本發(fā)明涉及一種用于檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中驢皮源成分含量的組合物、試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明屬于醫(yī)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

阿膠作為一種傳統(tǒng)名貴中藥，已有數(shù)千年的食用歷史，具有補(bǔ)血滋陰，潤燥，止血的功效。純正的阿膠必需來自百分百的驢皮，方能保證產(chǎn)品的功效。從原料生物分類學(xué)上看，驢屬于奇蹄目馬科驢屬，包括非洲野驢、藏野驢、中亞野驢、家驢等品種。其中中國飼養(yǎng)的家驢包括關(guān)中驢、德州驢、廣靈驢、佳米驢、泌陽驢、淮陽驢、慶陽驢、華北驢、新疆驢、西南驢等眾多地方品種。由于驢皮的供應(yīng)也逐年緊張，價(jià)格不斷上漲，市場上出現(xiàn)了很多不法分子，在生產(chǎn)阿膠時(shí)，部分甚至全部用各種其他動物皮包括馬皮、騾皮、牛皮、豬皮等來取代驢皮進(jìn)行熬制，有的甚至直接摻入工業(yè)明膠。這些偽品的存在嚴(yán)重干擾了市場正常秩序，損害消費(fèi)者利益，影響正規(guī)產(chǎn)品的信譽(yù)。

阿膠經(jīng)長時(shí)間高溫蒸煮濃縮而成，主要成分非常相近且不同廠家的生產(chǎn)工藝存有差異，采用紅外、近紅外、X-衍射、HPLC等方法對阿膠進(jìn)行真?zhèn)舞b別常存在判斷不準(zhǔn)確、缺乏足夠說服力等。目前已報(bào)道的鑒別阿膠真?zhèn)伪容^權(quán)威的方法主要是DNA分子鑒定方法和檢測特征性肽段的液質(zhì)聯(lián)用方法。已報(bào)道的這兩種方法都無法對阿膠中驢皮源成分進(jìn)行比較準(zhǔn)確的定量檢測，而是通過檢測阿膠中是否含有驢的成分，并排除其他動物源成分來判斷阿膠真?zhèn)?；但阿膠的摻假可能會五花八門，因此需要排除的動物源成分會是多種多樣，利用排除法來鑒別阿膠真?zhèn)未嬖谥匾毕?，其?zhǔn)確性和可靠性會大打折扣，這種情況非常不利于對市場阿膠產(chǎn)品的監(jiān)管。利用驢皮源成分含量來判斷阿膠真?zhèn)危蓮母旧舷拗瓢⒛z的造假行為。已報(bào)道的文獻(xiàn)中，對驢皮源性成分檢測，基本都沒有排除馬皮源性成分，因此雖宣稱為驢皮源成分，實(shí)則為驢與馬共有。

因此，目前迫切需要提出一種能夠快速、準(zhǔn)確檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中驢皮源成分含量的方法，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對含驢皮源成分的產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種能夠快速、準(zhǔn)確鑒定膠類中藥及其復(fù)方制劑中驢皮源成分含量的組合物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種能夠快速、準(zhǔn)確鑒定膠類中藥及其復(fù)方制劑中驢皮源成分含量的試劑盒。

本發(fā)明的再一個(gè)目的在于，提供一種能夠快速、準(zhǔn)確鑒定膠類中藥及其復(fù)方制劑中驢皮源成分含量的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一種用于檢測動物膠及其復(fù)方制劑中驢皮源成分含量的組合物，所述組合物由多肽I、多肽II、多肽III以及對照品檢測基質(zhì)組成，其特征在于：所述多肽I的氨基酸序列為Gly-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Arg(SEQ ID NO.1所示)，多肽II的氨基酸序列為Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Pro-Hyp-Gly-Glu-Arg(SEQ ID NO.2所示)，多肽III的氨基酸序列為Gly-Val-Val-Gly-Pro-Gln-Gly-Ala-Arg(SEQ ID NO.3所示)，對照品檢測基質(zhì)為魚皮膠。

含有所述組合物的檢測試劑盒也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提出了一種用于檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中驢皮源成分含量的方法，具體包括如下步驟：

(1)對照品溶液的制備

1)基質(zhì)溶液的制備：將稱量好的對照品檢測基質(zhì)置于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，加NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度；

2)對照品母液的制備：將稱量好的對照品檢測基質(zhì)置于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，將稱量好的的多肽I、多肽II和多肽III加入該量瓶中，用NH₄HCO₃溶液溶解并稀釋至刻度；

3)對照品溶液制備：以步驟1)制得的基質(zhì)溶液為溶劑，將步驟2)制得的對照品母液稀釋，微孔濾膜過濾，續(xù)濾液中加胰蛋白酶溶液，酶解；

(2)待檢測樣品溶液的制備

取待測樣品，重量記為N₁，加入三氯乙酸溶液，超聲、靜置、離心后去除上清液，沉淀用丙酮洗滌、干燥后稱重，重量記為N₂，稱取沉淀于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，續(xù)濾液中加入胰蛋白酶溶液，酶解；

(3)液質(zhì)聯(lián)用儀檢測

分別取對照品溶液、待檢測樣品溶液放入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測，選擇m/z393.4→499.3、643.3，m/z702.8→725.4、838.4，m/z421.0→684.4、528.3作為檢測離子對進(jìn)行MRM掃描，其中選擇m/z393.4→499.3、m/z702.8/725.4、m/z421.0→684.4分別作為多肽I、多肽II和多肽III的定量離子對進(jìn)行定量檢測；

(4)樣品中驢皮源成分含量的計(jì)算

以對照品溶液的各多肽的含量為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，各多肽的線性相關(guān)系數(shù)R≥0.9992，由此計(jì)算出樣品中多肽I、多肽II和多肽III的含量，待檢測樣品中多肽I的含量記為M₁、多肽II的含量記為M₂、多肽III的含量記為M₃，然后，按下式計(jì)算出各樣品中驢皮源成分的含量：

驢皮源成分的含量(％)＝(M1/392.4–M2/1403.5)×525/M3×N₂/N₁×100％。

本發(fā)明的用于檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中驢皮源成分含量的方法，優(yōu)選的，步驟(1)及步驟(2)所述的酶解溫度為37℃。

本發(fā)明的用于檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中驢皮源成分含量的方法，優(yōu)選的，步驟(3)中液質(zhì)聯(lián)用儀檢測的液相條件為：C₁₈反相色譜柱，流動相A為0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：0→40min，流動相A 100％→50％，流動相B 0％→50％，質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測。

優(yōu)選的，所述膠類中藥為阿膠、黃明膠、龜甲膠、鹿角膠或其他膠類中藥。

再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的組合物或所述的試劑盒在檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中的驢皮源成分含量中的應(yīng)用。

直接對膠類中藥中驢皮源成分進(jìn)行準(zhǔn)確的含量檢測，首先要找出能標(biāo)志驢皮源成分且在不同生產(chǎn)工藝的純品阿膠中含量相對穩(wěn)定的物質(zhì)，尤其要去除與驢親緣關(guān)系較近的馬、騾等的偽品成分；其次阿膠的成分非常復(fù)雜，檢測時(shí)信號不穩(wěn)定，因此該物質(zhì)要滿足在檢測時(shí)具有較高的信號響應(yīng)、較低的噪音及其他物質(zhì)干擾，還應(yīng)考慮檢測信號的穩(wěn)定性；第三需要設(shè)立合適的對照品等。

對此，本發(fā)明通過選取驢皮源性特征性多肽，并采用多肽I的檢測值減去多肽II的檢測值，并利用多肽III的檢測值來修正檢測偏差，從而實(shí)現(xiàn)對膠類中藥及其復(fù)方制劑中驢皮源成分的含量檢測。實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的方法，能夠準(zhǔn)確地檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中驢皮源成分的含量，且操作簡單，在膠類中藥產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中：

圖1是對照品溶液MRM掃描模式下選擇離子對m/z393.4→499.3、m/z702.8→725.4、m/z421.0→684.4監(jiān)測的質(zhì)譜圖；

圖2是各種純品膠類中藥MRM掃描模式下選擇離子對m/z393.4→499.3、m/z702.8→725.4、m/z421.0→684.4監(jiān)測的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例進(jìn)行詳細(xì)描述。優(yōu)選實(shí)例中沒有注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或制造廠商所建議的條件進(jìn)行。

實(shí)施例1

1、材料和試劑

材料：各種純品膠類中藥，包括阿膠、馬皮膠、黃明膠、豬皮膠、羊皮膠、龜甲膠、鹿角膠、魚皮膠(對照品檢測基質(zhì))，分別用驢皮、馬皮、牛皮、豬皮、羊皮、龜甲、鹿角、魚皮煎煮獲得。

多肽I、多肽II、多肽III交由生物公司合成。

試劑：碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純)。

2、檢測方法

(1)對照品溶液的制備

1)基質(zhì)溶液的制備

稱取0.50g對照品檢測基質(zhì)于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻；

2)對照品母液的制備

將稱量好的0.05g對照品檢測基質(zhì)置于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，稱取15.3mg的多肽I、27.4mg的多肽II和17.3mg的多肽III于該量瓶中，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解并稀釋至刻度，搖勻；

3)對照品溶液的制備

采用分步稀釋的方法，以步驟1)制得的基質(zhì)溶液為溶劑，將步驟2)制得的對照品母液稀釋1000倍，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h；

(2)待測樣品溶液的制備

稱量待測純品膠類中藥樣品0.5g(記為N1)，加入30％(w/w)的三氯乙酸溶液5ml，超聲15min，4℃靜置30min，離心后去除上清液，沉淀用丙酮洗滌、干燥后稱重(記為N2)，稱取0.05g干燥后的沉淀物于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解后，用1％(w/w)的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

(3)液質(zhì)聯(lián)用儀檢測

將步驟(1)制得的對照品溶液、步驟(2)制得的待測樣品溶液分別取5μl放入液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，液相條件為：C₁₈反相色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流動相A為0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：0→40min，流動相A 100％→50％，流動相B 0％→50％。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測，選擇m/z393.4→499.3、643.3，m/z702.8→725.4、838.4，m/z421.0→684.4、528.3作為檢測離子對進(jìn)行MRM掃描，其中選擇m/z393.4→499.3、m/z702.8→725.4、m/z421.0→684.4分別作為多肽I、多肽II和多肽III的定量離子對，進(jìn)行定量檢測；

(4)純品膠類中藥中驢皮源成分含量的計(jì)算

圖1是對照品溶液MRM掃描模式下選擇離子對m/z393.4→499.3、m/z702.8→725.4、m/z421.0→684.4監(jiān)測的質(zhì)譜圖；圖2是各種純品膠類中藥MRM掃描模式下選擇離子對m/z393.4→499.3、m/z702.8→725.4、m/z421.0→684.4監(jiān)測的質(zhì)譜圖。

以對照品溶液的各多肽的含量為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，各多肽的線性相關(guān)系數(shù)R≥0.9992，由此計(jì)算出純品膠類中藥中多肽I、多肽II和多肽III的含量，從而計(jì)算出純品膠類中藥中驢皮源成分的含量，待檢測純品膠類中藥中多肽I的含量記為M1、多肽II的含量記為M2、多肽III的含量記為M3，按下式計(jì)算出純品膠類中藥中驢皮源成分的含量：

驢皮源成分的含量(％)＝(M1/392.4–M2/1403.5)×525/M3×N₂/N₁×100％

其中，各樣品中驢皮源成分的含量：

阿膠中驢皮源成分的含量(％)＝525/(0.2411/392.4–0/1403.5)×525/0.2601×0.4035/0.5012×100％＝99.84％

馬皮膠中驢皮源成分的含量(％)＝(0/392.4–0/1403.5)×525/0.2580×0.4012/0.5008×100％＝0％

黃明膠中驢皮源成分的含量(％)＝(0.2506/392.4–0.8833/1403.5)×525/0.2593×0.4028/0.5021×100％＝1.51％≈0％

豬皮膠中驢皮源成分的含量(％)＝(0/392.4–0/1403.5)×525/0.2670×0.4068/0.5022×100％＝0％

羊皮膠中驢皮源成分的含量(％)＝(0.2442/392.4–0.8712/1403.5)×525/0.2606×0.4038/0.5012×100％＝0.26％≈0％

龜甲膠中驢皮源成分的含量(％)＝(0/392.4–0/1403.5)×525/0.2488×0.4056/0.5008×100％＝0％

鹿角膠中驢皮源成分的含量(％)＝(0.2432/392.4–0.8706/1403.5)×525/0.2567×0.4066/0.5022×100％＝－0.09％≈0％

上述計(jì)算結(jié)果表明：阿膠中驢皮源成分的含量100％，馬皮膠、黃明膠、豬皮膠、羊皮膠、龜甲膠、鹿角膠中驢皮源成分的含量為0％。這與實(shí)際情況相符，表明該方法能檢測膠類中藥中驢皮源成分的含量。

實(shí)施例2

1、材料和試劑

材料：混合膠樣品：由實(shí)施例1中的純品膠樣品分別加入不同質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的阿膠制成，包括含15％阿膠的龜甲膠、含30％阿膠的龜甲膠、含30％阿膠的鹿角膠。

復(fù)方膠類中藥制劑：用復(fù)方阿膠漿生產(chǎn)工序中的植物藥材提取濃縮溶液，分別加入上述混合膠樣品，按照每9g植物藥材提取濃縮溶液加入1.0g混合膠樣品，制成3個(gè)復(fù)方膠類中藥制劑，分別命名為制劑1、制劑2以及制劑3，驢皮源成分含量分別為1.5％、3.0％、3.0％。

多肽I、多肽II、多肽III，魚皮膠(對照品檢測基質(zhì))按照實(shí)施例1方法制備。

試劑：碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純)。

2、檢測方法

(1)對照品溶液的制備

1)基質(zhì)溶液的制備

稱取0.50g對照品檢測基質(zhì)于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻；

2)對照品母液的制備

將稱量好的0.05g對照品檢測基質(zhì)置于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，稱取15.3mg的多肽I、27.4mg的多肽II和17.3mg的多肽III于該量瓶中，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解并稀釋至刻度，搖勻；

3)對照品溶液的制備

采用分步稀釋的方法，以步驟1)制得的基質(zhì)溶液為溶劑，將步驟2)制得的對照品母液分別稀釋500倍、1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、10000倍，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h；

(2)待測樣品溶液的制備

稱量待測膠類中藥樣品5.0g(記為N1)，加入30％(w/w)的三氯乙酸溶液5ml，超聲15min，4℃靜置30min，離心后去除上清液，沉淀用丙酮洗滌、干燥后稱重記為N2，稱取0.05g干燥后的沉淀物于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解后，用1％(w/w)的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

(3)液質(zhì)聯(lián)用儀檢測

將步驟(1)制得的對照品溶液、步驟(2)制得的待測樣品溶液分別取5μl放入液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，液相條件為：C₁₈反相色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流動相A為0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：0→40min，流動相A 100％→50％，流動相B 0％→50％。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測，選擇m/z393.4→499.3、643.3，m/z702.8→725.4、838.4，m/z421.0→684.4、528.3作為檢測離子對進(jìn)行MRM掃描，其中選擇m/z393.4→499.3、m/z702.8→725.4、m/z421.0→684.4分別作為多肽I、多肽II和多肽III的定量離子對，進(jìn)行定量檢測；

(4)膠類中藥中驢皮源成分含量的計(jì)算

以對照品溶液的各多肽的含量為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，各多肽的線性相關(guān)系數(shù)R≥0.9992，由此計(jì)算出膠類中藥中多肽I、多肽II和多肽III的含量，從而計(jì)算出膠類中藥中驢皮源成分的含量，待檢測膠類中藥中多肽I的含量記為M1、多肽II的含量記為M2、多肽III的含量記為M3，按下式計(jì)算出膠類中藥中驢皮源成分的含量：

其中，各樣品中驢皮源成分的含量：

制劑1樣品中驢皮源成分的含量(％)＝(0.0322/392.4–0/1403.5)×525/0.2296×0.4016/5.00×100％＝1.51％

制劑2樣品中驢皮源成分的含量(％)＝(0.0728/392.4–0/1403.5)×525/0.2436×0.4041/5.00×100％＝3.23％

制劑3樣品中驢皮源成分的含量(％)＝(0.2512/392.4–0.6326/1403.5)×525/0.2460×0.4051/5.00×100％＝3.28％

上述計(jì)算結(jié)果表明：利用本發(fā)明的檢測方法得到的制劑1-3的驢皮源檢測含量與實(shí)際情況相符，表明該方法能準(zhǔn)確檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中驢皮源成分的含量。

綜上所述，利用本發(fā)明公開的三個(gè)多肽以及對照品檢測基質(zhì)，采用液質(zhì)聯(lián)用儀，能準(zhǔn)確檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中驢皮源成分的含量。

需要說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明作的各種改動或修改而不背離本發(fā)明的精神與范圍，這些等價(jià)形式同樣落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

序列表

<110> 東阿阿膠股份有限公司

<120>一種用于檢測膠類中藥及其復(fù)方制劑中驢皮源成分含量的組合物、試劑盒及其檢測方法

<130> KLPI161258

<160> 3

<170>PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 多肽I

<400> 1

Gly Ala Thr Gly Pro Ala Gly Val Arg 9

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 多肽II

<400> 2

Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly Pro Hyp Gly Glu Arg 15

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 多肽III

<400> 3

Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala Arg 9