DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，且其發(fā)射波長(zhǎng)為525nm～545nm，所述封片劑含有能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料DAPI。

所述的紅細(xì)胞裂解液的pH值為7.0～8.0，其中氯化銨的濃度為0.5～2M，碳酸氫鈉濃度為10～200mM，EDTA二鈉的濃度為1～10mM。

所述的生物素標(biāo)記的CEP8探針購(gòu)自于美國(guó)雅培分子公司。

紅色量子點(diǎn)標(biāo)記的CD45抗體的發(fā)射波長(zhǎng)為605nm，綠色量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素的發(fā)射波長(zhǎng)為525nm，兩者均采用共價(jià)偶聯(lián)的方式將量子點(diǎn)與蛋白進(jìn)行連接。

所述的密度梯度離心介質(zhì)的密度為1.02～1.5g/cm³，其有效成分為蔗糖，且蔗糖的質(zhì)量濃度為5％～60％。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明采用負(fù)分選陰性富集的方法得到的腫瘤細(xì)胞活性高，腫瘤細(xì)胞富集回收率大于80％。試劑盒采用的熒光量子點(diǎn)作為非血源性基因異常型細(xì)胞的判定標(biāo)記物，主要特點(diǎn)是熒光亮度高，性能穩(wěn)定，不易漂白，易于觀察。

本發(fā)明采用陰性富集的方法，所得到的腫瘤細(xì)胞表面完整，活性高，更加方便進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)及分子標(biāo)志物檢測(cè)。

本發(fā)明采用去血漿、紅細(xì)胞裂解技術(shù)、密度梯度離心技術(shù)，大大提高了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集率，白細(xì)胞去除率大于99.99％。

本發(fā)明采用熒光原位雜交及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對(duì)所富集到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定，8號(hào)染色體探針對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA序列進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果會(huì)顯示三倍體、四倍體、多倍體信號(hào)。采用熒光原位雜交的方法不受限于上皮標(biāo)志物的表達(dá)，提高檢出的敏感性和特異性。紅色量子點(diǎn)標(biāo)記的CD45抗體對(duì)白細(xì)胞表面進(jìn)行染色，與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。所計(jì)數(shù)得到的腫瘤細(xì)準(zhǔn)確無(wú)誤。

本發(fā)明CTC富集技術(shù)采用基于免疫磁性原理的陰性富集法，通過(guò)使用特異性單克隆抗體(CD45)包被的免疫磁微?？扇コ簝?nèi)99.99％以上的白細(xì)胞，最大程度地降低背景有核細(xì)胞的干擾，從而達(dá)到富集腫瘤細(xì)胞的目的。因不依賴于腫瘤細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，本發(fā)明CTC富集方法在各上皮來(lái)源實(shí)體瘤中具備一定的通用性，能達(dá)到較高的腫瘤細(xì)胞回收率。為排除血源性異常細(xì)胞的干擾，本發(fā)明獨(dú)創(chuàng)技術(shù)：通過(guò)選用特異性探針將FISH與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合，采用熒光量子點(diǎn)作為標(biāo)記物，快速篩選出非血源性基因異常型細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明提供的鼻咽癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)流程圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中的臨床標(biāo)本檢測(cè)數(shù)據(jù)分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)具體的說(shuō)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于以下實(shí)施例。

本發(fā)明所提供的鼻咽癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)試劑盒由人外周血白細(xì)胞去除部分和免疫熒光原位雜交鑒定部分組成，其中人外周血白細(xì)胞去除部分包括稀釋緩沖液、紅細(xì)胞裂解液、密度梯度離心介質(zhì)、細(xì)胞固定液A以及免疫磁珠，其中紅細(xì)胞裂解液由氯化銨、碳酸氫鈉以及EDTA二鈉溶液混合而成，所述免疫磁珠是共價(jià)偶聯(lián)了抗人白細(xì)胞共同抗原的抗體的磁珠，該抗體為CD45，所用免疫磁珠粒徑為0.2～1.5μm。所述的紅細(xì)胞裂解液的pH值為7.0～8.0，其中氯化銨的濃度為0.5～2M，碳酸氫鈉濃度為10～200mM，EDTA二鈉的濃度為1～10mM。所述的密度梯度離心介質(zhì)的密度為1.02～1.5g/cm³，其有效成分為蔗糖，且蔗糖的質(zhì)量濃度為5％～60％。所述細(xì)胞固定液A主要成分為醇類。

所述的免疫熒光原位雜交鑒定部分包括緩沖液，雜交固定液B，生物素標(biāo)記的CEP8探針，紅色量子點(diǎn)標(biāo)記的CD45抗體，綠色量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素，封片劑以及以及牛血清白蛋白粉末，所述CEP8探針能夠通過(guò)熒光原位雜交的方法對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行探針標(biāo)記，所述的生物素標(biāo)記的CEP8探針購(gòu)自于美國(guó)雅培分子公司。所述雜交固定液B是對(duì)老化脫水前的細(xì)胞進(jìn)行固定，主要成分為多聚甲醛。所述紅色量子點(diǎn)標(biāo)記的CD45抗體對(duì)剩余白細(xì)胞進(jìn)行染色且其發(fā)射波長(zhǎng)為585nm～625nm，本實(shí)施例中紅色量子點(diǎn)標(biāo)記的CD45抗體的發(fā)射波長(zhǎng)為605nm，綠色量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素能夠與CEP8探針相結(jié)合從而對(duì)DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，且其發(fā)射波長(zhǎng)為525nm～545nm，本實(shí)施例中綠色量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素的發(fā)射波長(zhǎng)為525nm。紅色量子點(diǎn)標(biāo)記的CD45抗體與綠色量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素均采用共價(jià)偶聯(lián)的方式將量子點(diǎn)與蛋白進(jìn)行連接。所述封片劑含有能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料DAPI。

本發(fā)明所提供的鼻咽癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)試劑盒在使用時(shí)的檢測(cè)流程圖如圖1所示，具體的步驟如下：

1、血漿及紅細(xì)胞去除：血液樣本中加入緩沖液450g～1000g后離心5～10min去除血漿，然后加入450g～1000g紅細(xì)胞裂解液于搖床中旋轉(zhuǎn)8-12min，離心5～10min后得到白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。

2、白細(xì)胞去除：將得到的白細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞混合物中加入免疫磁微粒于水平搖床中反應(yīng)，免疫磁微粒表面偶聯(lián)有抗人白細(xì)胞共同抗原的抗體，該磁微粒特異性與白細(xì)胞結(jié)合，可與標(biāo)本中99.99％的白細(xì)胞結(jié)合，從而達(dá)到去除白細(xì)胞的目的。

3、密度梯度離心技術(shù)：將捕獲了白細(xì)胞的磁微粒與腫瘤細(xì)胞混合物輕輕疊加至離心介質(zhì)中，通過(guò)密度梯度離心技術(shù)，結(jié)果可分為4層，底層為免疫磁微粒與白細(xì)胞復(fù)合物，依次往上為離心介質(zhì)層、腫瘤細(xì)胞層、緩沖液層。根據(jù)目的吸取腫瘤細(xì)胞層，可能會(huì)殘留免疫磁微粒，通過(guò)靠磁力架的方式除去剩余免疫磁微粒，得到的細(xì)胞離心后于管底部，取出底部細(xì)胞進(jìn)行涂片。

4、細(xì)胞固定技術(shù)：涂片后細(xì)胞加入細(xì)胞固定液A，于25℃～30℃干燥12～36小時(shí)。

5、原位雜交技術(shù)：待涂片后的細(xì)胞完全干燥后，將細(xì)胞區(qū)域采用雜交固定液B進(jìn)行固定，然后老化、脫水處理，進(jìn)行原位雜交。所采用探針為生物素標(biāo)記的CEP8，雜交儀設(shè)定變性溫度為76℃，時(shí)間為5min；雜交溫度為37℃，時(shí)間為1.5～3h。雜交完畢，取出玻片進(jìn)行洗滌。

6、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：將已完成原位雜交的玻片洗滌后，配制紅色量子點(diǎn)標(biāo)記的CD45與綠色量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素作為免疫熒光染色液，將染色液加入至細(xì)胞標(biāo)本區(qū)于37℃溫箱孵育1～3h，孵育完成后進(jìn)行洗滌，加入DAPI封片劑進(jìn)行封片。

7、腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)：將已完成原位雜交及免疫熒光檢測(cè)的玻片置于熒光顯微鏡下，紫外激發(fā)觀察藍(lán)色DAPI信號(hào)，可確定細(xì)胞核形態(tài)；觀察綠色CEP8探針信號(hào)，可確定細(xì)胞核內(nèi)雜交信號(hào)點(diǎn)個(gè)數(shù)；觀察紅色CD45信號(hào)，確定白細(xì)胞細(xì)胞膜染色情況；最終確定細(xì)胞核為單核，探針信號(hào)點(diǎn)三個(gè)及以上，無(wú)CD45染色信號(hào)的細(xì)胞為異常細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)并計(jì)數(shù)，整張玻片掃描完畢，統(tǒng)計(jì)腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)，即為該樣本所含腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)。

本實(shí)施例尋找了103為臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析，103例標(biāo)本中有27例健康志愿者(Healthy Controls)、34例鼻咽部良性病變患者(Non-maniglant Disease)和42例鼻咽癌患者，以上臨床標(biāo)本的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)數(shù)據(jù)分布如圖2所示，由圖2可知，本發(fā)明所提供的鼻咽癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際狀況相符。