本發(fā)明屬于生物細(xì)胞成像技術(shù)研究領(lǐng)域，具體涉及一種共光路干涉相位顯微一次成像系統(tǒng)及方法。

背景技術(shù)：

在觀測的生物樣品中，如活細(xì)胞，可以當(dāng)成是透明的來處理，并且這些細(xì)胞通常表現(xiàn)為相位物體。為了能夠清楚的觀測到這些相位物體，通常的做法是將相位信息轉(zhuǎn)換為強(qiáng)度分布，這也就導(dǎo)致了相位顯微成像的出現(xiàn)。在最近的十幾年中，由于各種應(yīng)用定量相位顯微成像的技術(shù)被不斷提出，這就為研究類似于生物細(xì)胞的相位物體的組織結(jié)構(gòu)和動力學(xué)行為提供了極為重要的研究手段，而相位顯微成像技術(shù)基本上是應(yīng)用光的干涉原理來工作，所以也可以稱此類技術(shù)為干涉相位顯微成像技術(shù)。這些技術(shù)包括離軸干涉、同軸干涉和輕微離軸干涉。

對相位物體的光學(xué)檢測技術(shù)主要基于干涉原理。干涉顯微從結(jié)構(gòu)上可劃分為：物光與參考光分離的干涉顯微和物光與參考光共路的干涉顯微。物、參分離的干涉顯微方法主要有：Michelson干涉顯微；Linnik干涉顯微和Mach-Zehnder干涉顯微等。Michelson干涉顯微的基本原理是，入射光透過顯微物鏡到分光鏡被分成兩束光，一束為投射到參考鏡的參考光，另一束為透射到樣本表面的物光，兩束光經(jīng)過反射，并在顯微物鏡的視場上發(fā)生干涉。該結(jié)構(gòu)的特點是，物光與參考光經(jīng)過同一個顯微物鏡，兩束光不會由于物鏡的差異而產(chǎn)生光程差。但是，顯微物鏡與樣本之間加入了分光鏡，這樣就使顯微物鏡的工作距離比另兩種裝置更長，進(jìn)而限制了物鏡的放大倍數(shù)，同樣也限制了數(shù)值孔徑的大小，這就直接導(dǎo)致了儀器的橫向分辨率降低。Linnik干涉顯微的基本結(jié)構(gòu)是它的物光和參考光分別有一個顯微物鏡，光線透過顯微物鏡就直接到樣品表面，因為其與樣品表面之間沒有其它光學(xué)元件，所以該裝置的放大倍數(shù)可以很大，工作距離可以很短，并且能夠達(dá)到0.5μm的橫向分辨率。但是該裝置物光和參考光的顯微物鏡的差異會產(chǎn)生額外的光程差，這將影響真實的觀測結(jié)果。Mach-Zehnder干涉顯微的基本結(jié)構(gòu)是該裝置只使用了一個顯微物鏡，參考鏡則放置在主光路中，這樣就使得物光光路和參考光路的工作條件非常接近，結(jié)構(gòu)設(shè)計上也更加緊湊，同時可以排除許多干擾因素。基于這些主要顯微成像原理，國內(nèi)外科學(xué)家進(jìn)行了拓展研究，如：專利技術(shù)CN 102914258 A基于正交雙光柵的同步移相干涉顯微檢測裝置及檢測方法，該技術(shù)利用平行雙光柵將正交偏振的物光和參考光分束，結(jié)合偏振調(diào)制通過一次曝光獲得兩幅相移干涉圖。雖然該方法可以實現(xiàn)實時測量，但由于采用離軸光路不能充分利用CCD的功能，且物參光間若存在夾角將會使數(shù)據(jù)處理的工作變得復(fù)雜；又如專利CN 103115582 A基于受激輻射的邁克爾遜熒光干涉顯微測量裝置，該發(fā)明通過鍍膜改變被測面的表面特性，保證測量光經(jīng)被測面反射后能夠返回探測系統(tǒng)，解決了高NA和高斜率表面檢測的難題，但是該光路本身具有橫向分辨率較低的缺陷，且儀器的成本較高。并且在物光與參考光分離的干涉顯微中，環(huán)境的擾動會對物光與參考光造成不同的影響，從而影響兩者之間的光程差的穩(wěn)定性，最終對測量精度產(chǎn)生影響。

在共光路實驗裝置中，可以通過調(diào)節(jié)分光鏡的分光層與光軸之間的夾角大小實現(xiàn)物光和參考光之間的同軸干涉或離軸干涉。物、參共路干涉顯微主要有：Fizeau干涉顯微、澤尼克相襯干涉顯微、剪切干涉顯微和點衍射相位顯微技術(shù)等。斐索干涉顯微Fizeau interferometer是利用準(zhǔn)直的平行光在樣品表面反射后與入射光發(fā)生干涉，通過記錄的等厚干涉條紋的形狀分布反映被檢樣品表面的形貌分布。澤尼克相襯干涉顯微原理是采用環(huán)狀光來照明樣品,同時采用環(huán)狀相位掩模板來延遲零頻分量的相位,從而使被測樣品的相位信息變成強(qiáng)度信息。在相襯顯微方法中所用的部分相干的環(huán)狀光束照明大大降低了成像中的相干噪聲,且提高了顯微鏡的橫向分辨率。剪切干涉法是通過某種元件，將一個空間相干的波面分成兩個完全相同或相似的波面，二者彼此間產(chǎn)生小的空間位移。因為兩個波面上各點相干，在重疊區(qū)域會形成一組干涉條紋，通過處理該干涉條紋就可以獲得原始波面的信息。點衍射干涉術(shù)的基本原理是當(dāng)包含樣品信息的入射光波經(jīng)過聚焦透鏡后，根據(jù)透鏡的傅立葉變換特性，該光束的頻譜出現(xiàn)在聚焦透鏡的后焦平面且零頻分量位于頻譜面的中央，而高頻分量分布于零頻分量的周圍。如在專利CN 104034257 A一種菲索型準(zhǔn)共光路結(jié)構(gòu)的同步相移干涉測量裝置及方法，該技術(shù)解決了同步相移干涉用于共光路干涉系統(tǒng)的難題，使系統(tǒng)中光學(xué)元件所存在的應(yīng)力雙折射效應(yīng)所造成的相位測量誤差大大降低；又如專利CN 102221327 A基于澤尼克相襯成像的相移干涉顯微裝置及方法，該發(fā)明解決了現(xiàn)有澤尼克相襯成像只能用于定性觀察的局限性，同時克服了現(xiàn)有干涉顯微方法對環(huán)境振動較敏感穩(wěn)定性差、相干噪聲高、橫向分辨率低等技術(shù)問題。但是這些干涉顯微裝置在使用過程中需要較多的光學(xué)元器件，特別是顯微鏡系統(tǒng)，實驗成本較高，且對使用人員的專業(yè)素養(yǎng)要求高，所以應(yīng)用門檻較高。

本發(fā)明是基于共光路的干涉顯微，所以其優(yōu)點在于它的抗干擾能力強(qiáng)，不會產(chǎn)生額外的光程差，而與其他共光路裝置相比，本發(fā)明的裝置結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉，且操作方便，可以實現(xiàn)同軸干涉、離軸干涉和輕微離軸干涉。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述問題提供一種共光路干涉相位顯微一次成像系統(tǒng)及方法，使該裝置能同時適用于同軸與離軸干涉，也包括輕微離軸干涉，在單次曝光下采集到干涉圖，經(jīng)計算機(jī)處理后可以實現(xiàn)相位物體快速相位顯微成像。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種共光路干涉相位顯微一次成像系統(tǒng)，包括激光器、中性可調(diào)衰減器、擴(kuò)束準(zhǔn)直器、半透半反鏡、視場光闌、非偏振分光棱鏡、反射載物臺、樣品、顯微物鏡、第三透鏡、CCD和計算機(jī)；

所述激光器、中性可調(diào)衰減器、擴(kuò)束準(zhǔn)直器、半透半反鏡依次放置在同一光路上；所述視場光闌非偏振分光棱鏡、反射載物臺依次放置在半透半反鏡的垂直下方，所述樣品放置在反射載物臺上的一側(cè)；所述半透半反鏡的鏡面與水平方向成45°；用于分光的非偏振分光棱鏡的分光層與水平方向垂直；可調(diào)反射載物臺的平面與水平面平行；所述顯微物鏡、第三透鏡和CCD依次放置在半透半反鏡的垂直上方，計算機(jī)與CCD電連接；

所述激光器發(fā)出的水平方向的光束，向前傳輸經(jīng)過中性可調(diào)衰減器調(diào)節(jié)到合適的光強(qiáng)，再經(jīng)過擴(kuò)束準(zhǔn)直器擴(kuò)束準(zhǔn)直后，向半透半反鏡傳輸，激光經(jīng)過半透半反鏡的反射面改向為豎直向下的光束，激光通過視場光闌把激光束調(diào)節(jié)到合適的大小后傳輸向非偏振分光棱鏡，非偏振分光棱鏡把激光束平均分為兩束豎直向下的平行光，這兩束光照射向反射載物臺和載物臺上的樣品；樣品光與參考光通過反射載物臺全反射向非偏振分光棱鏡，又經(jīng)過非偏振分光棱鏡的合束并產(chǎn)生干涉，通過半透半反鏡，由其后的的顯微物鏡放大，再由第三透鏡準(zhǔn)直為平行光，最終在CCD上形成相移干涉圖，并傳輸、顯示在計算機(jī)上。

上述方案中，所述半透半反鏡用石英玻璃制成，分光面為鍍膜半反射、半透射的迎光束面，各為入射光強(qiáng)度的50％。

上述方案中，所述載物臺為一個角度可調(diào)的全反鏡，光軸與非偏振分光棱鏡的分光層之間的夾角可通過載物臺調(diào)節(jié)。

上述方案中，所述視場光闌可調(diào)節(jié)光束的大小，使干涉圖像的大小不超過CCD的記錄靶面。

上述方案中，所述擴(kuò)束準(zhǔn)直器包括第一透鏡和第二透鏡。

一種利用所述的共光路干涉相位顯微一次成像系統(tǒng)進(jìn)行成像的方法，包括以下步驟：

步驟S1、所述激光束發(fā)出的水平方向的光束，向前傳輸經(jīng)過中性可調(diào)衰減器調(diào)節(jié)至合適光強(qiáng)后，利用擴(kuò)束準(zhǔn)直器將照明光束擴(kuò)束準(zhǔn)直為大小合適的平行光；

步驟S2、光束經(jīng)半透半反鏡反射為豎直向下并向非偏振分光棱鏡傳輸，在這兩個裝置中間放置一個大小合適的視場光闌使得成像區(qū)域的大小不超過CCD記錄靶面的面積，又經(jīng)非偏振分光棱鏡分光為物光和參考光兩束豎直向下的光束，照射到反射載物臺上；前面所述的物光照射到樣品上作為樣品光，而參考光則被反射載物臺全反射后直接原路返回；

步驟S3、物參反射光束經(jīng)過非偏振分光棱鏡合束后，物光和參考光之間發(fā)生干涉，并原路返回經(jīng)過視場光闌和半透半反鏡，再經(jīng)過顯微物鏡放大后，由第三透鏡準(zhǔn)直為平行光，最終在CCD上形成相移干涉圖，并傳輸?shù)接嬎銠C(jī)里，經(jīng)計算機(jī)處理后顯示。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明通過采用非偏振分光棱鏡對激光束進(jìn)行分光，該分光裝置結(jié)構(gòu)簡單，易于操作；

2、本發(fā)明采用差分干涉光路保證了本發(fā)明系統(tǒng)的可靠性與穩(wěn)定性；

3、本發(fā)明系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉、實驗操作方便；

4、本發(fā)明中外界環(huán)境的擾動對干涉儀中的物光和參考光造成相同的影響，因而在最終記錄時這些外界因素的影響將被相互抵消，從而使得該類干涉儀的抗干擾能力增強(qiáng)；

5、本發(fā)明中顯微物鏡位于干涉系統(tǒng)之后，可減少相位噪聲。因此，本發(fā)明系統(tǒng)應(yīng)用面廣，具有很好的實用價值。

附圖說明

圖1是本發(fā)明一實施方式的共光路干涉相位顯微一次成像系統(tǒng)及方法對應(yīng)的光路示意圖。

圖中：1：激光器；2：中性可調(diào)衰減器；3：擴(kuò)束準(zhǔn)直器；4：半透半反鏡；5：視場光闌；6：非偏振分光棱鏡；7：反射載物臺；8：樣品；9：顯微物鏡；10：第三透鏡；11：CCD；12：計算機(jī)；R：參考光束；O：樣品光束。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。

本發(fā)明是一種基于物、參共光路的干涉顯微成像裝置及一次成像的方法，基于差分干涉光路，采用非偏振分光鏡把激光分為物光與參考光兩束平行光，再利用反射載物臺全反射物光與參考光，物光和參考光經(jīng)非偏振分光棱鏡合束后以共光路的方式傳播，后經(jīng)顯微物鏡放大，最終被CCD相機(jī)采集并傳輸?shù)接嬎銠C(jī)里，通過相應(yīng)的軟件進(jìn)行樣品圖像的后處理。本發(fā)明可以通過調(diào)整反射載物臺的角度實現(xiàn)現(xiàn)有的光路干涉成像系統(tǒng)，其中包括離軸干涉、同軸干涉和輕微離軸干涉。本發(fā)明在相位顯微方面具有廣泛的實用價值與應(yīng)用前景，特別是在生物細(xì)胞形態(tài)識別應(yīng)用領(lǐng)域。

圖1所示為本發(fā)明所述共光路干涉相位顯微一次成像系統(tǒng)及方法的一種實施方式，所述一種共光路干涉相位顯微一次成像系統(tǒng)，包括激光器1、中性可調(diào)衰減器2、擴(kuò)束準(zhǔn)直器3、半透半反鏡4、視場光闌5、非偏振分光棱鏡6、反射載物臺7、樣品8、顯微物鏡9、第三透鏡10、CCD11和計算機(jī)12。

所述激光器1、中性可調(diào)衰減器2、擴(kuò)束準(zhǔn)直器3、半透半反鏡4依次放置在同一光路上；所述視場光闌5非偏振分光棱鏡6、反射載物臺7依次放置在半透半反鏡4的垂直下方，所述樣品8放置在反射載物臺7上的一側(cè)；所述半透半反鏡4的鏡面與水平方向成45°；用于分光的非偏振分光棱鏡6的分光層與水平方向垂直；可調(diào)反射載物臺7的平面與水平面平行；所述顯微物鏡9、第三透鏡10和CCD11依次放置在半透半反鏡4的垂直上方，計算機(jī)12與CCD11電連接。

所述激光器1發(fā)出的水平方向的光束，向前傳輸經(jīng)過中性可調(diào)衰減器2調(diào)節(jié)到合適的光強(qiáng)，再經(jīng)過由第一透鏡和第二透鏡組成的擴(kuò)束準(zhǔn)直器3擴(kuò)束準(zhǔn)直后，向半透半反鏡4傳輸，激光經(jīng)過半透半反鏡4的反射面改向為豎直向下的光束，激光通過視場光闌5把激光束調(diào)節(jié)到合適的大小后傳輸向非偏振分光棱鏡6，非偏振分光棱鏡6把激光束平均分為兩束豎直向下的平行光，這兩束光照射向反射載物臺7和載物臺上的樣品8；樣品光與參考光通過反射載物臺7全反射向非偏振分光棱鏡6，又經(jīng)過非偏振分光棱鏡6的合束并產(chǎn)生干涉，通過半透半反鏡4，由其后的的顯微物鏡9放大，再由第三透鏡10準(zhǔn)直為平行光，最終在CCD11上形成相移干涉圖，并傳輸、顯示在計算機(jī)12上。

所述半透半反鏡4用石英玻璃制成，分光面為鍍膜半反射、半透射的迎光束面，各為入射光強(qiáng)度的50％，并與水平方向成45°角，實現(xiàn)把光束由水平反射為豎直向下。

所述載物臺7為一個角度可調(diào)的全反鏡，使光軸與非偏振分光棱鏡6的分光層之間的夾角可調(diào)，可實現(xiàn)同軸、離軸和輕微離軸干涉的光路調(diào)節(jié)。

所述視場光闌5是用于調(diào)節(jié)光束的大小，使最終形成的干涉圖像的大小不超過CCD11的記錄靶面。

本發(fā)明還提供一種利用所述的共光路干涉相位顯微一次成像系統(tǒng)進(jìn)行成像的方法，包括以下步驟：

步驟S1、所述激光束1發(fā)出的水平方向的光束，向前傳輸經(jīng)過中性可調(diào)衰減器2調(diào)節(jié)至合適光強(qiáng)后，利用擴(kuò)束準(zhǔn)直器3將照明光束擴(kuò)束準(zhǔn)直為大小合適的平行光后照明樣品；

步驟S2、光束經(jīng)半透半反鏡4反射為豎直向下并向非偏振分光棱鏡6傳輸，在這兩個裝置中間放置一個大小合適的視場光闌5使得成像區(qū)域的大小不超過CCD記錄靶面的面積，又經(jīng)非偏振分光棱鏡6分光為物光和參考光兩束豎直向下的光束，照射到反射載物臺7上；前面所述的物光照射到樣品8上作為樣品光，而參考光則被反射載物臺7全反射后直接原路返回；

步驟S3、物參反射光束經(jīng)過非偏振分光棱鏡6合束后，物光和參考光之間發(fā)生干涉，并原路返回經(jīng)過視場光闌5和半透半反鏡4，再經(jīng)過顯微物鏡9放大后，由第三透鏡10準(zhǔn)直為平行光，最終照射到CCD 11的記錄靶面上，并將數(shù)據(jù)傳輸?shù)接嬎銠C(jī)12里，經(jīng)由相應(yīng)的軟件處理后在計算機(jī)12上顯示。

本發(fā)明的工作原理如下：

激光束1沿水平方向傳輸，經(jīng)過中性可調(diào)衰減器2調(diào)節(jié)至合適光強(qiáng)后，利用擴(kuò)束準(zhǔn)直器3將照明光束擴(kuò)束準(zhǔn)直為大小合適的平行光后照明樣品，光束經(jīng)半透半反鏡4反射為豎直向下傳輸向非偏振分光棱鏡6，在這中間放置一個大小合適的視場光闌使得成像區(qū)域的大小不超過CCD記錄靶面的面積，經(jīng)非偏振分光棱鏡6分光為物光和參考光兩束豎直向下的光束，照射到反射載物臺7上；物光照射到樣品8上作為樣品光，而參考光則被反射載物臺7全反射后直接原路返回；物參反射光束經(jīng)過非偏振分光棱鏡6合束后，物光和參考光之間發(fā)生干涉，并原路返回經(jīng)過視場光闌5和半透半反鏡4，再經(jīng)過顯微物鏡9放大后，由第三透鏡10準(zhǔn)直為平行光，最終照射到CCD 11的記錄靶面上，CCD 11將數(shù)據(jù)傳輸?shù)接嬎銠C(jī)12里，最后通過對應(yīng)的軟件就可在計算機(jī)12上實現(xiàn)定量相位成像。在整個裝置中反射載物臺7通過旋轉(zhuǎn)可改變光束光軸的方向，由此可根據(jù)需要，觀察采集到的干涉圖像來調(diào)整反射載物臺7的角度，實現(xiàn)自由切換同軸干涉、離軸干渉和輕微離軸干涉。

應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書是按照各個實施例描述的，但并非每個實施例僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。

上文所列出的一系列的詳細(xì)說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實施例的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實施例或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。