本發(fā)明涉及一種磺胺類(lèi)抗生素殘留檢測(cè)方法，尤其是涉及一種快速測(cè)定磺胺類(lèi)抗生素殘留的仿生酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

由于養(yǎng)殖規(guī)模、養(yǎng)殖密度和養(yǎng)殖環(huán)境等的惡化，養(yǎng)殖過(guò)程中病害頻發(fā)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重危害?；前奉?lèi)抗生素（Sulfonamides，SAs）是一類(lèi)廣譜抗菌藥，主要用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病，或者作為飼料添加劑在動(dòng)物生產(chǎn)中長(zhǎng)期應(yīng)用。但是，不合理使用易造成耐藥性增加，在食品中殘留的藥物對(duì)人類(lèi)健康造成潛在的危害，如誘發(fā)癌癥等。因此，其在環(huán)境及食品中的殘留問(wèn)題引起了國(guó)內(nèi)外的高度重視。因此，為保護(hù)食品安全和人類(lèi)健康，必須加強(qiáng)對(duì)磺胺類(lèi)抗生素的檢測(cè)，尤其是快速檢測(cè)技術(shù)。

目前，磺胺類(lèi)抗生素殘留的檢測(cè)方法主要有微生物學(xué)法、儀器分析方法和免疫法等。其中，微生物學(xué)方法雖然具有簡(jiǎn)單、費(fèi)用低等特點(diǎn)，但是存在操作費(fèi)時(shí)、敏感性和特異性都較差等問(wèn)題，不能滿(mǎn)足現(xiàn)在殘留檢測(cè)的需要。儀器分析方法主要有氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）及液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）等，這些方法具有準(zhǔn)確、特異性好、可同時(shí)測(cè)定多種藥物等優(yōu)點(diǎn)，但是通常需要復(fù)雜、昂貴的儀器設(shè)備、操作復(fù)雜，限制了其廣泛應(yīng)用，且不適合現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模篩選檢測(cè)。常規(guī)酶聯(lián)免疫（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）方法，具有靈敏度高、特異性高、操作簡(jiǎn)便、適用于大批量樣品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，受到了高度重視，但是現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫主要是基于生物抗體和顯色反應(yīng)，其中，生物抗體具有制備繁瑣、周期長(zhǎng)、穩(wěn)定性差以及顯色反應(yīng)靈敏度低等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、合成簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好和檢測(cè)時(shí)間短的快速測(cè)定磺胺類(lèi)抗生素殘留的仿生酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：一種快速測(cè)定磺胺類(lèi)抗生素殘留的仿生酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，包括以下步驟：

（1）分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體的制備

將7.5 mL環(huán)己烷和1.8 mL Triton X-100加入兩口燒瓶中，于150 rpm磁力攪拌15 min，然后依次加入400 μL濃度為2.5 nmol/mL的量子點(diǎn)溶液、50 μL正硅酸乙酯（TEOS）和100 μL氨水，磁力攪拌2 h；然后加入200 μL 濃度為1.0-5.0 mg/mL的模板分子溶液以及20-25 μL的功能單體，室溫下聚合反應(yīng)12 h后；再加入10 mL丙酮，渦旋1 min，然后于9000 rpm離心10 min，棄掉上清液后，再加入6 mL雙蒸水，充分分散后，于9000 rpm離心10 min，最后用10.0 mL由體積比為8：2 的乙醇和已腈組成的混合液洗脫2 h以除去磺胺類(lèi)抗生素，再分散于1.0 mL乙醇磷酸鹽溶液中，得到分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體溶液，其中乙醇磷酸鹽溶液中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50-80%；

（2）待測(cè)樣品檢測(cè)

A.用乙醇將酶標(biāo)孔潤(rùn)洗3次，然后在每個(gè)酶標(biāo)孔中依次加入50 μL 分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體溶液和150 μL樣品提取液；并設(shè)置空白對(duì)照酶標(biāo)孔組，空白對(duì)照酶標(biāo)孔組每孔加入150μL pH為8-10的磷酸鹽緩沖液；

B．將酶標(biāo)板室溫育10 min，然后用酶標(biāo)儀（Tecan, Switzerland）讀出發(fā)射波長(zhǎng)在605nm下的數(shù)值，根據(jù)熒光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品提取液中磺胺類(lèi)抗生素含量。

步驟（1）中所述的模板分子為磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑或者磺胺二甲氧嘧啶；功能單體為氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）或者甲基丙烯酸（MAA）。

步驟（1）中所述的量子點(diǎn)是CdS/ZnS。

步驟（1）中所述的分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體的粒徑為40-50 nm。

步驟（2）中所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，（F₀/F-1）為縱坐標(biāo)，其中F₀為空白對(duì)照孔的平均熒光值，F(xiàn)為磺胺標(biāo)準(zhǔn)液或樣品提取液的平均熒光值。

步驟（2）中所述的樣品提取液制備方法如下：準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)樣品2.0 g，于18000 rpm勻漿，然后加入2.0 mL乙腈，渦旋震蕩10 min，超聲15min，5000 rpm離心5min；然后取上清液至離心管中，加入3 mL乙腈飽和正己烷；手動(dòng)震蕩15~20s，于5000 rpm離心5 min，取下層液體用0.22 μm濾膜過(guò)濾得到樣品提取液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明一種快速測(cè)定磺胺類(lèi)抗生素殘留的仿生酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其采用的分子印跡人工抗體（Molecularly imprinted polymers，MIPs）與常規(guī)生物抗體相比，具有特異性高、合成簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、可長(zhǎng)期保存等優(yōu)點(diǎn)。量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs）具有較好的穩(wěn)定性、寬的激發(fā)光譜和窄的發(fā)射譜、熒光壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因此，將量子點(diǎn)和分子印跡人工抗體相結(jié)合，獲得對(duì)磺胺類(lèi)抗生素具有特異熒光響應(yīng)的分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)材料（MIP-QDs），并基于酶聯(lián)免疫技術(shù)原理，建立基于MIP-QDs的磺胺類(lèi)抗生素仿生酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，優(yōu)點(diǎn)如下：

1）本發(fā)明獲得的磺胺類(lèi)抗生素分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體具有較高的選擇性和熒光響應(yīng)性能，可以代替生物抗體和顯色劑應(yīng)用于酶聯(lián)免疫技術(shù)。同時(shí)該人工抗體由表面接枝反應(yīng)制備，具有較高的穩(wěn)定性和較好的熒光性能，克服了傳統(tǒng)生物抗體制備周期長(zhǎng)、易失活和常規(guī)顯色劑靈敏度低等缺點(diǎn)。

2）本發(fā)明制備的分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體，具有較好的熒光響應(yīng)性能，將對(duì)分析物的特異識(shí)別和信號(hào)響應(yīng)相結(jié)合，靈敏度高，同時(shí)，成本大大降低，且顯著降低了分析所需時(shí)間，僅需約0.5 h（常規(guī)酶聯(lián)免疫時(shí)間為1-2 h），適用于快速檢測(cè)磺胺類(lèi)抗生素殘留。

3）本發(fā)明將獲得的磺胺類(lèi)抗生素分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體與酶聯(lián)免疫技術(shù)聯(lián)用，建立對(duì)磺胺類(lèi)抗生素具有高靈敏度的仿生酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。該方法對(duì)水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)抗生素的最低檢測(cè)限為0.004 μg/kg，能夠滿(mǎn)足檢測(cè)需要。

附圖說(shuō)明

圖1為磺胺類(lèi)抗生素分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體MIP-QDs的掃描電鏡圖；

圖2為磺胺類(lèi)抗生素分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體MIP-QDs的透射電鏡圖；

圖3為 MIP-QDs和NIP-QDs對(duì)SDZ及其類(lèi)似物SM、SMZ、SMX、SDM、SME特異性，其中NIP-QDs為不加模板的空白對(duì)照分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工個(gè)抗體；

圖4為磺胺類(lèi)抗生素ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

一、具體實(shí)施例

本發(fā)明是將磺胺類(lèi)抗生素分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體作為仿生抗體和信號(hào)響應(yīng)物質(zhì)，基于酶聯(lián)免疫技術(shù)原理，建立對(duì)磺胺類(lèi)抗生素具有高靈敏度度和選擇性的快速檢測(cè)方法，具體過(guò)程如下：

1、分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體的制備

將7.5 mL環(huán)己烷和1.8 mL Triton X-100加入兩口燒瓶中，150 rpm磁力攪拌15 min，然后依次加入400 μL濃度為2.5 nmol/mL的量子點(diǎn)溶液（量子點(diǎn)是CdS/ZnS）、50 μL正硅酸乙酯（TEOS）和100 μL氨水，磁力攪拌2 h；然后加入200 μL 濃度為1.0-5.0 mg/mL的模板分子溶液以及20-25 μL的功能單體，室溫下聚合反應(yīng)12 h后；再加入10 mL丙酮，渦旋1 min，然后于9000 rpm離心10 min，棄掉上清液后，再加入6 mL雙蒸水，充分分散后，于9000 rpm離心10 min，最后用10.0 mL由體積比為8：2 的乙醇和已腈組成的混合液洗脫2 h以除去磺胺類(lèi)抗生素，再分散于1.0 mL乙醇磷酸鹽溶液中，得到分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體溶液，其中乙醇磷酸鹽溶液中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50-80%；同時(shí)，制備空白印跡聚合物（NIP），除不加模板分子外，其制備過(guò)程同上述MIP-QDs制備方法。

圖1為分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體MIP-QDs的掃描電鏡，圖2為分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體MIP-QDs的透射電鏡圖，由圖1、2表明獲得的MIP-QDs高度分散，大小均一，粒徑約150 nm。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1）用乙醇將酶標(biāo)孔潤(rùn)洗3次，然后在每個(gè)酶標(biāo)孔中加入50 μL 分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體溶液作為仿生抗體和熒光標(biāo)記；第1行酶標(biāo)孔設(shè)為空白對(duì)照，每孔加入150μL磷酸鹽緩沖液；第2-7行酶標(biāo)孔依次加入150 μL標(biāo)樣梯度稀釋液，標(biāo)樣梯度稀釋液為0.05、1.0、5.0、10.0、15.0 mg/L，采用乙醇磷酸鹽緩沖溶液作為稀釋液；

2）將上述酶標(biāo)板室溫育10 min，然后用酶標(biāo)儀（Tecan, Switzerland）讀出發(fā)射波長(zhǎng)在605nm下的數(shù)值；以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，（F₀/F-1）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中F₀為空白對(duì)照孔的平均熒光值，F(xiàn)為磺胺標(biāo)準(zhǔn)液平均熒光值；

3、待測(cè)樣品檢測(cè)

1）樣品提取液制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)樣品2.0 g，18000 rpm勻漿，然后加入2.0 mL乙腈，渦旋震蕩10 min，超聲15min，5000 rpm離心5min；然后取上清液至離心管中，加入3 mL乙腈飽和正己烷；手動(dòng)震蕩15~20s，5000 rpm離心5 min，取下層液體用0.22 μm濾膜過(guò)濾得到樣品提取液。

2）用乙醇將酶標(biāo)孔潤(rùn)洗3次，然后在每個(gè)酶標(biāo)孔中依次加入50 μL 分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體溶液和150 μL樣品提取液；并設(shè)置空白對(duì)照酶標(biāo)孔組，空白對(duì)照酶標(biāo)孔組每孔加入150μL pH為8-10的磷酸鹽緩沖液；

3）將酶標(biāo)板室溫育10 min，然后用酶標(biāo)儀（Tecan, Switzerland）讀出發(fā)射波長(zhǎng)在605nm下的數(shù)值，根據(jù)熒光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品提取液中磺胺類(lèi)抗生素含量。

二、特異性試驗(yàn)

對(duì)以磺胺嘧啶（SDZ）為模板分子合成的分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體，選擇磺胺甲嘧啶（SM）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ）、磺胺甲噁唑（SMX）和磺胺二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺對(duì)甲氧基嘧啶（SME）作為結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，對(duì)獲得的MIP-QDs的特異性進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3所示，MIP-QDs的Ksv值大于NIP-QDs的Ksv值，且MIP-QDs對(duì)SDZ的Ksv遠(yuǎn)高于其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，表明MIP-QDs具有較好的特異印跡效果。進(jìn)一步如圖3所示，MIP-QDs對(duì)SDZ具有最高的印跡效果，表明獲得的MIP-QDs對(duì)SDZ具有較好的特異性。

三、靈敏度試驗(yàn)

將獲得的分子印跡-量子點(diǎn)納米結(jié)構(gòu)人工抗體作為仿生抗體和熒光標(biāo)記，對(duì)建立的仿生酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法線性及靈敏度進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在0.005-15 mg/L濃度范圍內(nèi)，如圖4所示，磺胺類(lèi)抗生素?zé)晒忭憫?yīng)值與濃度之間具有較好的現(xiàn)行相關(guān)性，曲線標(biāo)準(zhǔn)方程：y=0.1435x-0.017，R2 = 0.9971；檢測(cè)限為0.79 μg/L。

上述說(shuō)明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。