本發(fā)明涉及藠頭有機(jī)物測定的
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種藠頭中游離氨基酸的測定方法。
背景技術(shù)：
：藠頭為百合科蔥屬植物，又名薤白，主要分布于我國南方各省。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為藠頭中有溫中通陽，理氣寬胸，還陽散結(jié)之功效,藠頭的鱗莖既可入藥又可食用。藠頭中含有大量的氨基酸和人體所必需的多種元素，而且藠頭具有多種藥理作用，可以抑制血栓形成和動(dòng)脈粥樣硬化，并且具有抗氧化作用、平喘作用、鎮(zhèn)痛作用、和耐缺氧作用，特別是對于糖尿病、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等疾病都有很好的效果。大多數(shù)人只知道藠頭做成食品食用有益于身體健康，卻不知道藠頭中是什么成分在起營養(yǎng)作用，鑒于氨基酸的營養(yǎng)價(jià)值性以及提升藠頭的附加價(jià)值，藠頭的研究勢在必行。對于藠頭中營養(yǎng)物質(zhì)的檢測及分析曾有一些文獻(xiàn)報(bào)道，中國專利CN103320449A公開了一種具有抗腫瘤活性藠頭凝集素基因及其編碼蛋白的應(yīng)用，根據(jù)其核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列，其編碼的藠頭凝集素蛋白具有抗腫瘤活性，但其對氨基酸測定方法等方面未做研究，目前也沒有公開關(guān)于藠頭中游離氨基酸含量的測定分析方法，因此如今對氨基酸組成的進(jìn)一步研究以及資源的開發(fā)與利用還缺乏理論依據(jù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一種準(zhǔn)確、靈敏、快速、重復(fù)性和穩(wěn)定性好的一種藠頭中游離氨基酸的測定方法，從而為氨基酸組成的進(jìn)一步研究以及資源的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種藠頭中游離氨基酸的測定方法，包括以下步驟：1）、溶液的配制配制茚三酮溶液、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和醋酸-醋酸鈉緩沖液，備用，2）、樣品處理稱取1g藠頭粉，放入50mL的燒杯內(nèi)，同時(shí)加入蒸餾水溶解，待溶解完全后將其全部移入50mL的容量瓶內(nèi)，加入蒸餾水定容并搖勻，備用，3）、測量波長取標(biāo)準(zhǔn)溶液、蒸餾水于25mL的具塞試管中，加入1mL~3mL的茚三酮溶液和PH為5~8的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液，水浴加熱15~25分鐘，取出放入冷水浴中立即冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25mL，進(jìn)行波長掃描。所述的藠頭中游離氨基酸的測定方法，其中，所述茚三酮溶液濃度為0.02~0.05mg/mL、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.1~0.3mg/mL、醋酸-醋酸鈉緩沖液的PH為4~9。所述的藠頭中游離氨基酸的測定方法，其中，所述加入1mL~3mL的茚三酮溶液濃度為1%~3%。所述的藠頭中游離氨基酸的測定方法，其中，所述水浴加熱的溫度設(shè)定為100~120℃。所述的藠頭中游離氨基酸的測定方法，其中，所述冷卻時(shí)間為8~15分鐘。所述的藠頭中游離氨基酸的測定方法，其中，所述波長掃描的范圍為380-780nm。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，一般采用茚三酮比色法測定藠頭中總氨基酸的含量，由于溶液的PH值、顯色劑的用量、加熱時(shí)間和冷卻時(shí)間的不一樣，最終得到的結(jié)果存在較大差異，導(dǎo)致測定不準(zhǔn)確、不靈敏且重復(fù)性和穩(wěn)定性都不好，繼而發(fā)明人針對如何使此顯色方法準(zhǔn)確、靈敏、快速、重復(fù)性和穩(wěn)定性好這一問題進(jìn)行了研究，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)明進(jìn)一步確定了茚三酮的最適顯色條件、溶液的最適PH值、顯色劑的最適用量、溶液的最適加熱時(shí)間、溶液的最適冷卻時(shí)間并且繪制谷氨酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終得到了最合適測定條件為：溶液的PH值pH=5.0，取2%茚三酮顯色劑2.0mL，沸水浴準(zhǔn)確加熱20min，冷水冷卻12min后于570nm處測定其吸光度。實(shí)驗(yàn)證明此顯色方法準(zhǔn)確、靈敏、快速、重復(fù)性和穩(wěn)定性好。有益效果：本發(fā)明所提供的一種藠頭中游離氨基酸的測定方法，通過簡單高效的分析方法以及確定最佳的反應(yīng)條件，使實(shí)驗(yàn)分析準(zhǔn)確、靈敏、快速、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，從而為氨基酸組成的進(jìn)一步研究以及資源的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。附圖說明圖1是溶液的PH值與吸光度的關(guān)系圖。圖2是茚三酮用量與吸光度的關(guān)系圖。圖3是溶液加熱時(shí)間與吸光度的關(guān)系圖。圖4是溶液冷卻時(shí)間與吸光度的關(guān)系圖。圖5是谷氨酸溶液與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種藠頭中游離氨基酸的測定方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。確定茚三酮的最合適顯色條件茚三酮是一個(gè)有機(jī)化合物，氨基酸與茚三酮水合物在弱酸的條件下共同加熱時(shí)，氨基酸被氧化而脫氨、脫羧，且茚三酮水合物被還原，其還原物與氨基酸加熱分解產(chǎn)生的氨結(jié)合，再與另一分子茚三酮縮合成為藍(lán)紫色化合物，稱為羅曼紫（Ruhemann'spurple）。反應(yīng)式如下：確定溶液的最合適PH值：參加圖1，每次精確移取5.0mL0.1mg/mL谷氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液于6支相同的具塞試管中，再依次分別加入2.OmLpH為4，5,6,7,8，9的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和2.0mL的茚三酮試劑，沸水浴加熱20min后，用冷卻蒸餾水定容至50mL，在570nm處測定不同PH值條件下的吸光度。分析圖1可得，在緩沖溶液的PH值不斷增加的情況下，谷氨酸溶液的吸光度出現(xiàn)先上升后下降最終趨于平穩(wěn)的趨勢。在pH為5處谷氨酸溶液達(dá)到最大吸光度，此時(shí)谷氨酸溶液呈藍(lán)色。由此可得谷氨酸與茚三酮的顯色反應(yīng)適合在弱酸的條件下進(jìn)行，這也與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合。此時(shí)的產(chǎn)品才呈現(xiàn)出鮮味。低于這個(gè)pH值，產(chǎn)品偏重于酸味;高于這個(gè)pH值，產(chǎn)品會呈現(xiàn)一定的咸味和甜味。確定顯色劑的最合適用量：參見圖2，每次精確移取5.0mL0.1mg/mL的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于5支相同的具塞試管中，后加入2.0mLPH為5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液，再依次分別加1.6,1.8,2.0,2.2,2.4mL茚三酮試劑，沸水浴加熱20min后，用冷卻蒸餾水定容至50mL，在570nm處測定不同顯色劑用量的吸光度。分析圖2可得，在茚三酮顯色試劑的用量不斷增加的情況下，谷氨酸溶液的吸光度出現(xiàn)先上升后逐漸趨于平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)顯色劑用量為2.0mL時(shí)，谷氨酸溶液的吸光度達(dá)到最大值，此后再繼續(xù)增加茚三酮試劑的用量，谷氨酸溶液的吸光度的變化不明顯，由此可確定2.0mL為顯色劑最合適的用量。確定溶液的最合適加熱時(shí)間：參加圖3，每次精確移取5.0mL0.1mg/mL的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于5支相同的具塞試管中，再加人2.OmLpH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和2.0mL茚三酮試劑，放置于沸水浴中分別加熱16,18,20,22,24min后，用冷卻蒸餾水定容至50mL，在570nm處測定不同加熱時(shí)間顯色體系的吸光度。分析圖3可得，在水浴時(shí)間不斷增加的條件下，谷氨酸溶液的吸光度出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)水浴時(shí)間為20min時(shí)，谷氨酸溶液的吸光度達(dá)到最大值。在水浴20min之前，谷氨酸溶液的顏色顯紫色，且色澤比較暗淡；22min以后，谷氨酸溶液顏色漸漸加深，出現(xiàn)略透明紫色;水浴20min時(shí)，溶液顯亮紫色。當(dāng)水浴時(shí)間超過20min后溶液的透明度出現(xiàn)下降的趨勢;在水浴時(shí)間超過22min后肉眼可見具塞試管內(nèi)有微小的絮狀物沉淀，其產(chǎn)生的原因可能是由于水浴時(shí)間的增加使谷氨酸溶液的顏色漸漸加深，后用冷卻蒸餾水后具塞事管中的溶液因?yàn)闇囟鹊慕档投a(chǎn)生細(xì)微的沉淀顆粒。因此此次試驗(yàn)選用20min為最合適的水浴時(shí)間。確定最合適的冷卻時(shí)間：參見圖4，每次精確移取5.0mL0.1mg/mL的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于5支相同的具塞試管中，再加入2.OmLpH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和2.0mL茚三酮試劑，放置于冷水中分別冷卻6,8,10,12,14min后在570nm處測定不同冷卻時(shí)間顯色體系的吸光度。分析圖4可得，在冷卻時(shí)間不斷增加的情況下，谷氨酸溶液的吸光度出現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)冷卻時(shí)間為12min時(shí)溶液的吸光度值達(dá)到最大值。因此此次實(shí)驗(yàn)選用12min為最合適的冷卻時(shí)間。繪制谷氨酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，分別精密吸取0.1mL/mg谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10mL于7支具塞試管中，分別加入2.0mLPH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和2.0mL茚三酮試劑，沸水浴準(zhǔn)確加熱20min后，冷卻12min，用冷卻蒸餾水定容至25mL后在570nm處測其吸光度，然后以谷氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，回歸線方程為：Y=8.385x-0.01,相關(guān)系數(shù)為R2=0.99989（R2為吸光度）。精密度檢測精確移取0.1mg/mL谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成低、中、高濃度的溶液(分別為0.01,0.05,0.1mg/mL），重復(fù)測定其吸光度5次，結(jié)果如下表：谷氨酸濃度(mg/ml)吸光度值(平均)RSD%0.010.0660.450.050.400.400.10.820.49穩(wěn)定性檢測把上述反應(yīng)完全的3種濃度的樣品溶液在570nm處分別測其吸光度，每隔3min測一次，且連續(xù)測定4次到12min。吸光度結(jié)果如下表：Glu濃度（mg/mL)0min3min6min9min12min均值RSD%0.010.0660.0660.0650.0640.0630.0641.50.050.400.400.400.390.380.391.80.10.820.820.810.800.780.801.6從上表可以看出，三種濃度的樣品溶液的吸光度在6min內(nèi)平均下降0.2%，非常穩(wěn)定，但在12min內(nèi)溶液的吸光度平均下降了3%，因此測定時(shí)應(yīng)在6min內(nèi)完成。樣品測定平行準(zhǔn)確稱取藠頭粉1.001g四份，按照2.3.2對樣品進(jìn)行處理制備待測溶液，上述溶液按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作進(jìn)行顯色反應(yīng)，且在570nm處測定顯色待測溶液的吸光度，吸光度結(jié)果見下表：編號1234均值RSD%總氨基酸mg/mL2.52.52.62.52.51.5從上表可以看出，藠頭粉中總氨基酸含量的平均值為2.5mg，RSD=1.5%，表明此方法的重現(xiàn)性優(yōu)良。以下通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1本實(shí)施例提供一種藠頭中游離氨基酸的測定方法，包括以下步驟：1）、溶液的配制準(zhǔn)確稱取茚三酮1.0g放入25mL的燒杯內(nèi)，加入適量的蒸餾水直至完全溶解，然后轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，加入蒸餾水，待液面離刻度線1-2cm時(shí)改用膠頭滴管滴加，定容，搖勻，低溫保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁猓河捎谲崛芤盒再|(zhì)不穩(wěn)定，遇光容易分解，故需要現(xiàn)配現(xiàn)用）；精確稱取谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.02g置于50mL燒杯內(nèi)，加入蒸餾水溶解，然后將其全部轉(zhuǎn)移到200mL的容量瓶中，加入蒸餾水至刻度并且搖勻，備用；取41mL醋酸和59mL醋酸鈉混合制得PH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖液，備用。2）、樣品處理稱取1g藠頭粉，放入50mL的燒杯內(nèi)，同時(shí)加入蒸餾水溶解，待溶解完全后將其全部移入50mL的容量瓶內(nèi)，加入蒸餾水定容并搖勻，備用。3）、測量波長的確定分別各取標(biāo)準(zhǔn)溶液、蒸餾水2mL于三個(gè)25mL的具塞試管中，分別各加入2mL的1%的茚三酮溶液和PH為5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液，水浴加熱的溫度設(shè)定為100℃，加熱20分鐘后，取出放入冷水浴中立即冷卻12分鐘，用蒸餾水定容至25mL，在570nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描。本實(shí)施例為最優(yōu)方案，通過簡單高效的分析方法從而確定最佳的反應(yīng)條件，使實(shí)驗(yàn)分析準(zhǔn)確、靈敏、快速、重復(fù)性和穩(wěn)定性好。實(shí)施例2本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)施例1相同，達(dá)到的效果也基本相同，不同的是，在測量波長中，包括以下步驟：分別各取標(biāo)準(zhǔn)溶液、蒸餾水2mL于三個(gè)25mL的具塞試管中，分別各加入1mL的2%的茚三酮溶液和PH為7的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液，水浴加熱的溫度設(shè)定為110℃，加熱15分鐘后，取出放入冷水浴中立即冷卻10分鐘，用蒸餾水定容至25mL，在570nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描。實(shí)施例3本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)施例1相同，達(dá)到的效果也基本相同，不同的是，在測量波長中，包括以下步驟：分別各取標(biāo)準(zhǔn)溶液、蒸餾水2mL于三個(gè)25mL的具塞試管中，分別各加入2mL的3%的茚三酮溶液和PH為6的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液，水浴加熱的溫度設(shè)定為105℃，加熱18分鐘后，取出放入冷水浴中立即冷卻15分鐘，用蒸餾水定容至25mL，在570nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描。應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3