本發(fā)明涉及一種利用雙抗夾心法定量測(cè)定腦紅蛋白的方法及其應(yīng)用，具體涉及一種基于ELISA檢測(cè)手段定量檢測(cè)視網(wǎng)膜腦紅蛋白表達(dá)水平變化及其用于評(píng)估LED光源致視網(wǎng)膜光損傷程度的應(yīng)用，屬于蛋白分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
發(fā)光二極管(LED)是一種將電能直接轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)光的固態(tài)半導(dǎo)體。與鎢燈不同，LED燈利用藍(lán)光激發(fā)熒光粉來(lái)產(chǎn)生白光，因此它們含有有害成分極高的可見(jiàn)光譜。由于短波譜(400-500nm)尤其危險(xiǎn)，LED照明燈比其他任何光源更有可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷。然而，很少有關(guān)于視網(wǎng)膜LED光損傷的生物標(biāo)記物的研究。目前研究比較成熟的光損傷生物標(biāo)志物是視紫紅質(zhì)，這是由于氧化應(yīng)激時(shí)視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷的一個(gè)重要機(jī)制，藍(lán)光照射顯著增加在視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)線粒體超氧化物自由基的產(chǎn)生，視紫紅質(zhì)的漂白通過(guò)氧化應(yīng)激引起損傷。此外，科學(xué)家基于藍(lán)光通過(guò)視紫紅質(zhì)誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性的研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲除視紫紅質(zhì)基因時(shí)，視網(wǎng)膜上沒(méi)有損害發(fā)生。因而視紫紅質(zhì)作為光損傷生物標(biāo)志物具有一定的優(yōu)勢(shì)，然而由于視紫紅質(zhì)很不穩(wěn)定，而且濃度可能過(guò)低使其難以成為理想的光損傷標(biāo)記物，其檢測(cè)限以及檢測(cè)準(zhǔn)確度病不能令人滿(mǎn)意。目前而言，尋找一個(gè)可靠的光損傷標(biāo)記物已經(jīng)成為該治療領(lǐng)域中一個(gè)重要的研究方向，也是行業(yè)亟需。
腦紅蛋白Neuroglobin(簡(jiǎn)稱(chēng)Ngb，譯為腦紅蛋白)，為新近發(fā)現(xiàn)的腦組織、神經(jīng)元特異表達(dá)的含血卟啉結(jié)構(gòu)的血紅蛋白家族成員。與已知的血紅蛋白(hemoglobin)、肌紅蛋白(myoglobin)的最大不同是腦紅蛋白所含的血紅素為六配位鍵，而非五配位鍵結(jié)構(gòu)。腦紅蛋白(Ngb)是一個(gè)在神經(jīng)元內(nèi)特異性表達(dá)的蛋白，它顯示為一個(gè)對(duì)氧有高親和力的典型球蛋白。Ngb的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、配體結(jié)合屬性和神經(jīng)元特異性表達(dá)表明它在神經(jīng)組織的氧氣內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。
有研究表明Ngb在視網(wǎng)膜上的濃度比大腦高出100倍，相當(dāng)于肌肉中肌紅蛋白的含量。在視網(wǎng)膜神經(jīng)核層與神經(jīng)節(jié)層的核周體中檢測(cè)到Ngb的mRNA，而蛋白質(zhì)主要在網(wǎng)狀層(PLs)和光感受器出現(xiàn)。這獨(dú)特的分布可能與線粒體的亞細(xì)胞定位和相對(duì)氧的要求相關(guān)，因?yàn)橐暰W(wǎng)膜的視覺(jué)性能需要大量的氧氣來(lái)維持由突觸傳遞的光傳導(dǎo)。即使具體的機(jī)制仍不清楚，但集聚的Ngb提示著其在視覺(jué)生理周期起著至關(guān)重要的作用。另有研究顯示，Ngb在視網(wǎng)膜上有著抗凋亡的保護(hù)功能。一個(gè)研究在青光眼模型檢測(cè)Ngb，結(jié)果表明，Ngb增加了視網(wǎng)膜細(xì)胞的抗氧化能力和Ngb的過(guò)度表達(dá)可以降低眼內(nèi)壓力相關(guān)的過(guò)氧化物產(chǎn)生。在急性缺血視網(wǎng)膜損傷模型中Ngb也迅速增加。Ngb似乎是疾病早期階段的指標(biāo)。另一個(gè)調(diào)查顯示，Ngb的過(guò)度表達(dá)與減少線粒體DNA的損傷、保存的視網(wǎng)膜厚度、減少半胱天冬酶3蛋白的激活和Ngb-Tg老鼠的細(xì)胞凋亡有關(guān)。Lechauve等人表明，通過(guò)對(duì)老鼠的眼睛進(jìn)行電穿孔來(lái)敲除體內(nèi)Ngb表達(dá)會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能造成有害影響，包括神經(jīng)纖維密度的減少和視覺(jué)功能的損害。
因此，基于Ngb蛋白的LED光源致視網(wǎng)膜光損傷ELISA檢測(cè)一方面為生活中LED的廣泛應(yīng)用的帶來(lái)的潛在視網(wǎng)膜光損傷提供一個(gè)新的參考指標(biāo)和檢測(cè)工具；另一方面為全面揭示Ngb蛋白的病理意義以及與視網(wǎng)膜疾病的關(guān)系的研究提供了一個(gè)新手段。蛋白檢測(cè)方法相對(duì)于核酸檢測(cè)法，避免了蛋白表達(dá)的時(shí)空調(diào)控導(dǎo)致的誤差，具有更直接準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種利用雙抗夾心法定量測(cè)定腦紅蛋白的方法，并用于評(píng)價(jià)LED光源致視網(wǎng)膜光損傷的方法。
本發(fā)明提供一種利用雙抗夾心法定量測(cè)定腦紅蛋白的方法，所述檢測(cè)方法包括：以包被于ELISA檢測(cè)板上的Ngb單克隆抗體作為固相抗體，以生物素標(biāo)記的Ngb多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體，通過(guò)顯色劑-Avidin與多克隆抗體上的生物素結(jié)合使顯色劑通過(guò)與其偶聯(lián)的Avidin與多克隆抗體上的生物素結(jié)合，經(jīng)顯色，以定量檢測(cè)實(shí)現(xiàn)Ngb蛋白，所述的檢測(cè)方法的檢測(cè)原理如附圖1所示。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述利用雙抗夾心法定量測(cè)定腦紅蛋白的方法具體包括如下步驟：
1)包被：將Ngb單克隆抗體用pH9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋?zhuān)?7℃孵育4h后使用PBST洗滌4次；
2)封閉：使用含5％BSA的PBS封閉液封閉，37℃孵育4h后使用PBST洗滌2次；
3)捕獲抗原：抗原稀釋至合適濃度，同時(shí)使用PBS作為陰性對(duì)照，37℃孵育1h后使用PBST洗滌4次；
4)加入二抗：將生物素化的Ngb多克隆抗體稀釋后加入到反應(yīng)孔中，37℃孵育1h后洗滌。
5)酶標(biāo)二抗：將購(gòu)買(mǎi)的商業(yè)化HRP-Avidin稀釋1.5萬(wàn)倍后加入到反應(yīng)孔中，37℃孵育50min后洗滌。
6)顯色：向反應(yīng)孔中加入TMB，室溫或37℃反應(yīng)5-30min，顯色完畢后加入H2SO4終止反應(yīng)，于20min內(nèi)在450nm單波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值。
作為上述檢測(cè)方法所優(yōu)選的一種實(shí)施方式，所述的利用雙抗夾心法定量測(cè)定腦紅蛋白的方法具體包括如下步驟：
1)包被：將Ngb單克隆抗體用pH9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋至10μg/ml，每孔加入100μl，37℃孵育4h后按照如下方法洗滌，棄去孔中液體，用PBST洗4次，每次2分鐘，甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干；
2)封閉：每孔加200μl含5％BSA的PBS封閉液封閉，37℃孵育4h按照如下方法進(jìn)行洗滌，PBST洗2次，每次2分鐘，甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干；
3)捕獲抗原：抗原稀釋至合適濃度，每孔100μl加入到對(duì)應(yīng)孔中，陰性對(duì)照加100μl PBS，37℃孵育1h，按照步驟1)所述方法洗滌；
4)加入二抗：將生物素化的Ngb多克隆抗體稀釋至2μg/ml，每孔各加100μl，37℃孵育1h，按照步驟2)所述方法洗滌；
5)酶標(biāo)二抗：將購(gòu)買(mǎi)的商業(yè)化HRP-Avidin稀釋1.5萬(wàn)倍，每孔各加100μl，37℃孵育50min，按照步驟1)所述方法洗滌；
6)顯色檢測(cè)：每孔加100μl TMB，室溫或37℃反應(yīng)5-30min，顯色完畢后，每孔立即加入100μl 2M H2SO4終止反應(yīng)，于20min內(nèi)檢測(cè)在450nm單波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值。
一種定量測(cè)定樣品中Ngb蛋白含量的方法，其具體包括如下步驟：
1)繪制Ngb蛋白-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線：將Ngb標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行梯度稀釋后作為抗原，根據(jù)上述方法測(cè)定Ngb標(biāo)準(zhǔn)蛋白不同濃度下反應(yīng)液在450nm下的吸光度，繪制Ngb蛋白-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線；
2)樣品中Ngb蛋白含量的測(cè)定：將樣品稀釋至合適濃度后作為抗原，根據(jù)上述方法測(cè)定樣品反應(yīng)液在450nm下的吸光度，將吸光度代入Ngb蛋白-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線推算Ngb蛋白濃度，并進(jìn)而計(jì)算樣品中Ngb蛋白含量的測(cè)定。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的Ngb的多克隆抗體是利用純化的Ngb蛋白免疫新西蘭大白兔獲得。
本發(fā)明還提供一種上述方法的應(yīng)用，即所述的檢測(cè)方法在評(píng)估視網(wǎng)膜光損傷中的應(yīng)用，其中所述的視網(wǎng)膜光損傷為L(zhǎng)ED光源導(dǎo)致。在我們通過(guò)深入的研究發(fā)現(xiàn)LED光刺激上調(diào)了大鼠視網(wǎng)膜腦紅蛋白的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)在這個(gè)以前被認(rèn)為是安全的藍(lán)色的光照水平，沒(méi)有造成視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，腦紅蛋白的表達(dá)量比對(duì)照組近2倍。第二，在2小時(shí)藍(lán)光照射后，腦紅蛋白表達(dá)上調(diào)更為明顯且同時(shí)觀察到了視網(wǎng)膜損傷。此外，藍(lán)光照射1小時(shí)后表達(dá)增加兩倍，但照射2小時(shí)時(shí)表達(dá)到約七倍。這樣的差別暗示著藍(lán)光本身強(qiáng)度的大小會(huì)導(dǎo)致腦紅蛋白表達(dá)水平的巨大差別。最近的報(bào)告顯示，腦紅蛋白具有保護(hù)神經(jīng)元功能，可能在本身的凋亡通路的早期事件起調(diào)節(jié)作用。在應(yīng)激或病理狀態(tài)下，增加的腦紅蛋白水平的可能防止不適當(dāng)?shù)牡蛲鲂盘?hào)。它也同樣可以在藍(lán)光照射導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷中起作用。有相當(dāng)?shù)腘gb表達(dá)改變過(guò)程在當(dāng)視網(wǎng)膜被最初被藍(lán)光損害發(fā)生之前。本發(fā)明的方法為L(zhǎng)ED光源致視網(wǎng)膜光損傷評(píng)估方法奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明雙抗體夾心法與傳統(tǒng)的ELISA檢測(cè)方法相比，固相抗體可以捕獲并富集抗原，產(chǎn)生放大作用，同時(shí)通過(guò)兩個(gè)單克隆抗體的特異性選擇，提高了特異性，所以該方法具有更高的特異性和靈敏性。且腦紅蛋白作為視網(wǎng)膜光損傷的標(biāo)志物用于檢測(cè)時(shí)，其對(duì)于損傷的檢測(cè)限度更低，可以很好確定視網(wǎng)膜光損傷的程度。
附圖說(shuō)明
圖1：本發(fā)明的Ngb蛋白的檢測(cè)方法的工作原理圖。plate，檢測(cè)板；Ab1，Ngb單克隆抗體；Ab2，Ngb多克隆抗體；Ag，待檢測(cè)樣品；Biotin，生物素；Avidin，抗生物素蛋白；HRP，辣根過(guò)氧化物酶。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例將有助于說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1 Ngb單克隆抗體的制備
1.1雜交瘤細(xì)胞的制備
取1ml0.25g/L的Ngb蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后皮下注射于5只Balb/c小鼠。每間隔3周加強(qiáng)免疫1次，加強(qiáng)免疫時(shí)改用弗氏不完全佐劑，抗原量及注射途徑不變。第2次加強(qiáng)免疫后7d取尾血測(cè)效價(jià)。融合前3d，經(jīng)尾靜脈注射同等劑量的抗原PBS溶液再加強(qiáng)免疫1次。分別收集免疫小鼠脾細(xì)胞和NS-1細(xì)胞以約1∶5的比例在50％PEG作用下按常規(guī)方法融合。融合后的細(xì)胞沉淀用2.5ml完全培養(yǎng)液輕懸加入22.5ml半固體培養(yǎng)基MediumD混勻后倒入直徑3.5cm的平皿中，每個(gè)平皿約2ml，37℃，5％CO2培養(yǎng)。一周后肉眼可見(jiàn)平皿的培養(yǎng)基表面有白色斑點(diǎn)，顯微鏡下即為細(xì)胞克隆團(tuán)。無(wú)菌條件下將平皿中分散的、單個(gè)的細(xì)胞團(tuán)吸起放入96孔板培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)。96孔板中細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后間接ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性孔用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。
1.2Ngb單克隆抗體的制備與純化：將雜交瘤細(xì)胞按2×105/ml接種于80ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。至細(xì)胞活性狀態(tài)最佳，將細(xì)胞質(zhì)數(shù)量調(diào)至約5×106。注射0.5ml液體石蠟至Balb/c小鼠腹腔7d后再注射1ml該濃度的雜交瘤細(xì)胞。7d后，小鼠腹部增大，收集腹水。2000r/min室溫離心5min吸取上清。參照HiTrapproteinA親和層析說(shuō)明書(shū)進(jìn)行腹水的抗體純化即可得到Ngb單克隆抗體。
實(shí)施例2生物素化的Ngb多克隆抗體制備與純化
2.1兔抗Ngb蛋白多克隆抗體的制備與提純：純化Ngb蛋白與完全福氏佐劑充分混勻，皮下多點(diǎn)免疫日本大耳兔，2周后，再與不完全福氏佐劑混勻，皮下加強(qiáng)免疫，1周后，收集血清，ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)。免疫血清經(jīng)飽和硫酸銨、50％硫酸銨、33％硫酸銨溶液鹽析沉淀。鹽析純化后的免疫血清再經(jīng)SephadexG25除鹽純化、DEAE-SephadexG-100柱層析純化。
2.2Ngb蛋白多克隆抗體與生物素的交聯(lián)及純化參照參考文獻(xiàn)及試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,詳細(xì)過(guò)程如下:①配制pH8.6、0.05mol/L硼酸鹽緩沖液及含0.1％BSA的pH7.5PBS。②將純化的Ngb蛋白多克隆抗體置硼酸鹽緩沖液中,4℃透析過(guò)夜,并用該緩沖液調(diào)節(jié)抗體濃度至1mg/mL。③進(jìn)行下列操作前將所有試劑從4℃移至室溫平衡2h。④按每毫升抗體加80μg生物素計(jì)算加入生物素制劑,反應(yīng)液的總體積不要超過(guò)2.5mL,置室溫持續(xù)搖動(dòng)1h,使Ngb蛋白多克隆抗體與生物素充分交聯(lián)。⑤于室溫用35mL含0.1％BSApH7.5的PBS平衡SephadexG-25層析柱。加上述反應(yīng)樣品2.5mL于層析柱上,并用含0.1％BSApH7.5的PBS洗脫,每管1mL收集洗脫液,測(cè)每管A280吸收值。收集第一洗脫峰,加入0.2％NaN3,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例3一種利用雙抗夾心法定量測(cè)定腦紅蛋白的方法
一種利用雙抗夾心法定量測(cè)定腦紅蛋白的方法，所述檢測(cè)方法是按以下步驟進(jìn)行的：
1)包被：將Ngb單克隆抗體用pH9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋至10μg/ml，每孔加入100μl，37℃孵育4h后按照如下方法洗滌，棄去孔中液體，用PBST洗4次，每次2分鐘，甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干；
2)封閉：每孔加200μl含5％BSA的PBS封閉液封閉，37℃孵育4h按照如下方法進(jìn)行洗滌，PBST洗2次，每次2分鐘，甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干；
3)捕獲抗原：抗原稀釋至合適濃度，每孔100μl加入到對(duì)應(yīng)孔中，陰性對(duì)照加100μl PBS，37℃孵育1h，按照步驟1)所述方法洗滌；
4)加入二抗：將生物素化的Ngb多克隆抗體稀釋至2μg/ml，每孔各加100μl，37℃孵育1h，按照步驟2)所述方法洗滌；
5)酶標(biāo)二抗：將購(gòu)買(mǎi)的商業(yè)化HRP-Avidin稀釋1.5萬(wàn)倍，每孔各加100μl，37℃孵育50min，按照步驟1)所述方法洗滌；
6)顯色檢測(cè)：每孔加100μl TMB，室溫或37℃反應(yīng)5-30min，顯色完畢后，每孔立即加入100μl 2M H2SO4終止反應(yīng)，于20min內(nèi)檢測(cè)在450nm單波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值。
實(shí)例驗(yàn)證：將Ngb蛋白進(jìn)行梯度濃度稀釋?zhuān)⒃O(shè)置陰性對(duì)照。按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)，在450nm單波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，結(jié)果表明該方法靈敏度可以達(dá)到0.1μg/ml，檢測(cè)結(jié)果的XY散點(diǎn)圖表明在450nm單波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值與蛋白濃度有很好的線性關(guān)系，結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)性好。用此方法可以檢測(cè)Ngb蛋白，為Ngb蛋白的定量檢測(cè)及相關(guān)檢測(cè)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。