本發(fā)明涉及一種中藥注射液質(zhì)量檢查方法，即苦碟子注射液指紋圖譜檢查方法。

背景技術(shù)：

在現(xiàn)有技術(shù)中，苦碟子注射液（曾用名：碟脈靈注射液）列入國家藥品標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品（國藥準(zhǔn)字Z20025450），由通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

處方：抱莖苦荬菜1000g，制成1000ml。

含量測定：本品每10ml含總黃酮以無水蘆?。–₂₇H₃₀O₁₆）計(jì)，不得少于4.0mg。含抱莖苦荬菜以腺苷（C₁₀H₁₂N₅O₄）計(jì)，不得少于0.025mg。

功能主治：活血止痛，清熱祛瘀。用于瘀血閉阻的胸痹，證見：胸悶、心痛，口苦，舌暗紅或存瘀斑等。適用于冠心病、心絞痛見上述病狀者。亦可用于腦梗塞者。

用法用量：靜脈滴注，一次10－40ml，一日1次；用5%葡萄糖或0.9%氯化鈉注射液稀釋至250－500ml后應(yīng)用；14天為一療程；或遵醫(yī)囑。

規(guī)格：每支裝（1）10ml，（2）20ml，（3）40ml。

中藥注射劑質(zhì)量的穩(wěn)定、可控是臨床用藥安全、有效的保證。中藥注射劑中化學(xué)成分具有復(fù)雜性和多樣性，僅通過單個(gè)或幾個(gè)化學(xué)成分的含量測定不能全面反映和控制中藥注射劑的質(zhì)量。這就需要建立一種合理有效的中藥注射劑質(zhì)量控制方法。目前，中藥指紋圖譜作為現(xiàn)代中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的核心技術(shù)已得到國際公認(rèn)，F(xiàn)DA、WHO、德國、印度和日本等國家均采用指紋圖譜技術(shù)作為植物藥的質(zhì)量控制手段。國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）在中藥注射劑安全性再評價(jià)指導(dǎo)原則中已明確要求中藥注射劑必須設(shè)立指紋圖譜檢查項(xiàng)。由于目前苦碟子注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚無規(guī)定指紋圖譜檢查項(xiàng)及檢查方法。因此，本發(fā)明可以為苦碟子注射液指紋圖譜檢查提供方法，彌補(bǔ)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述問題與需求，而建立一種苦碟子注射液指紋圖譜檢查方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：建立苦碟子注射液指紋圖譜檢查方法，其特征步驟如下：

1、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱：Waters Symmetry C18 4.6 mm×250 mm，5μm；以乙腈為流動(dòng)相A，0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0ml/min；檢測波長：260nm；柱溫為40℃。理論板數(shù)按木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2、參照物溶液的制備：

取腺苷對照品、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷對照品和菊苣酸對照品，精密稱定，加25%甲醇溶液制成每1mL含腺苷5μg、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷150μg和菊苣酸60μg的混合溶液，即得。

3、供試品溶液的制備：

取苦碟子注射液，用0.45 μm濾膜濾過，即得。

4、測定法：

精密吸取參照物溶液與供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，測定，記錄75分鐘內(nèi)的色譜峰，即得。

苦碟子注射液中所含有的主要有效成分為腺苷、有機(jī)酸和黃酮類等成分，根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)，選擇反相高效液相色譜法來進(jìn)行指紋圖譜分析。本發(fā)明采用的Waters Symmetry色譜柱得到的色譜峰峰形良好；流動(dòng)相系統(tǒng)對苦碟子注射液中的主要成分有良好的洗脫和分離能力；在260nm的檢測波長下，腺苷的響應(yīng)值大，同時(shí)還能較為全面地檢測到其他的主要成分。本發(fā)明建立的苦碟子注射液指紋圖譜分析方法靈敏度高，分離度和重現(xiàn)性好，基線噪音小。

本發(fā)明指紋圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)與腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三個(gè)對照品色譜峰保留時(shí)間一致的色譜峰，并應(yīng)出現(xiàn)10個(gè)共有峰，以1、2 (S)、3、4、5、6、7、8 (S)、9 (S)、10號峰為標(biāo)記，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算，與對照指紋圖譜相比較，相似度應(yīng)不低于0.85。

圖1中，峰2(S) 腺苷；峰3 尿苷；峰4鳥苷；峰5 單咖啡?；剖?；峰7 木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；峰8(S) 木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰9(S) 菊苣酸；峰10 芹菜素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：1、本實(shí)驗(yàn)建立了苦碟子注射液的HPLC色譜分析方法，并進(jìn)行了儀器精密度、方法重復(fù)性以及樣品穩(wěn)定性驗(yàn)證，符合指紋圖譜分析方法學(xué)要求。2、本實(shí)驗(yàn)最終建立了苦碟子注射液在Agilent、Waters和島津三臺(tái)儀器的對照指紋圖譜，各樣品的匹配相似度均大于0.85，所建立的對照指紋圖譜可以用于苦碟子注射液指紋圖譜分析檢驗(yàn)。3、本實(shí)驗(yàn)建立的苦碟子注射液對照指紋圖譜能快速準(zhǔn)確地指認(rèn)出10個(gè)特征峰，較為全面地對苦碟子注射液的質(zhì)量進(jìn)行控制。4、本實(shí)驗(yàn)最終建立了苦碟子注射液的HPLC指紋圖譜分析方法，靈敏度高，分離度好，色譜適用性比較強(qiáng)。5、本實(shí)驗(yàn)最終建立了重現(xiàn)性好的指紋圖譜檢測方法，較為全面地反映苦碟子注射液所含的主要化學(xué)成分，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1 苦碟子注射液對照指紋圖譜。

圖2 Agilent儀器10批注射液匹配色譜圖。

圖3 Agilent儀器樣品對照指紋圖譜。

圖4 Agilent儀器參照物色譜指紋圖譜。

圖5 Waters儀器10批注射液匹配色譜圖。

圖6 Waters儀器樣品對照指紋圖譜。

圖7 Waters儀器參照物色譜指紋圖譜。

圖8 島津儀器10批注射液匹配色譜圖。

圖9島津儀器對照指紋圖譜。

圖10島津儀器參照物色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所用苦碟子注射液、相關(guān)化學(xué)原料及試劑均有市售。

實(shí)施例1

1 儀器與材料

Agilent Technologies 1200 高效液相色譜系統(tǒng)（含四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，1260 DAD檢測器；美國Agilent公司）；Waters 2695高效液相液相色譜儀（含四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，2698DAD檢測器；美國Waters公司）；島津LC-20AT液相色譜儀（含二元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，LC-20AT PDA檢測器；日本島津公司）；M320型外接柱溫箱（Tianjin Puxiang）。

乙腈（Sigma公司，美國，色譜純）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；磷酸（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。腺苷、菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品購買于中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110879-200202和111752-200902，純度均大于98%；木犀草素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷由通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，純度大于98%?？嗟幼⑸湟?0批，批號分別為151108，151221，160101，160104，160106，160309，160310，160405，160411，160417。

方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

樣品溶液制備：各批次苦碟子注射液，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液進(jìn)樣。

參照物溶液制備：取腺苷對照品、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷對照品和菊苣酸對照品適量，精密稱定，加甲醇-水（25:75）制成每1mL含腺苷5μg，木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷150μg，菊苣酸60μg的混合溶液，即得。所配制的溶液4℃保存。

色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5μm），Part No. WAT054275，Lot No.0294353071；檢測波長260nm；流動(dòng)相：0.2%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，洗脫梯度如表1所示，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量5μL；柱溫40℃。

方法學(xué)考察

2.3.1 Agilent儀器方法學(xué)驗(yàn)證

1) 精密度

取“2.2項(xiàng)”下制備的供試品溶液，按照“2.3項(xiàng)”下所示的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，各特征峰的峰面積RSD結(jié)果見表2。

試驗(yàn)結(jié)果表明，RSD＜3%，精密度良好。

重復(fù)性

按“2.2項(xiàng)”下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.3項(xiàng)”下所示的色譜條件進(jìn)樣分析，各特征峰的峰面積RSD結(jié)果見表3。

試驗(yàn)結(jié)果表明，RSD＜3%，方法重復(fù)性良好。

樣品穩(wěn)定性

取“2.2項(xiàng)”下制備的供試品溶液，按照“2.3項(xiàng)”下所示的色譜條件在樣品制備后0h，2h，4h，8h，12h，24h，進(jìn)樣分析，各特征峰的峰面積RSD結(jié)果見表4。

試驗(yàn)結(jié)果表明：RSD均小于3%，樣品放置24小時(shí)穩(wěn)定。

儀器方法學(xué)驗(yàn)證

1) 精密度

取“2.2項(xiàng)”下制備的供試品溶液，按照“2.3項(xiàng)”下所示的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，各特征峰的峰面積RSD結(jié)果見表5。

試驗(yàn)結(jié)果表明，RSD＜3%，精密度良好。

重復(fù)性

按“2.2項(xiàng)”下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.3項(xiàng)”下所示的色譜條件進(jìn)樣分析，各特征峰的峰面積RSD結(jié)果見表6。

試驗(yàn)結(jié)果表明，RSD＜3%，方法重復(fù)性良好。

）樣品穩(wěn)定性

取“2.2項(xiàng)”下制備的供試品溶液，按照“2.3項(xiàng)”下所示的色譜條件在樣品制備后0h，2h，4h，8h，12h，24h，進(jìn)樣分析，各特征峰的峰面積RSD結(jié)果見表7。

試驗(yàn)結(jié)果表明：RSD均小于3%，樣品放置24小時(shí)穩(wěn)定。

島津儀器方法學(xué)考察

1) 精密度

取“2.2項(xiàng)”下制備的供試品溶液，按照“2.3項(xiàng)”下所示的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，各特征峰的峰面積RSD結(jié)果見表8。

試驗(yàn)結(jié)果表明，RSD＜3%，精密度良好。

重復(fù)性

按“2.2項(xiàng)”下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.3項(xiàng)”下所示的色譜條件進(jìn)樣分析，各特征峰的峰面積RSD結(jié)果見表9。

試驗(yàn)結(jié)果表明，RSD＜3%，方法重復(fù)性良好。

）樣品穩(wěn)定性

取“2.2項(xiàng)”下制備的供試品溶液，按照“2.3項(xiàng)”下所示的色譜條件在樣品制備后0h，2h，4h，8h，12h，24h，進(jìn)樣分析，各特征峰的峰面積RSD結(jié)果見表10。

試驗(yàn)結(jié)果表明：RSD均小于3%，樣品放置24小時(shí)穩(wěn)定。

分析及數(shù)據(jù)導(dǎo)出

將“2.1項(xiàng)”下所示的10批注射液分別按照“2.3項(xiàng)”下色譜方法用如“2.1項(xiàng)”下所示的Agilent、Waters和島津三臺(tái)液相色譜儀分析檢驗(yàn)，通過儀器自帶工作站處理并導(dǎo)出AIA格式色譜數(shù)據(jù)，三臺(tái)儀器的積分參數(shù)設(shè)置為如下：Agilent：Slope Sensitivity（斜率靈敏度）5，Peak Width（峰寬）0.05，Area Reject（最小峰面積）1，Height Reject（最小峰高）1。Waters：閾值50，峰寬30，最小峰面積1000，最小峰高0。島津：斜率2000，半峰寬5，最小峰面積/峰高 1000。

對照指紋圖譜建立

打開中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件（2.0版，國家藥典委員會(huì)，2010），工作模式選擇生成對照，分別導(dǎo)入三臺(tái)儀器所分析的原始數(shù)據(jù)；參照圖譜參數(shù)設(shè)置分別為：參照圖譜編號為S1，對照圖譜生成方法為平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度默認(rèn)為0.1；在多點(diǎn)校正模塊下選擇10個(gè)共有特征峰；峰匹配方式選擇Mark峰匹配；匹配完成后點(diǎn)擊生成對照，即可得到對照指紋圖譜，將所得的對照圖譜保存，以備分析檢驗(yàn)時(shí)使用。點(diǎn)擊匹配數(shù)據(jù)和計(jì)算相似度按鈕，查看并保存匹配結(jié)果?？嗟幼⑸湟簩φ罩讣y圖譜如圖1所示。

儀器

按照“2.5項(xiàng)”下的方法建立對照指紋圖譜。10批注射液匹配色譜圖，對照指紋圖譜如圖2所示，圖 2： 峰2（S）腺苷；峰3 尿苷；峰4鳥苷；峰5 單咖啡?；剖幔环? 木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；峰8（S）木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰9（S）菊苣酸；峰10 芹菜素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷。各批次注射液與對照指紋圖譜的相似度見表11。參照物色譜圖如圖3所示。

圖3中：峰2（S）腺苷；峰3 尿苷；峰4鳥苷；峰5 單咖啡?；剖?；峰7 木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；峰8（S）木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰9（S）菊苣酸；峰10 芹菜素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷。

可見經(jīng)Agilent儀器分析的各批次注射液指紋圖譜中均出現(xiàn)了與腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三個(gè)參照色譜峰保留時(shí)間一致的色譜峰，并出現(xiàn)了10個(gè)共有峰，以1、2(S)、3、4、5、6、7、8(S)、9(S)、10號峰為標(biāo)記，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算，與對照指紋圖譜相比較，相似度均大于0.85。

儀器

按照“2.5項(xiàng)”下的方法建立對照指紋圖譜。10批注射液匹配色譜圖，對照指紋圖譜如圖4所示， 圖 4 ：峰2（S）腺苷；峰3 尿苷；峰4鳥苷；峰5 單咖啡?；剖幔环? 木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；峰8（S）木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰9（S）菊苣酸；峰10 芹菜素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷。各批次注射液與對照指紋圖譜的相似度見表12。參照物色譜圖如圖5所示。

可見經(jīng)Waters儀器分析的各批次注射液指紋圖譜中均出現(xiàn)了與腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三個(gè)參照色譜峰保留時(shí)間一致的色譜峰，并出現(xiàn)了10個(gè)共有峰，以1、2(S)、3、4、5、6、7、8(S)、9(S)、10號峰為標(biāo)記，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算，與對照指紋圖譜相比較，相似度均大于0.85。

島津儀器

按照“2.5項(xiàng)”下的方法建立對照指紋圖譜。10批注射液匹配色譜圖如圖8所示，對照指紋圖譜如圖9所示，各批次注射液與對照指紋圖譜的相似度見表13，參照物色譜圖見圖10。圖 9：峰2（S）腺苷；峰3 尿苷；峰4鳥苷；峰5 單咖啡?；剖幔环? 木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；峰8（S）木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰9（S）菊苣酸；峰10 芹菜素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷。

可見經(jīng)島津儀器分析的各批次注射液指紋圖譜中均出現(xiàn)了與腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三個(gè)參照色譜峰保留時(shí)間一致的色譜峰，并出現(xiàn)了10個(gè)共有峰，以1、2(S)、3、4、5、6、7、8(S)、9(S)、10號峰為標(biāo)記，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算，與對照指紋圖譜相比較，相似度均大于0.85。

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了苦碟子注射液的HPLC色譜分析方法，并進(jìn)行了儀器精密度、方法重復(fù)性以及樣品穩(wěn)定性驗(yàn)證，符合指紋圖譜分析方法學(xué)要求。本實(shí)驗(yàn)最終建立了苦碟子注射液在Agilent、Waters和島津三臺(tái)儀器的對照指紋圖譜，各樣品的匹配相似度均大于0.85，所建立的對照指紋圖譜可以用于苦碟子注射液指紋圖譜分析檢驗(yàn)。

上面描述，只是本發(fā)明的具體實(shí)施方式，各種舉例說明不對本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容構(gòu)成限制。